單細胞測序技術

1、單細胞測序技術：單細胞測序技術自2009年問世，2013年被Nature Methods 評為年度技術以來”越來越多地被應用在科研領域。2015 年以來 z 10X Genomics. Dropseq、Micro-well, Split-seq等技術的出現(xiàn)，徹底降低了單細胞測序的成本門檻。自此，單細胞測序技術被廣泛應用于基礎科硏和臨床研究。單細 胞在許多領域都占有一席之地，對于癌癥早期的診斷、追蹤以及個體 化治療具有重要意義。1為什么要做單細胞測序？初次聽說單細胞測序技術，單細胞測序又是什么噱頭？如果單細 胞測序就能測一個細胞或幾個細胞的話，這有什么意義？特別是對異 質(zhì)性高的腫瘤組織來講，測一

2、個細胞能代表什么?無論是蠕蟲,藍鯨，還是人類，自然界所有的多細胞生命都是從 單個細胞發(fā)育而來開始。這樣一個單細胞，鬼斧神工地構建出有機生命體所需的各種組 織、器官、系統(tǒng)。每個新細胞在正確的時間，在正確的地方分裂、分 化,并與相鄰細胞協(xié)調(diào)精準發(fā)揮功能。多細胞生命的發(fā)育過程，是自然界中最引人注目的壯舉之一。盡 管經(jīng)過數(shù)十年的研究，生物學家仍然無法完全理解這一過程。2018年4月26日，Science雜志發(fā)表三篇超重磅研究，來自 哈佛醫(yī)學院和哈佛大學的研究人員使用多種技術組合，包括對發(fā)育中斑馬魚和青蚌胚數(shù)千個單細胞的基因測序，以精確的方式跟蹤和描 繪了組織和整個機體從單細胞發(fā)育的完整歷程。哈佛大學分

3、子和細胞生物學教授Alexander Schier表示，"這 幾乎就像通過幾顆星星看到了整個宇宙?！笆褂脝渭毎麥y序技術，硏究團隊在胚月臺發(fā)育的最初24小時內(nèi)追 蹤單個細胞的命運，揭示出單個細胞基因開啟或關閉的綜合景觀，以 及胚細胞何時何地轉變?yōu)樾碌募毎麪顟B(tài)和類型。這些發(fā)現(xiàn)就好比是勾勒出胚發(fā)育過程中產(chǎn)生不同細胞類型的 遺傳"配方目錄，為發(fā)育生物學的深入研究和疾病的認識，提供了 前所未有的資源。圖|斑馬魚受精卵在4、6、8、10小時（hpf ）時的發(fā)育過程 中不同器官細胞形成,最中心的深藍色為受精卵，以時間為單位向外 輻射。通過單細胞測序哉們可以在一天的時間里概括數(shù)十年來對細

4、胞在生命早期階段分化的艱苦研究?！惫疳t(yī)學院系統(tǒng)生物學助理教 授Allon Klein表示，"通過我們開發(fā)的方法，我們正在繪制我們認 為發(fā)育生物學的未來,發(fā)育生物學將會轉變?yōu)槎康?、大?shù)據(jù)驅動的 科學?！盇lexander Schier表示,除了對生命早期階段有所了解之外, 這項工作還可以為大量疾病的新認識打開大門。”我們預見，任何復 雜的生物學過程，只要是細胞隨時間改變了基因表達，都可以使用這 種方法重建，不僅僅是發(fā)育中的胚月臺,還有癌癥發(fā)生或大腦退化?！被驹韱渭毎麥y序首先不是僅僅對一個細胞進行測序，而是說該項技術 能對單一細胞的基因組或轉錄組進行測序，可以理解為單細胞水平上

5、的測序。在介紹基本原理之前先讓我們嘗試著回答一下:為什么要進行單 細胞測序？換個姿勢來問就是，單細胞測序技術能解決什么傳統(tǒng)方法 解決不了的問題？世界上沒有兩片相同的葉子，對于多細胞生物來說細胞與細胞之 間是存在差異的,很多時候是基因組、轉錄組上的失之毫厘，功能上 的差之千里。比如在腫瘤組織中，腫塊中心的細胞與腫塊周圍的細胞，原發(fā)灶 與轉移灶的細胞，其基因組與轉錄組等遺傳信息是存在差異的,這也 就導致不同腫瘤細胞表現(xiàn)出免疫持性、生長速度、侵襲能力等表型方 面的差異，最終導致對不同抗月中瘤藥物的敏感性不同或放療敏感性的 差異。那么我們怎樣來研究這種遺傳信息的異質(zhì)性呢？傳統(tǒng)的測序方 法是在多細胞水平

6、上進行的,這種大家一起"吃大鍋飯的形式，使 其丟失了異質(zhì)性的信息，而單細胞測序可以完美的解決這個問題。給 大家更形象的舉個例子:Western blot 檢測這三種樣本雖然存在這么大的差異，但是通過western blot檢 測的時候我們得出的結論是：該基因在不同組織中的表達基本一致。 上圖所展示的異質(zhì)性信息就被完全的忽略掉了。和western blot相似的是，傳統(tǒng)測序方法所展示的信息也是在 多細胞水平上的平均信息，而單細胞水平上的測序則完全可以反應同 個細胞群里不同細胞的基因組和轉錄組狀況。單細胞測序技術的出現(xiàn)，使得從混雜的樣品中篩選出異質(zhì)性信息 的難題得以解決，該技術的成熟使用

7、也必將引領生命科學硏究向前邁 進一大步。那么單細胞測序又是如何實現(xiàn)的呢？我們以單細胞RNA-seq作 為例子，簡單的來介紹一下該技術得以實現(xiàn)的原理：,將單細胞分離出來，單獨構建測序文庫，并進行測序。這種 思路通量極低而且成本極高，如前文所說燒掉很多錢就測數(shù)十個細 胞,而往往這數(shù)十個細胞還不足以反應真實的科學問題。所以我們著 重介紹第二種方案。二，基于標簽（barcode ）的單細胞識別。它的核心思想是:在 對每個細胞的mRNA測序前做逆轉錄時，為其加上獨一無二的標簽 序列。這樣即便是混合起來測序，我們也可以把攜帶相同標簽序列（barcode ）的RNA片段視為來自同一個細胞。通過這種策略，我

8、們可以通過一次建庫，測得上萬個單細胞的信息（如下圖所示）O3單細胞測序帶給大家哪些福利？就拿大家比較關注的single cell RNA-seq來說吧：、在傳統(tǒng)的硏究方法中，我們往往根據(jù)標記基因和細胞形態(tài)來 區(qū)分不同細胞類型，而這種方法無可厚非的存在很多爭議。而單細胞 測序技術可以更精準無偏倚的來對細胞進行分群。尤其是對免疫學， 腫瘤學，遺傳學的硏究將會帶來巨大影響。二、分析稀有的細胞，特別是特定時空環(huán)境下的細胞。比如從環(huán) 境中取樣的微生物等。三、臨床上，對體外受精胚胎進行植入前的篩查。四、基于循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells )進行癌癥診 斷,大力推進新型的循環(huán)腫

9、瘤細胞檢測技術。特別是惡性腫瘤患者治 療前后的循環(huán)腫瘤細胞類型和數(shù)量的變化具有重要的預后提示價值。五、已經(jīng)通過傳統(tǒng)的測序方法進行大規(guī)模測序，希望以此挖掘數(shù) 據(jù)沖擊重量級期刊的小伙伴彳門請注意，單細胞測序在高分期刊的發(fā)表 已成井噴之勢，幾年之后技術必將更加成熟。4單細胞測序技術的應用單細胞測序技術助力腫瘤研究l.Cell :以色列研究團隊使用單細胞轉錄組測序揭示黑色素瘤腫 瘤浸潤T細胞的轉錄組異質(zhì)性和分化途徑。以色列Ido Amit實驗室李漢杰博士等發(fā)現(xiàn)，癌癥中免疫細胞的 異質(zhì)性對免疫治療的效果有重要影響，功能失調(diào)的CD8T細胞在月中 瘤微環(huán)境中處于動態(tài)分化和高度活躍的狀態(tài)，而且很可能驅動著腫瘤

10、 特異性免疫應答。該團隊通過對25名黑色素瘤患者腫瘤中免疫細胞,進行單細胞 轉錄組測序和單細胞TCR測序分析，繪制黑色素瘤詳盡的免疫細胞 圖譜。該研究發(fā)現(xiàn)盡管不同免疫細胞亞型存在于大多數(shù)患者中，但是它 們的相對豐度在不同患者中存在很大差異。此夕卜/盡管豐度不同，所 觀察到的CD8T細胞的分化途徑卻是高度保守的。該研究為癌癥中免 疫細胞的異質(zhì)性對免疫治療的效果進一步提供了理論支撐。2 : Nature , Nature Medicine兩連發(fā)：北京大學張澤民教授課 題組重磅解析結直腸癌和肺癌免疫微環(huán)境張澤民教授課題組分別在Nature Medicine和Nature發(fā)布重大研究成果,在單細胞水平

11、繪制肺癌和結直腸癌T細胞免疫圖 譜，揭示了肺癌和結直腸癌T細胞的亞群分類、組織分布特征、腫瘤 內(nèi)群體異質(zhì)性及藥物靶基因表達情況,鑒定了跨組織分布的T細胞類 群及亞群間潛在的狀態(tài)轉換關系，這對于肺癌和結直腸癌的診斷和治 療具有重大意義。該團隊將繼續(xù)用單細胞測序技術和生物信息方法結合，來闡明 腫瘤微環(huán)境特別尉中瘤浸潤免疫細胞的精確組成和功能狀態(tài)，探究腫 瘤內(nèi)部各類細胞的特異屬性、相互關系、及動態(tài)變化，從而找到新靶 點,開拓克服腫瘤的新穎方法。3 : Cell :美國硏究團隊繪制目前規(guī)模最大免疫細胞圖譜，探索 乳腺癌免疫微環(huán)境美國Sloan Kettering癌癥中心團隊，使用單細胞轉錄組測序技 術

12、，分析了人乳卿中瘤以及配對的正常乳腺組織，外周血和淋巴結4 個組織來源的共47016個免疫細胞的基因表達特征。揭示腫瘤內(nèi)淋 巴細胞和髓系細胞的異質(zhì)性，與正常乳腺組織相比顯著的表型擴增。 這種異質(zhì)性通過各種環(huán)境刺激反應引起的組合基因的表達，且TCR 的特異性參與了 T細胞組合基因表達的形成。所觀察到的T細胞狀態(tài) 的連續(xù)性變化顛覆了之前較少分化或激活離散狀態(tài)形成的腫瘤微環(huán) 境經(jīng)典概念。單細胞轉錄組分析與心臟病Cell Stem Cell :從單細胞水平描繪了人心肌細胞重編程過程中 轉錄組隨著細胞命運轉化而發(fā)生的改變。該論文由來自北卡羅來納大學(UNC)的心肌細胞重編程領域 開創(chuàng)者之一錢莉教授帶領的

13、硏究團隊發(fā)表。研究人員首先報道了優(yōu)化 的人心肌細胞重編程的方法，利用最精簡的重編程因子達到了高效的 重編程效果( 50%的轉化細胞表達心肌細胞的標記分子cTnT )。硏究人員利用單細胞測序詳細描繪了人心肌細胞重編程過程中 轉錄組的動態(tài)變化W細胞命運的二項選擇，即在成纖維細胞向心肌轉 化的早期誘導階段存在一個”決策點”，決定了細胞的命運能否成功 地被轉化。除了描繪整體的重編程圖譜外”通過深度挖掘單細胞轉錄組數(shù) 據(jù)，該研究還為進一步了解人心肌細胞重編程的分子機制提供了大量 的線索和研究方向。基于重編程響應和非響應途徑的差異基因比對， 研究人員還找到了正向和反向的分子標記物，將來可用于篩選和富集 轉

14、化的心肌細胞。單細胞轉錄組分析阿爾茨海默病Nature :單細胞轉錄組分析阿爾茲海默病來自美國麻省理工學院的研究人員首次對阿爾茨海默病患者的 單個腦細胞中表達的基因進行了綜合分析。所獲得的分析結果允許他 們鑒定出在神經(jīng)元其他類型的腦細胞中受到影響的獨特細胞通路。 這一分析可能為阿爾茨海默病提供許多潛在的新型藥物靶點。研究人員分析了 24名表現(xiàn)出高水平阿爾茨海默病病理學特征的 人和24名具有相似年齡的沒有這些疾病跡象的人的尸檢大腦樣本， 對來自這些受試者約8萬個細胞進行單細胞RNA測序。通過該測序 技術，研究者不僅能夠分析最豐富的細胞類型，包括興奮性和抑制性 神經(jīng)元，而且還能分析稀有的非神經(jīng)元腦

15、細胞,如少突膠質(zhì)細胞、星 形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。硏究發(fā)現(xiàn)，這些細胞類型中的每一種在阿爾茨海默病患者中都表 現(xiàn)出明顯的基因表達差異。在患有阿爾茨海默病的個體中，與髓鞘形 成相關的基因在神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞（產(chǎn)生髓鞘的細胞）中都受到 影響。單細胞測序與糖尿病Nature : Chartingcellular identity during human in vitroP-cell differentiation哈佛大學干細胞研究所的Douglas A.Melton團隊，使用單細胞 測序的方法，詳細地分析了誘導方案中細胞組成和基因表達動態(tài)變 化；并發(fā)現(xiàn)CD49a (ITGA1)是p細胞的表面標記物，可用來富集p 細胞伺時，也為研究體內(nèi)胰腺祖細胞分化為胰島細胞過程提供指導。單細胞測序發(fā)現(xiàn)新的腸道干細胞Nature : Singlecell tranomes of the regenerating in