第3章白質(zhì)分離純化ppt

1、第三章第三章蛋白質(zhì)的分離純化與表征蛋白質(zhì)的分離純化與表征蛋白質(zhì)的分離純化與表征 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子的大小與形狀蛋白質(zhì)分子的大小與形狀 蛋白質(zhì)膠體與沉淀蛋白質(zhì)膠體與沉淀 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 蛋白質(zhì)分離純化的方法蛋白質(zhì)分離純化的方法 蛋白質(zhì)含量測定與純度鑒定蛋白質(zhì)含量測定與純度鑒定第三章 蛋白質(zhì)的分離純化與表征蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)中可解離的基團蛋白質(zhì)中可解離的基團 蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點1蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)中可解離的基團蛋白質(zhì)中可解離的基團-nh3+pka=7.68.4-coo-pka=33.2next page

2、1蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)中可解離的基團蛋白質(zhì)中可解離的基團-coo-pka=3.04.7-coo-pka=4.41蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)中可解離的基團蛋白質(zhì)中可解離的基團pka=5.67.0-nh2pka=9.410.61蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)中可解離的基團蛋白質(zhì)中可解離的基團pka=11.612.6pka=9.810.4pka=9.110.81蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì) 等電點 蛋白質(zhì) 等電點胃蛋白酶 1.0 -胰凝乳蛋白酶 8.3卵清蛋白 4.6 -胰凝乳蛋白酶原 9.1血清清蛋白 4.7 核糖核酸酶 9.5-乳球蛋白 5.2 細胞色素c 10.7胰島素 5.3 溶

3、菌酶 11.0血紅蛋白 6.71蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的大小與形狀蛋白質(zhì)分子的大小與形狀 根據(jù)化學(xué)組成測相對分子量根據(jù)化學(xué)組成測相對分子量 滲透壓法測相對分子量滲透壓法測相對分子量 擴散系數(shù)法測相對分子量擴散系數(shù)法測相對分子量 沉降分析法測相對分子量沉降分析法測相對分子量 凝膠過濾法測相對分子量凝膠過濾法測相對分子量 sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小根據(jù)化學(xué)組成測相對分子量根據(jù)化學(xué)組成測相對分子量 肌紅蛋白（肌紅蛋白（mb） m.w.=(fe原子量原子量)/(mb中中fe含量含量)*100 =55.8/0.335*100=16

4、 700 血紅蛋白（血紅蛋白（hb） 一分子中含有一分子中含有4個個fe原子，因此：原子，因此： mw=4*16700=66 8002蛋白質(zhì)的分子形狀與大小滲透壓法測相對分子量滲透壓法測相對分子量 =rt( + k*c2)cmr c=rtmr+ k*c c cmr =rtlimc0 cmr=10 000100 0002蛋白質(zhì)的分子形狀與大小擴散系數(shù)法測相對分子量擴散系數(shù)法測相對分子量 fick第一擴散定律：第一擴散定律： 擴散系數(shù)擴散系數(shù)d求法（求法（ fick第二擴散定律）第二擴散定律）dmdt= - d*a*dcdxdcdt= - dd2cdx2c2c1= exp(- )x22-x124d

5、t2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小擴散系數(shù)法測相對分子量擴散系數(shù)法測相對分子量擴散系數(shù)擴散系數(shù)d隨蛋白質(zhì)隨蛋白質(zhì)mr的增加而降低。的增加而降低。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) mr 擴散系數(shù)（擴散系數(shù)（107cm2s-1)核糖核酸酶核糖核酸酶a 12 600 11.9細胞色素細胞色素c 13 370 11.4肌紅蛋白肌紅蛋白 16 900 11.3凝乳蛋白酶原凝乳蛋白酶原 23 240 9.5血紅蛋白血紅蛋白 64 500 6.9過氧化氫酶過氧化氫酶 247 500 4.1肌球蛋白肌球蛋白 524 800 1.12蛋白質(zhì)的分子形狀與大小沉降分析法測相對分子量沉降分析法測相對分子量 蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強大的離心蛋白質(zhì)

6、分子在溶液中受到強大的離心力作用時，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶力作用時，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度，蛋白質(zhì)分子就會沉降。沉液的密度，蛋白質(zhì)分子就會沉降。沉降速率與降速率與蛋白質(zhì)分子的大小蛋白質(zhì)分子的大小和和密度密度有有關(guān)，而且與關(guān)，而且與分子形狀、溶液的密度和分子形狀、溶液的密度和粘度粘度有關(guān)。有關(guān)。2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小沉降分析法測相對分子量沉降分析法測相對分子量斯維得貝格方程：斯維得貝格方程：mr =rtsd(1-)s為沉降系數(shù):單位秒-1，通常將10-13秒 作為一個單位用s表示為偏微比容：蛋白質(zhì)溶于水為0.74cm3/g為溶劑的密度2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小凝膠

7、過濾法測相對分子量凝膠過濾法測相對分子量洗脫液體積（ml）蛋白質(zhì)含量相對分子量mrabcd待測蛋白分子量待測蛋白分子量2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小sds-sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量凝膠電泳法測相對分子量 電泳時的遷移率取決于蛋白的凈電荷、分子大電泳時的遷移率取決于蛋白的凈電荷、分子大小、形狀；小、形狀； sds（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)結(jié)合，使全（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)結(jié)合，使全部呈負電荷，同時改變蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象成部呈負電荷，同時改變蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象成近似球形；巰基乙醇打開二硫鍵，使亞基分離；近似球形；巰基乙醇打開二硫鍵，使亞基分離； 電泳時蛋白質(zhì)向正極移動。電泳時

8、蛋白質(zhì)向正極移動。 分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤電泳）分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤電泳）2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量凝膠電泳法測相對分子量2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量凝膠電泳法測相對分子量abrf=a/b2蛋白質(zhì)的分子形狀與大小蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)膠體穩(wěn)定性的三個要素： 質(zhì)點大小1100nm；帶相同電荷； 形成溶劑化層；穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)膠體的因素： 水化層： 雙電層：3蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀鹽析法：nacl、(nh4)2so4有機溶劑沉淀：乙醇、丙酮重金屬鹽沉淀：hg2+、ag+生物堿

9、與某些酸類沉淀：單寧酸、tca加熱變性沉淀： 3蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分離純化的一般原則蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加蛋白質(zhì)含量與生物活性， 除去不必要的雜質(zhì)蛋白；前處理：細胞破碎粗分級分離：鹽析、等電點沉淀、有機 溶劑沉淀等細分級分離：層析、電泳、結(jié)晶 4蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)下列性質(zhì)將蛋白分離純化：分子大小溶解度電荷吸附性質(zhì)對配體分子的親和力 4蛋白質(zhì)的分離純化透析與超過濾透析與超過濾4蛋白質(zhì)的分離純化透析 通常是將濃縮液裝在一個用賽咯吩（通常是將濃縮液裝在一個用賽咯吩（cellophanecellophane）制造的透析袋內(nèi)，兩端都密封好，然后

10、將透析袋制造的透析袋內(nèi)，兩端都密封好，然后將透析袋懸浮在一個裝有很多緩沖液的容器內(nèi)進行透析。懸浮在一個裝有很多緩沖液的容器內(nèi)進行透析。因為賽咯吩膜是半通透的膜，蛋白質(zhì)等大分子不因為賽咯吩膜是半通透的膜，蛋白質(zhì)等大分子不能透過膜，仍然留在袋內(nèi)，但蛋白質(zhì)周圍的小分能透過膜，仍然留在袋內(nèi)，但蛋白質(zhì)周圍的小分子可以與緩沖液進行交換，通過多次更換透析液，子可以與緩沖液進行交換，通過多次更換透析液，就可除去小分子（如硫酸銨）。經(jīng)硫酸銨分級純就可除去小分子（如硫酸銨）。經(jīng)硫酸銨分級純化、透析的粗分級的蛋白質(zhì)樣品可以通過以下一化、透析的粗分級的蛋白質(zhì)樣品可以通過以下一些常用的分離純化技術(shù)和方法進一步純化和鑒定

11、。些常用的分離純化技術(shù)和方法進一步純化和鑒定。4蛋白質(zhì)的分離純化超 濾 超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點是使用不對超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點是使用不對稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮，不同種類分子的純化以及溶劑子溶液的濃縮，不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和的、非變性的物理交換等。超濾法是一種溫和的、非變性的物理分離方法。分離方法。4蛋白質(zhì)的分離純化超濾離心管切向流超濾器4蛋白質(zhì)的分離純化離心技術(shù) 離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備

12、，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。 密度梯度離心技術(shù)是利用每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自的區(qū)帶。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。4蛋白質(zhì)的分離純化差差速速離離心心differential centrifugation as a first step in protein purification4蛋白質(zhì)的分離純化密度梯度（區(qū)帶）離心密度梯度（區(qū)帶）離心4蛋白質(zhì)的分離純化密度梯度（區(qū)

13、帶）離心密度梯度（區(qū)帶）離心4蛋白質(zhì)的分離純化凝膠過濾凝膠過濾 凝膠過濾層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離凝膠過濾層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離純化的。純化的。 凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。 當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。取決于孔穴的大小和組分分子大小。 分

14、子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。 4蛋白質(zhì)的分離純化凝膠過濾（分子排阻層析）凝膠過濾（分子排阻層析）基于分子大小4蛋白質(zhì)的分離純化利用溶解度差別的純化等電點沉淀（等電點時靜電荷為零，相鄰蛋白質(zhì)分子間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀）鹽析與鹽溶（中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱為鹽溶；鹽析作用主要是大量中性鹽爭奪蛋白質(zhì)疏水表面水分子）有機溶劑分級分離（有機溶劑降低蛋白質(zhì)表

15、面可解離基團的離子化程度，促進蛋白質(zhì)的聚集和沉淀）4蛋白質(zhì)的分離純化利用溶解度差別的純化利用溶解度差別的純化分級沉淀（鹽或有機溶劑）4蛋白質(zhì)的分離純化利用電荷差別的純化利用電荷差別的純化聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦離子交換層析層析聚焦4蛋白質(zhì)的分離純化聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）平板電泳平板電泳4蛋白質(zhì)的分離純化聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）管狀電泳圖譜平板page圖譜4蛋白質(zhì)的分離純化等電聚焦電泳等電聚焦電泳 蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化隨所處環(huán)境酸堿度的變

16、化而變化 。在電場存在下的一定。在電場存在下的一定phph溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極移動而帶負電的蛋白溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極移動而帶負電的蛋白分子將向正極移動，在某一分子將向正極移動，在某一phph時，蛋白分子在電場中不再時，蛋白分子在電場中不再移動，此時的移動，此時的phph值即為該蛋白質(zhì)的等電點。值即為該蛋白質(zhì)的等電點。 等電聚焦等電聚焦(ief(ief）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負極成從正極到負極phph逐漸增加的逐漸增加的phph梯度，處在其中的蛋白分梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等

17、電點的位置子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的上，測出蛋白分子聚焦位置的phph值，便可以得到它的等電值，便可以得到它的等電點。點。4蛋白質(zhì)的分離純化等電聚焦電泳等電聚焦電泳蛋白質(zhì)在具有ph梯度的介質(zhì)中電泳4蛋白質(zhì)的分離純化等電聚焦電泳等電聚焦電泳4蛋白質(zhì)的分離純化二維電泳 19751975年，年，o ofarrell farrell 首先運用雙向電泳技術(shù)將首先運用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出大腸桿菌總蛋白分離出11001100多個蛋白點。后來多個蛋白點。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前

18、，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電分離。目前，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。 二維電泳由第一向等電聚焦二維電泳由第一向等電聚焦(ief)(ief)電泳和第二電泳和第二向向sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)(sds-page)組成，組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。到高分辨率的蛋白圖譜。4蛋白質(zhì)的分離純化二維電泳二維電泳isoelectric

19、 focusing is often combined with sds-page to generate two dimensional gels.4蛋白質(zhì)的分離純化二維電泳的應(yīng)用示例4蛋白質(zhì)的分離純化離子交換層析離子交換層析陽離子交換劑： cm-纖維素：-o-ch2cooh p-纖維素：磷酸基陰離子交換劑： deae-纖維素：二乙基氨基乙基 ae-纖維素：氨基乙基4蛋白質(zhì)的分離純化離子交換層析離子交換層析4蛋白質(zhì)的分離純化4蛋白質(zhì)的分離純化親和層析原理：原理：依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（ligandligand）之間）之間的相互作用來分離。的相互作用來分離。配體配體通常

20、指的是能與另一通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合（一般是非共價結(jié)合）的分個分子或原子結(jié)合（一般是非共價結(jié)合）的分子、基團、離子或原子。但在親和層析中，配子、基團、離子或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合。配體可以是酶體是通過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合。配體可以是酶結(jié)合的一個反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識別結(jié)合的一個反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體，也可以是受體、核酸、細胞器靶蛋白的抗體，也可以是受體、核酸、細胞器等。等。親和層析是分離效率最高的分離方法。親和層析是分離效率最高的分離方法。4蛋白質(zhì)的分離純化親和層析過程示意圖（親和層析過程示意圖（1 1）4蛋白質(zhì)的分離純化親和層析

21、過程示意圖（親和層析過程示意圖（2 2）4蛋白質(zhì)的分離純化親和層析過程示意圖（親和層析過程示意圖（3 3）4蛋白質(zhì)的分離純化親和層析過程示意圖（親和層析過程示意圖（4 4）4蛋白質(zhì)的分離純化4蛋白質(zhì)的分離純化高效液相層析（高效液相層析（hplc） 高效液相色譜（hplc：high performance liquid chromatography ）與普通的色譜技術(shù)不同的是：填料密度高，洗脫液壓力加大，分離效果更好。是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家、生物化學(xué)家等用以解決他們面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少

22、的工具。國際市場調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。4蛋白質(zhì)的分離純化高效液相層析（高效液相層析（hplc） 高效液相色譜的優(yōu)點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。 其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜。 4蛋白質(zhì)的分離純化4蛋白質(zhì)的分離純化高效液相層析（高效液相層析（hplc）high pressure liquid chromatographyhig

23、h pressure limits diffusion and increases interactions with chromatography mediahplc gives very high resolution of protein components4蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)純化過程實例蛋白質(zhì)純化過程實例4蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)的含量測定凱氏定氮法雙縮脲法folin-酚法（lowry法，蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族氨基酸還原磷鉬酸磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍色。 ）紫外吸收法bradford法（考馬斯亮藍染料結(jié)合法）bca法（bisinchoninic

24、acid method）5蛋白質(zhì)的含量測定凱氏定氮法5蛋白質(zhì)的含量測定1.有機物中的氮在強熱和cuso4，濃h2so4 作用下，消化生成（nh4）2so4 反應(yīng)式為： h2so4=so2+h2o+o r. ch.cooh+o=r.co.cooh+nh3 nh3 r.co.cooh+o=nco2+mh2o 2nh3+h2so4=(nh4)2so42.在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出nh3 ，收集于 h3bo3 溶液中。 反應(yīng)式為: 2nh4+oh-=nh3+h2o nh3+h3bo3=nh4+h2bo3-3. 再用已知濃度的hcl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)hcl消耗的量計算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)

25、的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量。5蛋白質(zhì)的含量測定反應(yīng)式為: (nh4)2b4o7+2hcl+5h2o2nh4cl+4h3bo3 5蛋白質(zhì)的含量測定考馬斯亮蘭法（bradford法） 19761976年由年由bradfordbradford建立的考馬斯亮蘭法（建立的考馬斯亮蘭法（bradfordbradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。考法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的?？捡R斯亮蘭馬斯亮蘭g-250g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（染料的最大吸收峰的位置（lmaxlmax），由），由465nm465n

26、m變?yōu)樽優(yōu)?95nm595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。 在在595nm595nm下測定的吸光度值下測定的吸光度值a595a595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。，與蛋白質(zhì)濃度成正比。5蛋白質(zhì)的含量測定5蛋白質(zhì)的含量測定bradfordbradford法的突出優(yōu)點是：法的突出優(yōu)點是：（1 1）靈敏度高，據(jù)估計比）靈敏度高，據(jù)估計比lowrylowry法約高四倍，其最低蛋法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量

27、可達白質(zhì)檢測量可達1mg1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比lowrylowry法法要大的多。要大的多。（2 2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要的測定，只需要5 5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要過程，大約只要2 2分鐘即可完成，其顏色可以在分鐘即可完成，其顏色可以在1 1小時小時

28、內(nèi)保持穩(wěn)定，且在內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5 5分鐘至分鐘至2020分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像最好。因而完全不用像lowrylowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。時間。（3 3）干擾物質(zhì)少。如干擾）干擾物質(zhì)少。如干擾lowrylowry法的法的k+k+、na+na+、mg2+mg2+離子、離子、tristris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edtaedta等均等均不干擾此測定法。不干擾此測定法。5蛋白質(zhì)的含量測定bradfordbradford法的缺點是：法的缺點是：（1 1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香

29、族氨基酸的含量）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此不同，因此bradfordbradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。的偏差。（2 2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、去污劑、 triton x-100triton x-100、十二烷基硫酸鈉（、十二烷基硫酸鈉（sdssds）和）和0.1n0.1n的的naohnaoh。（3 3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beerbeer定律定律進行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的

30、濃進行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。度。5蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)的純度鑒定蛋白質(zhì)的純度鑒定電泳 （等電聚焦、sds-page、page）沉降法hplc溶解度分析n末端分析6蛋白質(zhì)的純度鑒定6蛋白質(zhì)的純度鑒定附錄附錄 蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)組學(xué)研究（proteomeproteome） 知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序列，就可以任意控制人的生老病死嗎？列，就可以任意控制人的生老病死嗎？ 附錄蛋白質(zhì)組學(xué) 基因是遺傳信息的源頭，而功能性蛋白是基因基因是遺傳信息的源頭，而功能性蛋白是基因功能的執(zhí)行體。功能的執(zhí)行體。 基因組計劃的實現(xiàn)固然為生物有機體全體基

31、因基因組計劃的實現(xiàn)固然為生物有機體全體基因序列的確定、為未來生命科學(xué)研究奠定了堅實序列的確定、為未來生命科學(xué)研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，但是它并不能提供認識各種生命活動的基礎(chǔ)，但是它并不能提供認識各種生命活動直接的分子基礎(chǔ)，其間必須研究生命活動的執(zhí)直接的分子基礎(chǔ)，其間必須研究生命活動的執(zhí)行體行體- -蛋白質(zhì)這一重要環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)這一重要環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomicsproteomics）研究即旨在解決這一問題。）研究即旨在解決這一問題。附錄蛋白質(zhì)組學(xué)附錄蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容包括：蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容包括：1.1.蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電

32、泳和二維電泳并結(jié)合泳并結(jié)合westernwestern等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對蛋白質(zhì)進行鑒抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對蛋白質(zhì)進行鑒定研究。定研究。2.2.翻譯后修飾：很多翻譯后修飾：很多mrnamrna表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化，酶原激要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式，因此對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對闡明蛋式，因此對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。白質(zhì)的功能具有重要作用。附錄蛋白質(zhì)組學(xué) 3. 3.

33、蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析物，細胞因子的生物分析/ /配基配基- -受體結(jié)合分析。受體結(jié)合分析?？梢岳没蚯贸头戳x技術(shù)分析基因表達產(chǎn)可以利用基因敲除和反義技術(shù)分析基因表達產(chǎn)物物- -蛋白質(zhì)的功能。另外對蛋白質(zhì)表達出來后在蛋白質(zhì)的功能。另外對蛋白質(zhì)表達出來后在細胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白細胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。質(zhì)功能的了解。clontechclontech的熒光蛋白表達系統(tǒng)的熒光蛋白表達系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)定位的一個很好的工就是研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)定位的一個很好的工具。具。4

34、.4.對人類而言，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)對人類而言，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)于人類的健康，主要指促進分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。于人類的健康，主要指促進分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)可以干預(yù)蛋白質(zhì)- -蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法附錄蛋白質(zhì)組學(xué) 二維電泳二維電泳 酵母雙雜交系統(tǒng)：酵母雙雜交系統(tǒng)：酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)活細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋

35、白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺，在近幾年來得到了廣泛運用。酵母雙雜交系統(tǒng)平臺，在近幾年來得到了廣泛運用。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。大種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白

36、質(zhì)之間的互作，也可以用哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。schematic representations of library and matrix yeast two-hybrid screens. (a) a model of the yeast two-hybrid system. the dna-binding domain (bd) and transcriptional activation domain (ad) from a transcription factor are i

37、ndependently fused with candidate interacting proteins (the bait and prey, respectively). if the bait and prey proteins interact (curved line) within a cell expressing both fusions, the resulting functional transcription factor can bind the promoter of a reporter gene and activate its transcription

38、by interacting with the general transcription machinery (g). (b) a library yeast two-hybrid screen. a collection of preys are screened with a bait of interest by transforming yeast cells with plasmids encoding the constructs in order to isolate its interaction partners. (c) a matrix yeast two-hybrid

39、 screen used to generate a protein-protein interaction network. several baits and preys are arrayed in 96-well microtiter plates and the fusion proteins are brought together by mating. diploids containing both bait and prey are isolated on selective plates and protein-protein interactions are ascert

40、ained by expression of the reporter gene. the dark squares indicate an interaction between the bait given at the end of the row and the prey indicated at the top of the column. 抗體芯片：蛋白組學(xué)研抗體芯片：蛋白組學(xué)研究中一個主要的內(nèi)容就究中一個主要的內(nèi)容就是要研究在不同生理狀是要研究在不同生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下蛋白水態(tài)或病理狀態(tài)下蛋白水平的量變，微型化，集平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗體成化，高通量化的抗體芯片就是一個非常好的芯片就是一個非常好的研究工具，它也是蛋白研究工具，它也是蛋白芯片中發(fā)展最快的芯片，芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益而且在技術(shù)