DNA條形碼技術(shù)在中藥材鑒定中的應(yīng)用

1、    dna條形碼技術(shù)在中藥材鑒定中的應(yīng)用    李笑 譚朝陽(yáng) 徐德宏 孟蕾摘要 dna條形碼技術(shù)是一種新興的分子鑒定方法，它能彌補(bǔ)傳統(tǒng)化學(xué)方法和形態(tài)學(xué)方法鑒定中藥材的不足之處。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，在分析dna條形碼技術(shù)的原理、發(fā)展的基礎(chǔ)上，對(duì)目前一些熱門(mén)的dna條形碼候選序列its、its2、psba-trnh、rbcl、matk展開(kāi)討論，重點(diǎn)分析其在植物類(lèi)和動(dòng)物類(lèi)中藥材鑒定中的應(yīng)用，為中藥材的鑒定提供新的思路。關(guān)鍵詞 dna條形碼;中藥材;鑒定;應(yīng)用 r282.5 a 0517-6611（2020）02-

2、0016-04doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.005開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（osid）：application of dna barcode technology in identification of chinese medicinal materialsli xiao1，tan zhao-yang1，2，xu de-hong1 et al （1.lab of bioengineering，hunan university of chinese medicine，changsha，hunan 410208;2.lab of natur

3、e and effectiveness of chinese medicine，hunan university of chinese medicine，changsha，hunan 410208）abstract dna barcode technology is an emerging molecular identification method that can make up for the shortcomings of traditional chemical methods and morphological methods to identify chinese h

4、erbal medicines.by consulting the literature，on the basis of analyzing the principle and development of dna barcode technology，some popular dna barcode candidate sequences its，its2，psba-trnh，rbcl，matk are discussed，focusing on its application in the identification of chinese herbal medicines in plan

5、ts and animals，and provided new ideas for the identification of chinese herbal medicines.key words dna barcode;chinese herbal medicine;identification;application市面上的中藥材仿冒品和替代品數(shù)量不斷增多，人為不規(guī)范的種植、商家牟利、摻雜造假等種種行為嚴(yán)重危害到了患者的生命安全以及醫(yī)藥相關(guān)人員的信譽(yù)。因中草藥在臨床應(yīng)用上的復(fù)雜性，中草藥基原混淆、質(zhì)量不合格容易導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。以白鮮皮為例，臨床上許多患者由于服用了與植

6、物白鮮相似的偽品中藥材加工成的飲片，導(dǎo)致藥物性肝損傷1。由此可見(jiàn)，中藥材的使用不當(dāng)會(huì)損害機(jī)體健康甚至引發(fā)中毒反應(yīng)。而許多藥材與混偽品之間形態(tài)相似，通過(guò)傳統(tǒng)的理化鑒定方法有較大的難度。因此，有必要建立更加準(zhǔn)確、快速、可靠的中藥鑒定體系和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。1 分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記是以核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，表現(xiàn)了dna水平的遺傳多態(tài)性2。dna 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)相比于傳統(tǒng)鑒定技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在中藥材鑒定方面已被國(guó)內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注3-4。目前一些dna分子標(biāo)記的方法也被逐漸應(yīng)用到中成藥的鑒定中，如單核苷酸多態(tài)性、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna標(biāo)記、突變

7、等位基因特異性擴(kuò)增、簡(jiǎn)單重復(fù)序列、ssr分子標(biāo)記等，各有相應(yīng)的適用范圍。其中簡(jiǎn)單重復(fù)序列促進(jìn)了中藥鑒定技術(shù)的發(fā)展5。ssr分子標(biāo)記多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)、數(shù)量豐富，對(duì)基因組有很好的覆蓋性6，同時(shí)ssr分子標(biāo)記適用于沒(méi)有詳細(xì)背景材料的中藥材7，方便構(gòu)建中藥指紋圖譜。而新技術(shù)雙分子標(biāo)記法能滿足現(xiàn)階段在分子水平上同時(shí)研究中藥的種類(lèi)和質(zhì)量差異8，獲取物種完整的遺傳信息，彌補(bǔ)單一鑒別方法的不足9。dna條形碼技術(shù)也屬于分子標(biāo)記技術(shù)的范疇，能夠快速地識(shí)別物種信息，為中藥鑒定提供了便利。2 中藥材dna條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則2.1 dna條形碼的定義及原理加拿大動(dòng)物學(xué)家paul hebert

8、 t最早提出dna條形碼概念，他通過(guò)試驗(yàn)分析對(duì)動(dòng)物界的線粒體編碼區(qū)基因進(jìn)行比較，98%的物種的種內(nèi)變異較低，種間平均變異達(dá)11.3%，在昆蟲(chóng)、魚(yú)、鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物中也有很高的鑒別效率10。因此，他們將商場(chǎng)用以區(qū)分不同商品的條形碼概念引入中藥鑒定，為每一種不同的中藥材構(gòu)建相應(yīng)的條形碼。通過(guò)掃描該條形碼，就能快速獲得完整的中藥材信息，據(jù)此提出的使用單一短的基因片段來(lái)鑒定物種，把這種小片段基因序列稱作物種dna條形碼，并提出為全球編碼的計(jì)劃11。dna條形碼是指一段片段較短相對(duì)保守的序列，既有一定的保守性不易突變，又存在一定的可變性用來(lái)區(qū)分近緣物種。dna條形碼技術(shù)應(yīng)用于鑒定中藥材，不受物種不同時(shí)期生長(zhǎng)狀態(tài)

9、的影響。2.2 dna條形碼技術(shù)的發(fā)展dna條形碼從基因水平來(lái)鑒定不易區(qū)分的物種，結(jié)果穩(wěn)定可靠，為道地藥材的鑒定與種質(zhì)資源的篩選提供了新的方法。因此，大量研究人員開(kāi)始尋找動(dòng)植物dna條形碼的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。高通用性、高效篩選能力成為選擇dna條形碼的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。早在2003年，提出dna條形碼概念的生物學(xué)家hebert paul d通過(guò)試驗(yàn)研究表明條形碼coi序列片段短，通用性好且鑒定效率高12。后許多學(xué)者認(rèn)同了這一說(shuō)法，通過(guò)試驗(yàn)比較將大小為650 bp的coi認(rèn)定為動(dòng)物通用的條形碼序列，并在2008年加拿大的學(xué)術(shù)會(huì)議上引入了超級(jí)條形碼的概念13。動(dòng)物具有較高的進(jìn)化速率，因此，動(dòng)物線粒體

10、coi序列的條形碼具有廣泛性和通用性。目前在國(guó)內(nèi)，陳士林教授所帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事中藥資源的研究工作，應(yīng)用條形碼技術(shù)對(duì)大量動(dòng)植物藥材進(jìn)行鑒定，相比于之前藥工憑借經(jīng)驗(yàn)鑒定中藥材、區(qū)分相似品和易混淆品有良好的效果。植物藥材由于生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜，進(jìn)化速率低，因此在選擇dna條形碼中很少存在單獨(dú)的條形碼片段來(lái)滿足各種不同的植物。大量中藥材dna條形碼分子是以its2為主體的鑒定體系14，其中植物類(lèi)中藥材選用its2為主體序列，psba-trnh為補(bǔ)充序列，研究表明its2在鑒定大部分植物中均有良好的鑒定效果。psba-trnh序列適用范圍低于its2序列，主要用于闕類(lèi)植物的鑒定15。2.3 鑒定方

11、法和流程2.3.1 材料預(yù)處理。中藥材容易發(fā)生降解以及產(chǎn)生醌類(lèi)有毒物質(zhì)。因此在提取dna的過(guò)程中需要減小內(nèi)生菌的污染。常用的方法有加入pvp粉末、在提取dna前適當(dāng)用酒精消毒。2.3.2 dna的提取。高質(zhì)量的dna是進(jìn)行dna條形碼研究的必要前提和關(guān)鍵環(huán)節(jié)16。植物組織中含有大量多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物。ctba法可以快速提取植物的總dna。將新鮮的葉片在液氮中研磨，以機(jī)械力破碎細(xì)胞壁，再加入ctba使細(xì)胞膜破裂，同時(shí)將核酸與植物多糖等雜質(zhì)分開(kāi)。再經(jīng)氯仿提取處理去除蛋白，即可得到相應(yīng)的dna17。植物類(lèi)的中藥材種類(lèi)繁多，除了ctba法之外，還可以采取sds法、高鹽低ph法

12、、改良pvp法等18 。例如提取菟絲子的dna，采用4種不同的方法進(jìn)行提取后，對(duì)dna的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良pvp法提取的dna得率較高19。ctba法相比于改良pvp法具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但dna的得率低于改良pvp法。因此，應(yīng)該根據(jù)不同的樣品、不同的試驗(yàn)需求來(lái)選用不同的方法。2.3.3 pcr擴(kuò)增。對(duì)植物提取的dna進(jìn)行體外大量復(fù)制，通過(guò)適宜的條件得到相應(yīng)的pcr產(chǎn)物。2.3.4 pcr產(chǎn)物純化與序列拼接。將pcr 擴(kuò)增條帶的樣品進(jìn)行膠回收純化后，送測(cè)序公司進(jìn)行 dna 序列測(cè)定，最終獲得目的片段的雙向序列。2.3.5 結(jié)果判定。將獲得的序列在

13、genbank數(shù)據(jù)庫(kù)用blast方法進(jìn)行結(jié)果判定，結(jié)果中相似性最高的序列對(duì)應(yīng)的物種為查詢序列最接近的物種20。通過(guò)mage軟件構(gòu)建物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，比較物種種內(nèi)和種間的遺傳距離。3 dna條形碼在植物類(lèi)藥材鑒定中的應(yīng)用3.1 its序列和its2序列對(duì)植物類(lèi)藥材的鑒定its序列可使整個(gè)基因組內(nèi)的不同拷貝趨于一致，常用于系統(tǒng)進(jìn)化研究和物種鑒定21。its序列位于rrna處，其中編碼區(qū)（5.8s，18s，28s）序列高度保守又具有足夠的變異，適用于鑒定近緣關(guān)系較高的物種。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)its1和its2保守能力低于編碼區(qū)，但也具有一定的鑒別能力，適用于種間差異大的物種。因此its序

14、列被認(rèn)為適用于鑒定植物藥材的熱門(mén)條形碼之一。但its序列也存在著一些不足之處，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)its序列缺少通用引物，導(dǎo)致pcr不易擴(kuò)增22。its序列較長(zhǎng)，在pcr擴(kuò)增的過(guò)程中發(fā)生堿基缺失突變的概率較大，會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性造成一定的影響。為了彌補(bǔ)its序列的不足，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)its2序列pcr擴(kuò)增效率高且堿基突變率低。its2 序列對(duì)鑒定材料的要求不高，其序列相比 its 序列短，長(zhǎng)度僅有300 bp左右，而且在基因組中適合于屬、種水平的鑒定23。its2序列滿足了dna條形碼選擇序列的標(biāo)準(zhǔn)（ 進(jìn)化速率快，有足夠的變異位點(diǎn)） ，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者將its2 序列作為鑒別物種的主要條形碼，特別是在

15、真菌類(lèi)物種的鑒別方面24。its2序列信息量大且相對(duì)穩(wěn)定，在物種水平上變異快，序列位點(diǎn)較多，其中包括變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)、信息位點(diǎn)等，為dna條形碼提供了大量信息25。its2序列在植物鑒定中越來(lái)越受到重視，陳士林等20對(duì)753屬4 800種植物6 600份樣品進(jìn)行研究，得出its2序列在種水平的鑒定成功率達(dá)92.7%。its2序列物種識(shí)別率和物種變異率較高，種內(nèi)變異小而種間變異大，特別適合于在物種水平鑒定中藥材。同時(shí)its2還可自我聚合形成二級(jí)結(jié)構(gòu)26，通過(guò)莖環(huán)的形狀與數(shù)目來(lái)區(qū)分不同的物種。此外，its2對(duì)于降解嚴(yán)重的材料也有一定的鑒定能力，因此its2的應(yīng)用更具有廣泛性。3.2 p

16、sba-trnh序列對(duì)植物類(lèi)藥材的鑒定psba-trnh序列對(duì)于刺五加科的植物有較好的鑒定能力。通過(guò)k2p遺傳距離法、相似性搜索算法和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果均顯示，基于psba-trnh序列能直觀有效地鑒定竹茹、天竺黃各基原及其近緣物種。竹茹、天竺黃各基原及其近緣物種存在特定的堿基缺失27-28，且psba-trnh序列鑒定蘭科植物效率高達(dá)90%，但psba-trnh序列在鑒別非同屬植物上效率較低29。因此，psba-trnh序列通常被認(rèn)為是鑒定植物的輔助條形碼。3.3 其他條形碼序列除了its序列、its2序列和psba-trnh序列，matk和rbcl序列也是目前廣泛用于鑒

17、定植物的熱門(mén)條形碼序列。matk和rbcl序列均屬于片段較長(zhǎng)的條形碼，rbcl序列適用于區(qū)分相似程度小、科以上等級(jí)的植物鑒別。如rbcl序列適用于鑒別雞血藤及其混偽品30。matk序列適用于鑒別種間變異較小的蘭科類(lèi)植物31，還可單獨(dú)鑒定植物藥材。matk序列在蛋白編碼基因中進(jìn)化速率快32。在常用的pcr擴(kuò)增體系中，matk+ rbcl序列和psba-trnh序列可組合使用鑒別33。生命條形碼聯(lián)盟植物工作組在2009年審定通過(guò)matk和rbcl基因片段為植物的核心條形碼， psba-trnh和its基因片段為補(bǔ)充條形碼34。植物在其進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化速率低于動(dòng)物，因此推薦使用組合條形碼來(lái)鑒別植物藥材

18、，共同提高鑒定效率。4 dna條形碼在動(dòng)物類(lèi)藥材鑒定中的應(yīng)用dna條形碼技術(shù)在鑒定植物藥材方面已有大量研究數(shù)據(jù)，但在動(dòng)物類(lèi)藥材有關(guān)方面的研究較少，對(duì)混偽品及瀕危名貴動(dòng)物藥材的研究不足35。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)始著重于大力推動(dòng)dna 條形碼鑒定動(dòng)物類(lèi)藥材的研究進(jìn)展。動(dòng)物類(lèi)中藥材主要分布在節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、脊索動(dòng)物門(mén)、環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)、軟體動(dòng)物門(mén)、棘皮動(dòng)物門(mén)等36。動(dòng)物類(lèi)藥材由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有著大量蛋白質(zhì)分子，對(duì)于特殊的組織樣本還需要紫外殺菌處理。傳統(tǒng)的鑒定方法雖然簡(jiǎn)單快速但缺乏準(zhǔn)確性，dna條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒別動(dòng)物類(lèi)藥材種類(lèi)及其混偽品37。常用分析方法包括種內(nèi)種間遺傳距離計(jì)算、序列對(duì)比、構(gòu)建系統(tǒng)

19、發(fā)育樹(shù)等38。5 dna 條形碼中藥鑒定應(yīng)用中存在的問(wèn)題dna條形碼技術(shù)在鑒定中藥材方面，因其dna序列獨(dú)一無(wú)二的特性，有著傳統(tǒng)鑒定方法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，但也存在著一些局限性。對(duì)于一些特定的動(dòng)植物藥材，dna無(wú)法區(qū)分具體的用藥部位25。dna條形碼技術(shù)很大程度取決于提取dna的質(zhì)量，目前尚未有很好的辦法完全保證提取dna的質(zhì)量滿足鑒定的要求，許多中藥材在保存運(yùn)輸過(guò)程中容易發(fā)生褐變、霉變。采用新鮮植物葉片作為鑒定材料能否攻克 dna 降解和斷裂問(wèn)題，還需要進(jìn)一步實(shí)踐和驗(yàn)證39。對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的中藥材樣品中保留的片段較小，特別是對(duì)飲片或加工后的藥材鑒定非常困難40。因此，在樣品采集和貯藏

20、過(guò)程中要盡可能做到規(guī)范，防止dna出現(xiàn)嚴(yán)重降解，在分子鑒定中要盡量使用植物新鮮葉片去提取dna，確保在dna條形碼鑒定過(guò)程中用于擴(kuò)增dna 模板量充足。另外，加強(qiáng)在基因水平上的研究，獲取更豐富的堿基序列，不斷優(yōu)化條形碼質(zhì)量，從而可以選擇片段更小的基因作為 dna 條形碼41。通用性越好的條形碼鑒定物種的類(lèi)別越多，但尚未存在適用于所有動(dòng)植物的通用條形碼。另外，dna條形碼對(duì)于天然礦物類(lèi)的藥材無(wú)法進(jìn)行鑒別，因此dna條形碼技術(shù)仍需要與傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)合，才能在中藥材鑒定中做到全面、準(zhǔn)確42。另外dna條形碼技術(shù)只能做到藥材真?zhèn)舞b別，而對(duì)于解決藥材質(zhì)量的評(píng)定還存在很大困難43。6 展望如今d

21、na條形碼已經(jīng)大量應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域，不僅僅是在鑒定中藥材方面，對(duì)于植物進(jìn)化、系統(tǒng)分類(lèi)、保護(hù)物種多樣性也有著重要意義44。dna條形碼作為一種新型的分子鑒定技術(shù)，因其快速、簡(jiǎn)便、鑒別度高等優(yōu)點(diǎn)在中藥鑒定領(lǐng)域處于高速發(fā)展的趨勢(shì)。中藥在性狀發(fā)生改變加工成飲片的狀態(tài)下也不影響鑒別，擴(kuò)大了鑒定樣本的容量。引物序列的通用性，可實(shí)現(xiàn)dna條形碼的流程化和規(guī)范化，僅僅通過(guò)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)人員即可完成批量鑒定。然而新的技術(shù)也必然存在著不完善的地方，單一靠dna條形碼技術(shù)無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥來(lái)源的控制45。許多通用引物在擴(kuò)增過(guò)程中易發(fā)生堿基缺失突變，并且在 pcr 擴(kuò)增過(guò)程中也存在擴(kuò)增失敗的情況46。在常用鑒定植物的5對(duì)條

22、形碼中，its2序列對(duì)大多數(shù)植物可以進(jìn)行鑒定，但也仍存在不少植物鑒定效果不理想或不能鑒定的情況47。因此，要逐步完善dna 條形碼鑒定體系需要多種序列進(jìn)行補(bǔ)充。在鑒定中藥材的過(guò)程中，應(yīng)充分整合動(dòng)植物類(lèi)藥材的遺傳信息dna，及其藥材性狀、組織或細(xì)胞的顯微特征等，然后按照相應(yīng)的分析方法對(duì)中成藥原料藥材或未知藥材進(jìn)行多角度、多層次的鑒別，更加精確化、客觀化地鑒定中藥材48。中藥材的質(zhì)量不僅關(guān)系到整個(gè)中醫(yī)中藥行業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，更是向海內(nèi)外弘揚(yáng)我國(guó)中醫(yī)文化的重要基礎(chǔ)和必要條件。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，科技手段的日新月異，人們能夠從微觀的角度來(lái)鑒定中藥材的質(zhì)量，建立更加優(yōu)越的中藥材質(zhì)量檢控體系。

23、dna條形碼技術(shù)載入中國(guó)藥典至今，因其獨(dú)特的鑒定優(yōu)勢(shì)已成為鑒定中藥材的重要手段之一。在大力推進(jìn)dna條形碼技術(shù)發(fā)展的同時(shí)，也應(yīng)不斷創(chuàng)新發(fā)展更多的鑒定方法，來(lái)保證中藥材使用的安全性和有效性，使我國(guó)的中醫(yī)藥事業(yè)持續(xù)穩(wěn)步上升。參考文獻(xiàn)1 黃奕雪，郭玉明，周永峰，等.基于整合證據(jù)鏈的白鮮皮粉末致肝損傷病例實(shí)驗(yàn)研究j.中國(guó)中藥雜志，2017，42（3）：600-606.2 jiang c，yuan y，liu g m，et al.est-ssr identification of lonicera japonicathunb.j.acta pharmaceutica sinica，2012，47（6）：

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36、romatography fingerprints for the authentication of botanicals in herbal medicinal productsj.evidence-based complementary and alternative medicine，2017，2017：1-28.36 hawkins j，de vere n， griffith a， et al. using dna metabarcoding to identify the floral composition of honey：a new tool for investigating honey bee foraging preferencesj.plos one，2015，10（8）：1-20.37 fet v，graham m r，webber m m，et al.two new species of euscorpius （scorpiones：euscorpiidae） from bulgaria，serbia，and greecej.zootaxa，2014，82（12）：83-105.38 ward r d，holmes b h，ohara t d.d