硫氧還蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的小鼠內(nèi)皮抑素之純化和生物學(xué)活性鑒定

1、硫氧還蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的小鼠內(nèi)皮抑素之純化和生物學(xué)活性鑒定 作者：馬衛(wèi)列,劉芳,何承偉,何振輝 【關(guān)鍵詞】 蛋白 Purification of mouse endostatin in thioredoxin fusion expression system and identification of its biological activity 【Abstract】 AIM：To purify mouse endostatin by using thioredoxin fusion expression system and to identify its biological act

2、ivity. METHODS: The pThioHisendo recombinant plasmid was transformed into BL21. After induction with IPTG, thioredoxinendo fusion protein was expressed in BL21 and the product was identified as inclusion body by SDSPAGE. The expression product was purified by affinity chromatography through Nicolumn

3、. The purified protein was detected by chicken chorioallantoic membrane(CAM) angiogenesis inhibitory assay and endothelial cell proliferation inhibitory assay. RESULTS: High purity thioredoxinendostatin fusion protein was obtained by SDSPAGE analysis. The purity of the protein was over 95%. The prot

4、ein possessed the inhibitory activity of endothelial cell proliferation and inhibited the angiogenesis of CAM inhibitory rate: (49.62 / 16±4.1), (53.2±2.3), (55.0±3.6) and (67.1±5.7). CONCLUSION: The mouse endostatin recombinant fusion protein expressed in E.coli by using thiored

5、oxin fusion expression system is easy to be purified and possesses high activity. 【Keywords】 endostatin；thioredoxin fusion expression system；fusion protein 【摘要】 目的：將硫氧還蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的小鼠內(nèi)皮抑素（endostatin）進(jìn)行純化并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定. 方法： 將含有pThioHisendo重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG（異丙基D硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，SDSPAGE分析表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，將包涵體純

6、化后通過(guò)鎳柱親和層析得到純化的、可溶性的小鼠內(nèi)皮抑素，經(jīng)SDSPAGE分析鑒定. 將純化的蛋白質(zhì)通過(guò)雞胚尿囊膜血管生成抑制實(shí)驗(yàn)和內(nèi)皮細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定. 結(jié)果：經(jīng)SDSPAGE電泳分析獲得了高純度的小鼠內(nèi)皮抑素重組融合蛋白，純度可達(dá)95%，得率為0.27 g/L. 純化的重組蛋白在體外能抑制雞胚囊膜血管生成及具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性，加入重組蛋白內(nèi)皮抑素5 g組與10 g組血管生成抑制率分別為(22.3±2.0)和(47.1±4.0)，P<0.05，和對(duì)照組經(jīng)過(guò)方差分析,差異都有顯著性意義；內(nèi)皮細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)不同劑量重組蛋白內(nèi)

7、皮抑素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用抑制率分別為(49.6±4.1)，(53.2±2.3)，(55.0±3.6)，(67.1±5.7)，經(jīng)過(guò)方差分析和相關(guān)性分析，具有劑量依賴效應(yīng)(r0.984，P<0.05). 結(jié)論： 用硫氧還蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)的小鼠內(nèi)皮抑素重組融合蛋白易純化并具有高活性. 【關(guān)鍵詞】 內(nèi)皮抑素；硫氧還蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)；融合蛋白 0引言 內(nèi)皮抑素（endostatin）是OReilly等1于1997年發(fā)現(xiàn)的一種血管生成抑制劑，相對(duì)分子質(zhì)量Mr為20 000. Yamanaka等2實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將含有內(nèi)皮抑素基因的病

8、毒注入小鼠腦瘤瘤體內(nèi)可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少瘤組織血管生成；劉江秋等3發(fā)現(xiàn)，重組血管內(nèi)皮抑素能抑制小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及新生毛細(xì)血管的形成. 過(guò)去的抗癌藥有較大的副作用，而內(nèi)皮抑素通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整和素（integrin）結(jié)合抑制新生血管的形成4，控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有任何不良影響. 為了探討內(nèi)皮抑素用于腫瘤生物治療的可行性，我們利用硫氧還蛋白融合表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)皮抑素的高效表達(dá)，通過(guò)鎳柱親和層析對(duì)內(nèi)皮抑素融合蛋白進(jìn)行純化，得到可溶性的內(nèi)皮抑素融合蛋白，對(duì)純化后的融合蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定，為以后大量生產(chǎn)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料硫

9、氧還蛋白融合表達(dá)載體pThiohisA質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院微生物系楊蘇生教授惠贈(zèng)；pThioHisAendo重組質(zhì)粒由本室制備，Nickel Chelate Affinity Matrix(NiCAM)樹(shù)脂購(gòu)自Sigma公司，大腸桿菌BL21菌株為本室保存；甲叉雙丙烯酰胺、溶菌酶、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、還原型谷胱甘肽(GSH)、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker、脫氧膽酸鈉、IPTG購(gòu)自華美生物工程公司. 1.2方法 1.2.1實(shí)驗(yàn)分組融合蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為2組：加入IPTG至終濃度1 mmol/L的誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)5 h；另一組為未加IPTG組. 雞胚囊膜（CAM）血管生成抑制實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組

10、（n=5），5 g內(nèi)皮抑素加樣組（n=5），10 g內(nèi)皮抑素加樣組（n=5）. 內(nèi)皮細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)分為5組（每組n=5）：對(duì)照組，12.5，25，50和100 g內(nèi)皮抑素加樣組. 1.2.2含目的基因的重組質(zhì)粒pThioHisAendo融合蛋白的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌：用0.1 mmol/L CaCl2處理BL21細(xì)菌，制備感受態(tài)細(xì)菌；加10 mg/L pThioHisendo重組質(zhì)粒2 L入100 L感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴30 min；42水浴熱休克2 min，37水浴5 min，冰浴2 min；加1 mL不含氨芐的LB培養(yǎng)基，37水浴1 h. 取200 L菌液涂布于含100 mg/L氨芐的L

11、B平板上，37培養(yǎng)20 h. 融合蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)：挑取單菌落接種于2 mL含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，共挑8個(gè)菌落，次日取20 L菌液加入2 mL LB培養(yǎng)基，37培養(yǎng)至A590 nm為0.5左右. 1.2.3表達(dá)產(chǎn)物的鑒定取上述IPTG誘導(dǎo)5 h后的菌液10 L，1000 r/min離心5 min，將沉淀彈勻，加入1 L PMSF（苯甲基磺酰氟）、5 L溶菌酶和1 g/L脫氧膽酸5 L，不停搖動(dòng)混勻，使細(xì)菌裂解，加1×106 U/L DNaseI 5 L，混勻，37 1 h，離心（4 ，12 000 g，15 min），沉淀為不溶解蛋白，上清即為可溶性蛋白，分別取上

12、清液和沉淀，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，用100 g/L SDSPAGE進(jìn)行電泳， 2.5 g/L考馬斯亮藍(lán)R250染色，篩選陽(yáng)性菌落. 電泳結(jié)束后確定融合蛋白為包涵體，5號(hào)和6號(hào)克隆表達(dá)最高. 1.2.4融合蛋白的提取工程菌的發(fā)酵：取IPTG誘導(dǎo)5 h后的6號(hào)克隆菌液1.5 mL至2 L含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)5 h左右至A590 nm為0.5，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，誘導(dǎo)5 h，2500 g，4，離心8 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體. 包涵體的獲得：細(xì)菌沉淀懸浮于200 mL bufferA（0.1 mol/L TrisCl pH 8.0，5 mmol/L EDTA

13、），加入溶菌酶（50 mg/L），30放置15 min，加入1 g/L脫氧膽酸鈉（SOC），超聲破碎10 s，5次；8000 g，4離心10 min，棄上清，得包涵體. 包涵體的洗滌：沉淀重懸于含1 g/L SOC的bufferA中，8000 g，4，離心10 min，棄上清；沉淀再次重懸于含1 g/L SOC的bufferA中洗滌，8000 g，4，離心10 min. 包涵體的溶解：沉淀用30 mL bufferB（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0，10 g/L十二烷基肌酸鈉，1 mmol/L DTT）溶解，8000 g，4，離心10 min，取上清液. 包涵體的透析和復(fù)性：

14、上清轉(zhuǎn)入截留相對(duì)分子質(zhì)量Mr為8000的透析袋中，于1500 mL buffer C（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0，0.1 mmol/L DTT）4透析4 h，再重復(fù)透析1遍；樣品再次放入1500 mL buffer D（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0）中透析4 h，2遍；樣品再次放入1000 mL buffer E（0.05 mol/L TrisCl pH 8.0，0.01 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH）透析4 h，2遍. 最后樣品放于0.05 mol/L TrisCl pH 8.0透析5 h，2遍. 鎳柱親和層析進(jìn)一步純化內(nèi)皮抑素融

15、合蛋白：將40 mL（每毫升樹(shù)脂可以純化蛋白質(zhì)20 mg） NiCAM親和樹(shù)脂（200 mL/L乙醇保存）裝到層析柱里，用100 mL去離子水清洗樹(shù)脂，再用150 mL平衡液（50 mmol/L磷酸鈉pH 8.0，0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）沖洗，去除乙醇?xì)埩? 將待純化的蛋白質(zhì)溶液加到層析柱內(nèi)樹(shù)脂上，調(diào)節(jié)液體流出速度為25滴/min，并加平衡液沖洗. 待純化的蛋白質(zhì)溶液過(guò)柱完成后，繼續(xù)用平衡液沖洗NiCAM親和樹(shù)脂層析柱，當(dāng)過(guò)柱后的平衡液A280 nm保持穩(wěn)定，接近平衡液本身的pH值時(shí)用洗脫液（50 mmol/L磷酸鈉,pH 8.0，0.3 mol/L NaCl，2

16、50 mmol/L咪唑）洗脫含目的蛋白的NiCAM親和樹(shù)脂，收集含有目的蛋白的洗脫液. 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度，計(jì)算蛋白質(zhì)獲得率，再次SDSPAGE凝膠電泳，鑒定蛋白質(zhì)純度. 蛋白溶液保存于-20中，供活性測(cè)定使用. 1.2.5內(nèi)皮抑素融合蛋白生物學(xué)活性的測(cè)定 CAM血管生成抑制實(shí)驗(yàn)：孵育7 d的受精雞胚蛋殼開(kāi)1 cm2左右的小窗口，將純化的重組融合蛋白內(nèi)皮抑素加樣于放置在CAM上的滅菌濾紙上，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出雞胚，局部用固定液固定，固定后剪下覆蓋濾紙的CAM，棄去濾紙，把CAM置于干凈的載玻片上，制成永久性標(biāo)本. 在光學(xué)顯微鏡或解剖鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算濾紙覆蓋范圍內(nèi)可

17、見(jiàn)的血管分支點(diǎn)的數(shù)量. 血管生成抑制率按下面的公式計(jì)算：血管生成抑制率（）=(1給藥組血管分支點(diǎn)數(shù)/對(duì)照組血管分支點(diǎn)數(shù)) . 內(nèi)皮細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，傳至5代后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，接種于96孔板，每孔90 L，常規(guī)培養(yǎng)46 h后棄上清，加入不同濃度培養(yǎng)液稀釋的純化蛋白10 L/孔，對(duì)照組加入10 L培養(yǎng)基，60 h后加入5 g/L MTT 20 L/孔，繼續(xù)孵育4 h，吸去上清加入DMSO 150 L/孔，震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處讀數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用x±s表示，SPSS 12.0評(píng)估版統(tǒng)計(jì)

18、軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1融合蛋白表達(dá)的鑒定SDSPAGE分析表明，含pThioHisAendo的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量Mr約32×103處出現(xiàn)了1條明顯的新蛋白帶，其大小與理論推算的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符合（內(nèi)皮抑素Mr為20×103，thioredoxin Mr為11.7×103），未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體實(shí)驗(yàn)組在相應(yīng)位置沒(méi)有明顯表達(dá)（圖1）. 上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn),thioredoxin/內(nèi)皮抑素融合蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，菌體

19、裂解物上清在相應(yīng)位置沒(méi)有明確條帶出現(xiàn)（圖2）. 圖1100 g/L SDSPAGE鑒定pThioHisAendo重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的表達(dá) 圖2100 g/L SDSPAGE電泳鑒定鎳柱親和層析純化的硫氧還融合蛋白 2.2內(nèi)皮抑素融合蛋白純化結(jié)果的鑒定經(jīng)過(guò)對(duì)包涵體的提取、溶解、復(fù)性、透析、鎳柱親和層析等步驟，內(nèi)皮抑素融合蛋白被純化，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度為15.7 g/L，總體積為35 mL獲得蛋白總量為0.55 g，得率為0.27 g/L菌液. 經(jīng)過(guò)SDSPAGE凝膠電泳鑒定，在Mr約32×103處僅見(jiàn)1條目的蛋白區(qū)帶，純度可達(dá)95%（圖1）. 2.3重組蛋白內(nèi)皮抑素生物

20、學(xué)活性對(duì)照組藥物紙片覆蓋范圍內(nèi)血管細(xì)小分支多(圖3)；加入重組蛋白內(nèi)皮抑素5 g組（圖4）和對(duì)照組相比，血管分支明顯減少；加入重組蛋白內(nèi)皮抑素10 g組（圖5）和對(duì)照組對(duì)比顯示血管分支點(diǎn)進(jìn)一步減少，根據(jù)表1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，血管生成抑制率明顯高于重組蛋白內(nèi)皮抑素5 g組，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異都有顯著性差異(表1). 加入重組蛋白內(nèi)皮抑素后，可見(jiàn)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，不同濃度實(shí)驗(yàn)組抑制率見(jiàn)圖6，并具有劑量依賴效應(yīng)（r=0.984，P<0.05）. 圖3雞胚囊膜血管生成抑制實(shí)驗(yàn)（對(duì)照組）×40 圖4雞胚囊膜血管生成抑制實(shí)驗(yàn)（重組內(nèi)皮抑素蛋白5 g組）

21、15;40 3討論 內(nèi)皮抑素作為一種較強(qiáng)的血管生成抑制藥，治療圖5雞胚囊膜血管生成抑制實(shí)驗(yàn)（重組內(nèi)皮抑素蛋白10 g組）×40 表1重組蛋白內(nèi)皮抑素對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響(略) 圖6不同濃度的重組內(nèi)皮抑素對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 腫瘤具有低毒、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，因而備受關(guān)注. 重組內(nèi)皮在美國(guó)已進(jìn)入II期臨床實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)多種腫瘤都有確切的治療效果5. 用一般的大腸桿菌表達(dá)體系每升發(fā)酵液雖能得到3040 mg純內(nèi)皮抑素，但99未經(jīng)正確折疊而無(wú)活性. 昆蟲(chóng)細(xì)胞和酵母細(xì)胞表達(dá)體系6雖能表達(dá)出有活性的蛋白質(zhì)，每升發(fā)酵液僅能得到10 mg以下純內(nèi)皮抑素. 其構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜，產(chǎn)量小.

22、為了高效、低成本制備內(nèi)皮抑素，我們選用硫氧還蛋白融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，它特別適用于在大腸桿菌中高產(chǎn)量表達(dá)可溶性蛋白質(zhì). 本系統(tǒng)表達(dá)出的蛋白質(zhì)大多能正確折疊并表現(xiàn)出全部生物學(xué)活性. 我們選用pThiohisA作為表達(dá)載體，它表達(dá)的硫氧還蛋白的特點(diǎn)是C端有6個(gè)組氨酸殘基，使重組蛋白可通過(guò)鎳柱親和層析技術(shù)得純化. 我們利用硫氧還蛋白融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)獲得了高水平的thioredoxin/內(nèi)皮抑素融合蛋白的表達(dá)，并經(jīng)過(guò)包涵體的提取、純化、溶解、復(fù)性及鎳柱親和層析純化目的蛋白，得率為1升菌液可獲得0.27 g純化的內(nèi)皮抑素融合蛋白，產(chǎn)量高于普通大腸桿菌表達(dá)體系4倍. 雖然本實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡鞍椎谋磉_(dá)仍是以包涵體形式存在，但也為重組蛋白純化帶來(lái)了極大的方便，這種高純度、高活性目的蛋白的獲取，便于研究其在抗腫瘤及其血管形成依賴性疾病中的治療作用，為進(jìn)一步用于臨床奠定基礎(chǔ). 【參考文獻(xiàn)】1 OReilly M S，Boehm T，Shing Y，et al. Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growthJ. Cell，1997,88:277-285.2 Yamanaka B，Zullo SA，Ramsey J，et al.