RNAi技術(shù)專輯之五7

1、RNAi技術(shù)專輯之五在植物、昆蟲、原生動(dòng)物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了自然存在的 RNAi現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)目的基因序列的 雙鏈RNAM以誘導(dǎo)產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。要制備較長(zhǎng)的 dsRNA最簡(jiǎn)單的方法就是 體外轉(zhuǎn)錄合成雙向的RNA如果研究對(duì)象不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，那要開(kāi)展RNAi的實(shí)驗(yàn)就要簡(jiǎn)單很多。因?yàn)榭梢圆捎幂^長(zhǎng)的雙鏈 RNAW導(dǎo)RNAi現(xiàn)象，而無(wú)需制備 特定的siRNA。在這里生物通將介紹幾個(gè)制備長(zhǎng)鏈 dsRNA勺試劑盒。（值得注意的是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，大于29nt的雙鏈RNA引發(fā)的是非特異基因沉默，21nt 大小的雙鏈RNA,也就是我們前面所說(shuō)的siRNA能有效引發(fā)特異的基因沉默。由于體外轉(zhuǎn)錄很難合成25nt以

2、下的短鏈RNA ,生物通在前面為大家介紹了一些利用試劑盒或者質(zhì)粒合成siRNA的產(chǎn)品。參考相關(guān)文章）MEGAscript? RNAi Kit合成大量純凈的雙鏈RNAI RNAi實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。這個(gè)基于專利的轉(zhuǎn)錄 高產(chǎn)技術(shù)的產(chǎn)品正是為大量合成用于 RNAi實(shí)驗(yàn)的dsRNAffi優(yōu)化的。試劑盒要求 用兩端帶有T7啟動(dòng)子序列的目的基因作為模板（200nt以上，模板可以是質(zhì)粒 載體上的，也可以是用帶有T7序列的引物擴(kuò)增的PCFT物，另外也可以選用一 個(gè)叫Lig' n Scribe Kit可以將T7 Prometor序列直接連接到 DNAt斷的兩端）, 將模板和試劑盒提供的dNTP酶等混合，根據(jù)

3、模板的長(zhǎng)短進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 每次反應(yīng)可以合成50ug100ug甚至更多的dsRNA（800nt以上的需要先加熱變性 并褪火形成雙鏈），產(chǎn)量是常規(guī)的1050倍，整個(gè)試劑盒總產(chǎn)量可達(dá)2mg （20 次反應(yīng)，每次100ug）。合成的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)DNaseI消化去除DNA®板，再經(jīng)過(guò)特 殊的單鏈RNase （試劑盒里提供，后文介紹）除去單鏈的 RNA最后經(jīng)過(guò)柱純化 就得到純的雙鏈RNA即可用于RNAi實(shí)驗(yàn)。由于這個(gè)試劑盒提供全套產(chǎn)品，使 用相當(dāng)方便。50Silencing of Drosophila hrp48 and U2AF Protein by dsRNA.A. Specific Red

4、uction of ExpressionLevels. 1 x 10 6 Schneider' s Drosophila analysis was also performed with the anti-U2AF 50 (bottom panel) and Pab 1 (data not shown) antibodies as negative controls.rM dsRNA 仃 3 labeledUlAP5aPab ID I 5 師 出trptt根的必.Nhrp4&UlAFSflmelanogaster L2 cells were grown in 6-well pl

5、ates in serum-free medium and treated with 10 nM of dsRNA specific for either hrp48 or U2AF 50 dsRNA were prepared with the MEGAscript RNAi Kit and post-transcriptionally labeled with Cy3using the Silencer siRNA Labeling Kit when indicated (+). Cells were harvested 72 hours post treatment and the si

6、lencingeffect was analyzed by Western blot with anti-hrp48 (48 kDa, migrates as a doublet) and anti-U2AF 50 (50 kDa) antibodies. An antibody directed against Pab 1 (lower panel) was used as a second negative control. B. Dose-sensitive Reduction of Protein Expression Levels.dsRNA-triggered silencing

7、of hrp48 was analyzed as in Figure 2a using the indicated concentrations of hrp48 dsRNA made with the MEGAscript RNAi Kit. WesternHiScribe? RNAi Transcription KitRNA干涉(RNAinterference) 是近年產(chǎn)生的研究轉(zhuǎn)錄后剪切的一種實(shí)驗(yàn) 方法。它將目的基因所對(duì)應(yīng)的雙鏈 RNA導(dǎo)入生物體，導(dǎo)致相應(yīng)的 mRN降解。和 反義技術(shù)不同的是，在基因表達(dá)恢復(fù)之前，RNAF涉現(xiàn)象將持續(xù)多個(gè)細(xì)胞分裂周 期，因而它是一種有力的研究基因功能的工具

8、。它不是傳統(tǒng)的在DNAK平基因敲除，而是通過(guò)RNAF涉，在RNAK平上去除目的RNA這樣大量基因功能可以 快速經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行檢測(cè)。HiScribe? RNAi Transcription Kit 也是一個(gè)體外合成雙鏈 RNA4彳亍 RNA 干涉實(shí)驗(yàn)的試劑盒。不同于前者的是，這個(gè)試劑盒提供質(zhì)粒作為載體，方便了以 后的擴(kuò)增和復(fù)制。LITMUS?載體多克隆位點(diǎn)兩端帶T7啟動(dòng)子。目的序列插入多 克隆位點(diǎn)，利用T7 RNA聚合酶同時(shí)轉(zhuǎn)錄DNA1板的雙鏈，合成雙鏈 RNA載體 啟動(dòng)子為T7野生型序列，是已知最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率的最大化。 帶有插入lacZ a片段供藍(lán)白篩選。該試劑盒也可合成單鏈RN

9、A在RN閣構(gòu)研究，核酶化學(xué)，體外翻譯， RNAS白相互作用，反義技術(shù)等方面有廣泛應(yīng)用。該試劑盒包含LITMUS雙向轉(zhuǎn)錄克隆載體，適用體外如顯微注射、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和體內(nèi)RNAF涉在內(nèi)的所有轉(zhuǎn)錄實(shí) 驗(yàn)。該試劑盒包括足夠的試劑可在 2ml的反應(yīng)體系中合成多至2mg的雙鏈 RNA 包括：LITMUS 28i 克隆載體，LITMUS 38i 克隆載體(LITMUS 28i 和 38i 二者只是多克隆位點(diǎn)有所不同)，對(duì)照載體，T7引物(19-mer),5' -dTAATACGACTCACTAT/3GG-10X 含 NTP的緩沖液，T7 RNA聚合酶，上樣緩 沖液和電泳 Marker 2-Log DNA

10、 Ladder (100 - 10,000 bp)等等。價(jià)格也相當(dāng)， 3750人民幣。但是可惜的是試劑盒沒(méi)有提供消化DNAf版和單鏈RNA勺酶以及純化的工具，需要另外購(gòu)置。單獨(dú)購(gòu)買的相關(guān)產(chǎn)品生物通將在后文繼續(xù)介紹。更多關(guān)于RNAi產(chǎn)品介紹請(qǐng)繼續(xù)關(guān)注生物通技術(shù)前沿專欄。Figure 1:用帶插入子的 LITMUS 28i合成雙鏈RNAFigure 2: 用 HiScribe RNAi Transcription Kit 體外合成單鏈和雙鏈 RNA。LITMUS 38i含1.3 kb熒光酶片段，分別用 PspOM I (P)和Stu I (S)剪切。產(chǎn)生的線形摸板再分別(P和S )或一起轉(zhuǎn)錄(P/

11、S),產(chǎn)生單鏈和雙鏈RNA。瓊脂 糖電泳1 U反應(yīng)液至少含0.5因RNA。在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA引發(fā)基因沉默RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通常用于阻斷特定基因的表達(dá)從而研究基因的功能，常見(jiàn)的做法是將靶向特定基因的大約 21堿基長(zhǎng)短的雙鏈siRNAs(small interfering RNAs),或者是 45 50-mer 的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA(small hairpin RNA, shRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。shRNAft細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成為siRNA,從而引發(fā)基因沉 默或者表達(dá)抑制?，F(xiàn)在有多個(gè)報(bào)道說(shuō)通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達(dá)。盡管細(xì)節(jié)各有不同，但載體大都是用PolIII啟動(dòng)子啟

12、動(dòng)編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列。選用PolIII啟動(dòng)子的原因在于這個(gè)啟動(dòng)子 總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成RNA遇到45個(gè)連續(xù)的U即終止，非常精確。當(dāng)這種帶有 PolIII啟動(dòng)子和shRNA®碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺 乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，抑制范圍包括外源基因和內(nèi)源基因。采用這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)siRNA表達(dá)質(zhì)粒的 選擇標(biāo)記，siRNA載體能夠更長(zhǎng)時(shí)間地抑制目的基因表達(dá)。當(dāng)然還有一點(diǎn)，那就 是由于質(zhì)?？梢詮?fù)制擴(kuò)增，相比起化學(xué)合成來(lái)說(shuō)，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。因?yàn)橘|(zhì)粒的價(jià)錢大約是 30

13、00多人民幣，還不到化學(xué)合成1條21nt的 RNA介格的一半，但是就可以自行制備 siRNA而不受數(shù)量的限制。生物通在這里 為大家介紹幾種不同的siRNA合成質(zhì)粒，但是大家要注意的是這里介紹的siRNA 質(zhì)粒是不同于體外轉(zhuǎn)錄合成 RNA勺質(zhì)粒(生物通在后文會(huì)繼續(xù)為大家介紹)，因 為這里制備的是用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的siRNA,而不是長(zhǎng)鏈的RNA(長(zhǎng)鏈的dsRNA適宜用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因?yàn)闀?huì)引發(fā)非特異抑制，參考RNAi一回顧)pSilencer siRNA表達(dá)載體系列是用于在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá) siRNA的一系列載體。在載體上包含有 RNAK和酶III (PolIII )啟動(dòng)子，氨 葦抗性

14、基因和大腸桿菌復(fù)制子，只要將編碼一小段對(duì)應(yīng)目的基因特異序列的、其RNAfg形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(就是回文結(jié)構(gòu))的 DNAff列插入載體中Pol III啟動(dòng)子的 下游，轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，載體就能表達(dá)出發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA這種RNA1快在細(xì)胞中加工成為siRNA。這些表達(dá)載體已經(jīng)成功的在Hela細(xì)胞中抑制了包括Cyclophilin 、 GAPDHp53、c-myc在內(nèi)的多個(gè)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明：能夠被化學(xué)合成或者體外合成的siRNAs抑制的基因同樣可以被表達(dá)相同序列的載體生成的siRNAs抑制。pSilence 1.0-U6載體pSilence 1.0-U6是采用小鼠U6 Pol III啟動(dòng)子。這個(gè)由哈佛大

15、 學(xué)開(kāi)發(fā)的載體已經(jīng)成功的在 Hela、H1299, U-2 OS和C-33A細(xì)胞中敲除了 cdk-2 和laminA/C的表達(dá)。這個(gè)載體經(jīng)過(guò) Apa I和EcoRI酶切線性化和純化，你只需 要合成一對(duì)55-mer的寡核甘酸，帶有4個(gè)堿基的突出（當(dāng)然是對(duì)應(yīng)ApaI和EcoR I酶切位點(diǎn)咯），一起退火、快速連接就可以轉(zhuǎn)化了。在購(gòu)買線性化的質(zhì)粒同時(shí)， 廠家還提供帶有GAPDHiRNA的環(huán)形質(zhì)粒對(duì)照（萬(wàn)一線性質(zhì)粒不夠用還可以自己 擴(kuò)增再切嘛?。﹑Silencer 2.0-U6 and pSilencer 3.0-H1這兩個(gè)載體帶有不同的RNAPol III啟動(dòng)子，pSilencer 2.0-U6帶的是

16、 人的U6啟動(dòng)子，pSilencer 3.0-H1則是用H1 RNAO動(dòng)子（RNaseP的一個(gè)組成 部分）。這兩個(gè)載體都是用BamH和Hind III線性化并且經(jīng)過(guò)純化的，方便定向克隆。這兩個(gè)載體都是以線性化的質(zhì)粒供應(yīng)，同時(shí)還提供GAPD時(shí)照和一個(gè)空白對(duì)照質(zhì)粒，以及DNA!火的Buffer。？pSilencer siRNA Expression Vectors; Maps and siRNA DesignFor each target gene two complementary 55-60 mer oligonucleotides must be prepared. The oligonuc

17、leotides should encode the 19 mer hairpin sequences specific to the mRNAtarget, a loop sequence separating the two complementary domains, and a polythymidine tract to terminate transcription by RNA Pol III. The insert design shown above is specific for the pSilencer 2.0-U6 and 3.0- H1 Expression Vec

18、tors and contains the overhanging 5' ends to facilitate efficient and directional cloning into these plasmids. The insert for pSilencer 1.0-U6 would contain the appropriate end sequences for cloning into theApaI and EcoR I sites. Early indications suggest that a great deal of latitude is availab

19、le in the design of the loop; here we provide our default loop sequence that we find works well.Freer 1.Q U6 GAPDHsf eCtAdpSEmrcr 1.a-U6 fiAPCMA.120-GAPDI-I Reductionion1?？赟O -60 -40 -15pSknccr LD-Ufr GArOHSAMPLhCELL *SIGNALCELL &JGNALREUVHVE EXPfiE$SlOMNo隔蘆4呻則307US3sHMJ«03S100p£rferbce<'I.QW GAFg24222M66+&O91815c.pSilencer -Induced Reductions in Target Gene ExpressionpSilencer 2.0-U6 and 3.0-H1 vectors encoding hairpin siRNAs specific to GAPDH, cyclophilin, or a non-genomic sequence were transfected into HeLa cells. Forty-eight