芯片在皮膚研討中的實用性

1、芯片在皮膚研討中的實用性QPCR芯片基本原理及相關應用每張 QPCR芯片如同上百個 QPCR微反應池的集成 , 每個微反應池都固定有基因特異性引物 , 當加入含有模板和熒光基團的 QPCR反應體系后 , 在相同的反應條件下 , 不同的基因都能同時進行特異性擴增 , 每個微反應池的位置信息就代表了某個特定基因 , 利用熒光信號的積累實時監(jiān)測每個微反應池中 PCR反應的過程 , 最后通過標準曲線就能同時對上百個基因 mRNA或 cDNA進行準確定量分析。與基因芯片相比 ,QPCR芯片的通量顯著減低 , 一次至多檢測 96 個或 384 個基因 ,基本相當于基因芯片通量的 1%,但是 QPCR芯片的

2、擴增對象經過仔細選擇 , 是某一組織或病變類型高度相關的基因 , 更便于數(shù)據的分析處理 , 檢測基因還可以隨研究需要加以改動 , 便于操作 , 而且價格比較低廉?；蛐酒?QPCR芯片的原理不同 , 但對于基因表達譜而言 , 他們的檢測對象 (mRNA或 cDNA)到實驗結果 ( 表達豐度 ),QPCR與基因表達芯片都高度一致 , 許多研究者都把這兩種方法作為互相印證的手段 , 而對于幾十個甚至幾百個基因的表達豐度檢測 ,QPCR技術完全可以取代基因芯片?；蛐酒ㄟ^對來源于不同個體 ( 正常與患者 ) 、不同組織或不同發(fā)育階段組織細胞內的 mRNA(經逆轉錄后產生的 cDNA)進行檢測 ,

3、 可以對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性等進行綜合的分析與判斷 , 迅速將某個或幾個基因與病變起來 , 也為進一步研究基因間相互作用關系提供參考。那么中等通量的 QPCR技術是否能夠解決同樣的問題呢 ?答案是肯定的。計算機預測是將基因表達水平的數(shù)據與分子信號過程進行的關鍵步驟。 目前廣泛運用的軟件是根據基因表達量的變化 , 計算機結合已知信號通路的信息 , 將“宏觀表型”與分子信號過程結合。由于這一軟件預測的基礎是已知信號過程 , 并不能預測新的未知信號過程 , 所以對基因芯片的海量數(shù)據的利用率有限。 而在 QPCR芯片的設計過程中 , 研究者依據已知的信號過程選擇檢測對象

4、 , 盡管選擇的基因總數(shù)不多 ,但可能都是預測軟件的參考基因 , 同樣會得到較好的結果。在當今生物科學和醫(yī)學領域 ,QPCR作為一種新型實用研究工具得到了越來越高度的重視 , 其使用量逐年上升 , 但是 QPCR芯片技術的應用才剛剛處于起步階段。 有關學者開始利用 QPCR 芯片技術進行多領域醫(yī)學研究 , 取得了有突破性意義的成果。 , 等認為雌激素天然衍生物 2- 甲基雌二醇作為 (2-me-thoxyestradiol,2ME), 在臨床試驗中是乳腺癌一個重要的評價對象。他們在兩種治療組中通過 QPCR芯片技術測試鑒定了 Dox 細胞毒性單獨處理和協(xié)同 2ME處理后細胞的基因表達差異。 其

5、研究主要目標是評估 2- 甲基雌二醇在對阿霉素多耐藥性乳腺癌細胞 (MCF-7/Dox) 產生的調節(jié)影響及其潛在的作用機理。 IrmaAiroldi,EmmaDiCarlo,ClaudiaCocco 等認為IL-12RB2 在人類 B 細胞惡性腫瘤中是最為腫瘤抑制基因存在作用的。大鼠 IL-12基因敲出后自然產生了 B 細胞惡性腫瘤 , 而且有了肺上皮細胞腫瘤。但是 IL-12 沒有能力對表達 IL-12 受體的 B16 黑色素瘤細胞有直接作用。他們利用 QPCR芯片對大鼠 IL-12 基因正常組和敲出組進行測試 , 發(fā)現(xiàn) IL-12 能通過抑制血管生成來降低表達 IL-12 受體的 B16

6、細胞的致瘤性。 AndreasHald,BirgitteRono 等認為除了在宿主防御方面表現(xiàn)明顯的重要性 , 巨噬細胞已經被證明在不同的病態(tài)條件 , 包括慢性炎癥、動脈粥樣硬化和癌癥中扮演一個有害的作用。而巨噬細胞活化和遷移與細胞外基質降解密切相關。這個過程可以通過多個蛋白水解酶完成。在這項研究中 , 他們利用 QPCR芯片進行分析 , 發(fā)現(xiàn) LPS誘導基質金屬蛋白酶的表達 , 同時降低基質金屬蛋白酶抑制劑的表達。 此外 , 基因間的比較的表達水平相關的蛋白酶透露他們之間存在較大的差異基因表達水平 , 凸顯了巨噬細胞的基因表達調控的復雜性。 除了這些文章還有學者分別對病原微生物檢測、 炎癥反

7、應研究11 等方面進了相關研究 , 得到了很好的研究成果。QPCR芯片在皮膚科學中的應用前景在皮膚科學研究中 , 被毛突變小鼠都是用來研究人類同源基因疾病良好的動物模型。國內外研究者已獲得了 20 多個被毛突變系小鼠 , 如在皮膚、免疫及腫瘤領域得到廣泛運用的裸小鼠 12; 表皮病變引起被毛異常的 hr 小鼠和 ic 小鼠 13; 章金濤等的豫醫(yī)無毛小鼠 14; 李善如等發(fā)現(xiàn)的被毛突變無毛小鼠 15 等等。通常認為毛發(fā)多少與毛囊數(shù)量及毛囊發(fā)育周期相關 , 許多研究集中在毛囊本身及毛囊與皮膚微環(huán)境信號分子的相互關系上 , 如 hid 和 sa 等基因直接作用于毛球 , 引起毛發(fā)發(fā)育障礙 16,

8、而經過皮膚病理學家 JohnSundberg 博士的鑒定 ,snthr-1Bao 稀毛小鼠皮膚的主要病變是過度角化 , 導致毛發(fā)生長困難 , 毛囊的數(shù)目并未顯著減少、主要形態(tài)結構基本正常。因此 ,snthr-1Bao 小鼠和 hr 等小鼠一樣 , 是表皮角化、毛發(fā)阻生、皮膚慢性損傷并發(fā)無菌性炎癥的理想模型。僅從組織病理學來看 ,snthr-1Bao 稀毛突變小鼠皮膚的原發(fā)病變與人類 Alagile 綜合癥比較相似。 Alagile 綜合癥為常染色體隱性遺傳性疾病 , 臨床表現(xiàn)為頭皮斑禿和全身廣泛毛發(fā)稀少 , 性腺功能減退 , 身材發(fā)育延遲等 ; 病組織理表現(xiàn)為表皮輕度棘皮病樣改變 , 角化過度

9、而深入毛孔形成角栓 , 但目前該病分子機制尚未完全清楚 17, 需要開發(fā)出相應的模型進行分子水平上的研究?！捌つw表達關鍵基因 QPCR芯片”可以為這方面的研究提供了一種新的嘗試。 從 QPCR芯片開發(fā)的角度 ,snthr-1Bao 稀毛小鼠也是待開發(fā)的“皮膚表達關鍵基因 QPCR芯片”很好的試驗對象 , 可以為芯片的設計、優(yōu)化及將來的推廣應用提供了最直接的檢驗。再例如在皮膚科學中 , 瘢痕疙瘩是在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細胞過度增殖和膠原過度分泌所致的病理性瘢痕 , 目前尚無確切有效的藥物。眾多學者通過大量基礎實驗研究和臨床證據表明 , 瘢痕疙瘩的發(fā)生機理與多個基因的功能活動密切相關。 Smi

10、thJC,BooneBE,OpalenikSR18 等通過使用 QPCR研究發(fā)現(xiàn)降低 Wnt 信號表達的多種抑制因素對瘢痕疙瘩成纖維細胞表面這個基因的作用。 同時發(fā)現(xiàn)在正常細胞中的誘餌受體 IL-13R 2 是低表達 , 在瘢痕疙瘩中幾乎不存在。得到QRT-PCR證實的有用結論是 , 支持在瘢痕疙瘩治療中提高 IL-13 的活性。 Chang等 .(20XX)19 通過研究發(fā)現(xiàn) HOX基因在發(fā)育的胚胎階段有重要作用 , 能夠調節(jié)人的分化細胞 , 包括人類的真皮纖維母細胞 , 不同的 HOX基因表達可能成為組成瘢痕疙瘩的惡性表型。 魏斌 , 范金財?shù)?20 運用 RNAi 干擾正常皮膚成纖維細胞前列腺素內過氧化物合酶 2(PTGS2)基因的表達 , 利用 realtimeRT-PCR 驗證 siRNA沉默效果 ; 應用全基因組芯片檢測基因表達譜變化。 檢測到與 PTGS2基因相關的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同發(fā)揮作用的相關基因 , 證明 PTGS2與瘢痕疙瘩的發(fā)病機制有著密切的關系 , 為治療瘢痕疙瘩提供了一個潛在的候選靶點。BockO,YuH,ZitronS21 研究了 beta1-3 和它們的受體 IandII 對皮膚纖維原細胞的影響。其他的一些基因 , 包括 IGFBP-2,IGFBP-5,FZD7,HOXD,STAT1,IGFBP-3和HOXA,都位于染色體臂