種子的擴大培養(yǎng)

1、種子的擴大培養(yǎng)種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子制備實例種子制備的技術概要 種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產菌種接入試凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)罐逐級擴大培養(yǎng), ,最終獲得一定數(shù)量和質量最終獲得一定數(shù)量和質量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第一節(jié) 種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)的概念:種子擴培的目的種子擴培的目的q 接種量的需要接種量的需要q 菌種的馴化菌種的馴化q 縮短發(fā)酵時間、保證

2、生產水平縮短發(fā)酵時間、保證生產水平種子的要求種子的要求：q 總量及濃度能滿足要求總量及濃度能滿足要求q 生理狀況穩(wěn)定，個體與群體生理狀況穩(wěn)定，個體與群體q 活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長q 無雜菌污染無雜菌污染第二節(jié)第二節(jié) 種子制備的技術種子制備的技術實驗室階段實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。生產車間階段生產車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產車間階段。一、實驗室種子的制備一、實

3、驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式：對于產孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。（一）孢子的制備1，細菌孢子的制備 細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37。細菌菌體培養(yǎng)時間一般為12天，產芽孢的細菌培養(yǎng)則需要510天。2，霉菌孢子的制備 霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為2528。培養(yǎng)時間一般為414天。3，放線菌孢子的制備 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基

4、，培養(yǎng)基中含有一些適合產孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28。培養(yǎng)時間為514天。（二）液體種子制備1 1，好氧培養(yǎng)，好氧培養(yǎng) 對于產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產對于產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產鏈霉素的灰色鏈霉菌、產卡那霉素的卡那鏈霉菌鏈霉素的灰色鏈霉菌、產卡那霉素的卡那鏈霉菌可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：絲體，作為種子。其過程如下： 試管試管三角瓶三角瓶搖床搖床種子罐種子罐

5、 2 2，厭氧培養(yǎng)，厭氧培養(yǎng)對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過程如下：制備過程如下：試管試管三角瓶三角瓶卡式罐卡式罐種子罐種子罐二、生產車間種子制備二、生產車間種子制備 實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。 1 種子罐的作用主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產物的合成。種子罐級數(shù)

6、是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：（1）菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；（2）所采用發(fā)酵罐的容積。種子罐級數(shù)的確定 細菌細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液一級種子罐（27,40小時孢子發(fā)芽，產生菌絲 ）二級種子罐（27，1024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐放線菌放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子 3，確定種子罐級數(shù)需注意的問題（1）種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會（2）種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的

7、生產率，增加染菌機會（3）雖然種子罐級數(shù)隨產物的品種及生產規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數(shù)。 4、接種量的確定、接種量的確定 移入種子的體積移入種子的體積接種量接種量 接種后培養(yǎng)液的體積接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。但是一般認為大一點好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)

8、酵罐。 P 1475、種齡、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間?；虬l(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較原則：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結果定。大，但是最終由實驗結果定。6、種子的質量要求：、種子的質量要求：量：要求達到一定的濃度量：要求達到一定的濃度質質: 形態(tài)形態(tài) （生長處于某個階段、均勻等等）（生長處于某個階段、均勻等等） 理化指標：理化指標：C、N、P的含量，的含量，pH 酶活等酶

9、活等 無污染無污染影響種子質量的因素及控制孢子的質量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量種子培養(yǎng)基要滿足的要求（1）營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 （2）選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基； （3）營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用； （4）營養(yǎng)成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高 （5）營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。 2，培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量 (3) 濕度第三節(jié)第三節(jié) 種子制備過程舉例種子制備過程舉例一、谷氨酸生產的種子制備一、谷氨酸生產的種子制備制備過程制備過程斜面菌種斜面菌種一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵1、斜面、斜面 (AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨培養(yǎng)基

10、：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化鈉，氯化鈉 0.5 瓊脂瓊脂 2%， pH 7.0-7.2培養(yǎng)基特點：培養(yǎng)基特點：菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產酸，菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮培養(yǎng)條件應有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮而不含或少含糖為原則。而不含或少含糖為原則。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：32，生長，生長18-24小時小時生長斜面要求：生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過 3次次2. 一

11、級一級種子（搖瓶）種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液三角瓶中，裝液200-250ml,32培培 養(yǎng)養(yǎng)12小時。小時。培養(yǎng)基：葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米漿，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1%一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應以少含糖分，多含有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于組成應以少含糖分，多含有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。所使用的原料已經基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基長菌考慮。所使用的原料已經基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基3. 二級種子二級種子(種子罐種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培

12、養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%），）， 32培養(yǎng)培養(yǎng)7-10個小時個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的質量要求：種子的質量要求：種齡：種齡：12h，pH值：值：6.40.1光密度：凈增光密度：凈增OD值值0.5以上以上殘?zhí)牵簹執(zhí)牵?.5以下以下 無菌檢查：無菌檢查：(-)噬菌體檢查：噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反應。革蘭氏陽性

13、反應。二、青霉素生產的種子制備二、青霉素生產的種子制備制備過程制備過程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一級種子一級種子 二級種子二級種子 發(fā)酵發(fā)酵一、斜面孢子一、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、培養(yǎng)基：甘油、 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等培養(yǎng)基特點培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細有利于長孢子，用量少而精細培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：25、7天天, 注意濕度注意濕度50%左右左右二、大米孢子二、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點培養(yǎng)基的特點：成本低、米粒之間結構疏松提高比表成本低、米粒之間結構疏松提高比表面積和氧的傳質，營養(yǎng)適當（要求大米面積和氧的傳質，營養(yǎng)適當（要求大米的白點小）有利于孢子的生長。的白點?。┯欣阪咦拥纳L。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：25、7天，控制濕度天，控制濕度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106個孢子個孢子3、一級種子、一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的目的：長菌體長菌體培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：27，4