β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育及玉米芯的誘導(dǎo)作用的研究（可編輯）

1、-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育及玉米芯的誘導(dǎo)作用的研究 北京化工大學(xué) 碩士學(xué)位論文 -葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育及玉米芯的誘導(dǎo)作用研究 姓名：王春麗 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士 專業(yè)：生物化工 指導(dǎo)教師：陳暢 20100606 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 D葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育 及玉米芯的誘導(dǎo)作用研究 摘要 p一葡萄糖苷酶是纖維素酶組分之一，在纖維素降解過程中可以去除纖 維二糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用從而有效的提高纖維 素降解效率。此外，該酶還被應(yīng)用于果汁增香、食品原料脫毒等方面。本 研究通過紫外誘變以及原生質(zhì)體誘變選育黑曲霉c1葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株。 通過對(duì)誘變株的碳、氮源優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)了玉米芯

2、可明顯促進(jìn)酶的分泌，并初 步研究了玉米芯對(duì)p葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)作用。得到的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1以黑曲霉CGMCC3316為出發(fā)菌，通過紫外誘變篩選得到一株 酶活力提高15的黑曲霉3-3M，其傳代穩(wěn)定性良好。 2確定了黑曲霉3-3M原生質(zhì)體釋放與再生的條件。菌絲采用固體玻 璃紙平板法培養(yǎng)24h后，以06M氯化銨O1 M，pH60檸檬酸鈉緩沖液 作為滲透壓穩(wěn)定劑。破壁酶組合為蝸牛酶和纖維素酶，其濃度均為5 h。黑曲霉33M原生質(zhì)體再生所用平板 mgmL，酶解溫度32。C，處理4 為高滲察氏培養(yǎng)基，采用傾倒法培養(yǎng)，可獲得90的再生率。 3以黑曲霉3-3M為出發(fā)菌株，通過原生質(zhì)體紫外誘變，篩選得到一

3、株p葡萄糖苷酶活力為234 提高23。經(jīng)驗(yàn)證，其遺傳穩(wěn)定性良好。通過對(duì)黑曲霉60B3D的發(fā)酵特 性進(jìn)行研究，并與出發(fā)菌株 CGMCC3316和黑曲霉3-3M 進(jìn)行比較， 結(jié)果表明：黑曲霉60B一3D的優(yōu)良特性在發(fā)酵60h后開始呈現(xiàn)出來，比出 I 摘要 發(fā)菌株具有更強(qiáng)的蛋白分泌能力。 4通過對(duì)黑曲霉60B3D碳、氮源的初步優(yōu)化，結(jié)果表明最佳碳源 為玉米芯，最佳氮源為硫酸銨和酵母粉，p葡萄糖苷酶活力最高可達(dá)到 6386IUmL。 5比較了不同碳源對(duì)黑曲霉CGMCC 3316分泌p葡萄糖苷酶的作 用效果，結(jié)果表明玉米芯的效果最好，這與在黑曲霉60B3D中所得到的 結(jié)論一致。在此基礎(chǔ)上，探索了玉米芯對(duì)

4、p葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)作用。結(jié) 果表明玉米芯中的水溶性成分 WS 可明顯誘導(dǎo)p一葡萄糖苷酶的分泌， WS的濃度對(duì)其作用效果影響不大；水不溶性成分 WIR 也利于p葡萄 糖苷酶的合成。 關(guān)鍵詞：p葡萄糖苷酶，黑曲霉，原生質(zhì)體誘變，選育，玉米芯，誘導(dǎo) 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 SCREENINGoFSTRAINPRoDUCING AND oNTHE STUDIES IB-GLUCOSIDASE INDUCTIoNEFFECTSoFCoRNCoB ABSTRACT in isoneofthe ofcellulaseItis 3-glucosidase components important forit

5、canremovetheinhibitionofcellobioseintheEG cellulose-degrading andCBHItalsohaswide infood for the applicationsindustryreleasing aromatic and thetoxic intherawmaterials substances compoundsremoving Inthis 60B一3Dwasselected study,Aniger through mutation，using protoplast the was fromultravioletirradiati

6、on 3-3Mas strain，which Aniger parent got mutationSeveralcarbonsourceswere to this and enzyme comparedproduce for thecorncobwasfoundtobethebestinducer IB-glucosidaseproduction Thenthe was forrelevant inductioneffectofcomcobstudied wererare reports Themainresultswereasfollowed： 1 CGMCC336wasselectedas

7、the 1Aspergillusniger parentstrain，a 3-3Mwas mutant screenedafter 1 of 3-3Mwas95+10 13-glucosidaseactivityAniger IUmL，improvedby III 英文摘要 15 2Theconditionsof formationand of protoplast regenerationAniger collected onthe 3-3MwerealsostudiedThe was after mycelium culturing for24hinthePDA wastreatedwit

8、h1 0snailase 5 cellophanes plate，then 4hat 06M asthe NH4CI mgmL andcellulase 5 32"C，using medmL for acidbufferasbuffer stabilizerandthecitrate systemTheregeneration mediumwas mediumwith06MNaClasstabilizer Cazpeks 3The of3-3MweremutatedwithUVandamutant60B一3D protoplasts of60B一3D 234 an Wasscreen

9、edThe was IUmL，with 13-glucosidase of tothe 3-3MThefermentation improvement23comparingAniger ofmutartwasalsostudiedItwasfoundthatthemutantcouldsecrete process thanthe strain more protein parent 4Theimum of60B一3Dreached6386IUmL 13-glucosidaseacitivity most aftercarbonand wasfoundtobethe nitrogenoptim

10、izationCorncob werethecombination efficientcarbon the source source，and propernitrogen of extractandammoniumsulfate yeast 5Severalcarbonsourceswere to inA comparedproduce13-glucosidase bethe source 3316andcorncobwasalsofoundto mostefficientcarbon niger thatwehad inthe 60B一3D Thisresultwasconsistentw

11、ith case got ofAniger effectcorncobwasfurther results Sotheinductionof investigatedThe showedthatthesolubleof inducethe partscorncob ws could13-glucosidase andtheconcentrationofWShadlittle ontheinduction impact production IV 北京化_丁大學(xué)碩十學(xué)位論文 to effectThewaterinsolubleresidualof alsofound partcorncob WI

12、R was bebeneficialfor in 3316 13-glucosidasesynthesisAniger KEY mutation， WORDS：13-glucosidase，Aspergillusniger,protoplast screening，corncob，induce V 縮略詞說明 縮略詞說明 BG p-葡萄糖苷酶 pl，4-glucosidase EG p-l，4內(nèi)切葡聚糖酶 endo?131,4一glucanase CBH p-l，4葡聚糖酶 pl，4一glucancellobiohydrolase of WS soluble comcob 玉米芯中水溶性成分

13、water parts residual 膿 insoluble 玉米芯中水不溶性成分 water partsofcorncob pNPO 對(duì)硝基苯基13 Aviccl cellulose 微晶纖維素 microcrystalline CMC 羧甲基纖維素鈉 carboxymethylcellulose DNS 3，5二硝基水楊酸 3，5dinitrosalicylicacid PDA dextrose agar 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 potato X¨ 北京化工大學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明： 所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立 進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)

14、注明引用的內(nèi)容外，本論文不含 任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重 要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲 明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 作者簽名： 王查回 日期： 望堅(jiān)哆!墨 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 學(xué)位論文作者完全了解北京化工大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文的 規(guī)定，即：研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬北京 化工大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件 和磁盤，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部 或部分內(nèi)容，可以允許采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué) 位論文。 保密論文注釋：本學(xué)位論文屬于保密

15、范圍，在上年解密后適用本授 權(quán)書。非保密論文注釋：本學(xué)位論文不屬于保密范圍，適用本授權(quán)書。 作者簽名： 日期： 至查雯 塵!竺：絲 導(dǎo)師簽名：避絲 日期：三望絲!魚：星 一一 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章文獻(xiàn)綜述 隨著不可再生的化石能源的日漸枯竭，越來越多的研究都集中到了新能源的開發(fā) 和利用。生物質(zhì)能由于其來源豐富，成本低廉和可再生性而備受青睞。纖維素作為地 球上最為豐富的可再生資源，為生物質(zhì)能提供豐富的來源川。據(jù)報(bào)道，全球每年的光 合作用產(chǎn)生的纖維素總量可達(dá)10¨t。但是，纖維素是由葡萄糖分子以1，4一糖苷鍵結(jié) 合而成的線狀高分子聚合物。纖維素分子難以直接被利用，需經(jīng)過降解成小

16、分子糖類 物質(zhì)后才可被利用。纖維素可直接通過酸、堿處理或通過酶法處理降解。酶法降解纖 維素由于無污染、低能耗的優(yōu)點(diǎn)而逐漸取代酸、堿處理方法。在利用纖維素酶降解纖 維素的過程中，作為纖維素酶組分之一的B葡萄糖苷酶可將由葡聚糖酶降解得到的纖 維二糖水解成葡萄糖，從而去除其對(duì)葡聚糖酶的抑制作用，因而有效提高纖維素的降 解效率。 除了在纖維素降解中的應(yīng)用外，p葡萄糖苷酶還有多種用途。在果汁行業(yè)中，人 們利用B一葡萄糖苷酶對(duì)糖苷鍵的作用增加果汁的香氣【2】；在食品行業(yè)中，人們利用它 對(duì)一些生氰物質(zhì)降解以脫除食品加工原料的毒性【3】。因此，對(duì)p葡萄糖苷酶的研究具 有重要意義。 II弘葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)

17、弘葡萄糖苷酶 EC 解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵，從而釋放葡萄糖的酶【4】。p葡萄糖苷酶的 相對(duì)分子量一般在40-,250 KD之間。不同來源的p葡萄糖苷酶的相對(duì)分子量由于其 結(jié)構(gòu)和來源不同而有較大差異。同一菌株也可能由于培養(yǎng)條件的不同而分泌不同類型 的p葡萄糖苷酶。在土曲霉中，經(jīng)純化后可得到三種p葡萄糖苷酶，它們具有不同的 分子量和等電點(diǎn)，甚至最適pH和溫度也各不相同【5j。 p葡萄糖苷酶的等電點(diǎn)一般都在酸性范圍內(nèi) p13555 ，但也有些從動(dòng)物肝臟中 來源于真菌的p葡萄糖苷酶最適溫度在4070"C71，而來源于古生菌和細(xì)菌的D葡萄 最適溫度可達(dá)102105。 爭葡萄糖苷酶

18、的抑制劑或激活劑因?yàn)槊傅膩碓床煌町愝^大。很多研究都證明D 葡萄糖是p葡萄糖苷酶的抑制劑，6葡萄糖酸內(nèi)酯還可抑制黑曲霉中的p葡萄糖苷酶 活性。對(duì)p葡萄糖苷酶有抑制作用的金屬離子有H92+、Cu2+、A礦；Kim9】等對(duì)從 I 文獻(xiàn)綜述 coelicolo，A3中克隆并在Escherichia coli中表達(dá)的B葡萄糖苷酶研究發(fā)現(xiàn)， Streptomyces Zn2+明顯抑制D一葡萄糖苷酶的活性，Cu2+和Na+也對(duì)D葡萄糖苷酶有一定程度的抑制。 一般情況下，還原性的EDTA和DTT均可抑制酶的活性，但是SDS的抑制作用并不 是絕對(duì)的【z7，訓(xùn)。 爭葡萄糖苷酶可水解非還原性末端的pD糖苷鍵，從而

19、釋放出葡萄糖和相應(yīng)的配 基。但是，其對(duì)底物的專一性較差，除能水解CO鍵外，還能水解C-N、CS和CF 鍵；并且它對(duì)糖基中的C2和C4構(gòu)型均可發(fā)揮作用，既能夠?qū)诎肴樘擒真I發(fā)揮作用 又能對(duì)B一葡萄糖苷鍵發(fā)揮作用，有些甚至能微弱的水解木糖苷鍵。 爭葡萄糖苷酶的測定方法和底物較多。其測定底物主要有如下幾種： 1 水楊苷，在p葡萄糖苷酶的作用下被降解成水楊醇和葡萄糖。測定時(shí)利用釋 放出來的水楊醇與4氨基安替比林顯色，通過分光光度計(jì)來測定其濃度。或是通過 DNS法測定釋放出來的葡萄糖量； 2 烴基或芳香基B葡萄糖苷底物，比如對(duì)硝基苯酚pD葡萄糖苷 pNm ，可 通過有顏色的產(chǎn)物對(duì)硝基酚直接以比色法測定其

20、濃度，從而計(jì)算酶活力； 3 4甲基傘形酮pD葡萄糖苷，在p葡萄糖苷酶的作用下被分解成4甲基傘形 酮，利用其具有的強(qiáng)烈熒光性來測定熒光吸收度從而確定酶活力； 4 以扁桃苷為底物，根據(jù)酶解所產(chǎn)生的氫化物，利用一對(duì)銀鉑電極，通過電化 法來測定B葡萄糖苷酶活性。 最近，梁華正【Io】等人提出了一種新的測定底物京尼平苷，通過其在B葡萄糖 苷酶作用下生成的京尼平與氨基酸形成藍(lán)色物質(zhì)來檢測。水楊苷和pNPG是目前應(yīng)用 普遍的測定底物，但是，對(duì)于應(yīng)用在纖維素降解中的p葡萄糖苷酶，其最佳測定底物 為纖維二糖【¨J。 12 p?葡萄糖苷酶的作用機(jī)制 在13葡萄糖苷酶中發(fā)揮作用的是兩個(gè)谷氨酸殘基，靠近N。

21、端的谷氨酸起酸堿催化 劑作用，另一個(gè)谷氨酸發(fā)揮親核試劑的作用。高度保守的C端附近的殘基也參與了酶 與糖苷基底物的鍵合，其中在該區(qū)的一些微小差異與不同B葡萄糖苷酶的底物特異性 有關(guān)p 核體鑒定發(fā)現(xiàn)：BGl氨基酸序列排布中天冬氨酸261完全保守，此完全保守性與催化 親核體的關(guān)鍵作用完全一致。除了可形成共價(jià)糖基化酶中間體和穩(wěn)定氧化卡賓體的類 離子過渡態(tài)外，親核體還可調(diào)節(jié)酸堿催化堿基的電離狀態(tài)，并且過渡態(tài)中在糖狀物的 2羥基位置上形成很強(qiáng)的氫鍵71。 爭葡萄糖苷酶在催化過程中遵循兩步雙取代反應(yīng)機(jī)制。首先，酶與底物鍵合成米 氏復(fù)合物ES；隨后，酶的活性中心的親核羧基進(jìn)攻底物的端基異構(gòu)體的中心部位， 2

22、北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 另一個(gè)酸堿催化羧基提供了一個(gè)質(zhì)子，使糖苷中的氧質(zhì)子化，由此形成了底物與酶的 中間體ES。最后，中間體水解，水分子與底物的端基異構(gòu)體結(jié)合，從而將糖基產(chǎn)物 釋放弘葡萄糖苷酶恢復(fù)初始狀態(tài)，其構(gòu)型在反應(yīng)過程中未發(fā)生變化。以上過程解釋 了爭葡萄糖苷酶的催化機(jī)制，但是不同來源的B葡萄糖苷酶的具體反應(yīng)機(jī)制有所不 同。 p葡萄糖苷酶在纖維素降解過程中的作用主要是去除纖維二糖對(duì)酶的反饋抑制。 關(guān)于纖維素的降解機(jī)理有很多假說，目前較為公認(rèn)的是協(xié)同作用模型【l41。首先內(nèi)切葡 聚糖酶在纖維素?zé)o定形區(qū)進(jìn)行切割，產(chǎn)生新末端，生成較小的葡聚糖；然后再由外切 葡聚糖酶作用于纖維素分子末端糖苷鍵釋放

23、出纖維二糖，最后由p一葡萄糖苷酶將纖維 6】： 二糖分解為葡萄糖【15】。如圖11所示【1 內(nèi)切葡聚糖酶無定形纖維素 纖維二糖水解酶 。厶f。； 結(jié)晶纖維素叫寄篡嚳 萄糖苷酶 圖1-1纖維素酶協(xié)同作用機(jī)制示意圖 The ofthe ofcellulases Fig1-1map synergism 由圖11可看出，p葡萄糖苷酶可以將纖維素水解過程中釋放的纖維二糖降解成 葡萄糖從而去除其對(duì)另外兩種纖維素酶的抑制作用。 13爭葡萄糖苷酶的應(yīng)用 131 p一葡萄糖苷酶在降解纖維素中的應(yīng)用 纖維素難以被降解，通常需經(jīng)過理化處理或酶解等預(yù)處理后才能用于生產(chǎn)或應(yīng) 用。理化處理法由于會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染和操作繁瑣

24、而逐漸被淘汰，酶法降解纖維素受 到越來越多的關(guān)注。纖維素酶是一個(gè)復(fù)合酶體系，由內(nèi)切葡聚糖酶 EG 、外切葡聚 糖酶 CBH 和p葡萄糖苷酶 BG 組成。三種酶協(xié)同作用才能將纖維素有效降解。 BG在纖維素降解過程中所發(fā)揮的作用是將纖維二糖分解為葡萄糖，從而去除了纖維 二糖對(duì)另兩個(gè)酶組分的抑制作用，因而提高纖維素的降解效率。 Nicole等【l 7】的研究結(jié)果表明，將B葡萄糖苷酶加入內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶 sJ 的體系中，在降解磷酸溶脹纖維素時(shí)可以明顯提高EG和CBH的活性。Fujita等ll 通過將三個(gè)纖維素酶的基因同時(shí)克隆到酵母中使其酒精產(chǎn)率增加明顯。 131 p葡萄糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)

25、用 文獻(xiàn)綜述 1321作為風(fēng)味酶 p葡萄糖苷酶可被用于改善茶葉、果汁和果酒的風(fēng)味。由于植物中的芳香物質(zhì)多 以糖苷鍵形式存在，這些風(fēng)味前體物在p一葡萄糖苷酶的作用下可被釋放出來。利用該 酶對(duì)果汁及果酒生產(chǎn)中的原料如蘋果、葡萄等處理，可以有效的改善產(chǎn)品風(fēng)味。朱風(fēng) 妹【2l等利用p一葡萄糖苷酶處理葡萄，使其釋放出了酯類、酸類、醇類和醛類等多種芳 香物質(zhì)，明顯的改善了葡萄酒的風(fēng)味。 1322 脫苦作用 在柑橘制品生產(chǎn)過程中，柚皮苷和檸檬苦素嚴(yán)重影響產(chǎn)品口感，而p葡萄糖苷酶 可有效的降解柚皮苷，此外，該酶還能將苦杏仁苷分解為苯甲醛和葡萄糖，從而極大 地減少產(chǎn)品的苦味。 1323 生產(chǎn)低聚龍膽糖 在高溫下

26、，通過D葡萄糖苷酶的作用可使高濃度的葡萄糖發(fā)生縮合反應(yīng)生成低聚 龍膽糖。所合成的低聚龍膽糖為龍膽二糖、三糖、四糖的混合物，可起到預(yù)防食品中 的淀粉老化，并保持食品中水分的作用。由于其具有輕微的苦味，低聚龍膽糖還被應(yīng) 用于制作咖啡和巧克力，能起到增昧或改善味覺的作用。 1324 在大豆異黃酮生產(chǎn)中的應(yīng)用 大豆異黃酮因其具有生物學(xué)活性功能而受到人們極大關(guān)注。目前已知的大豆異黃 酮在自然狀態(tài)下以酮糖苷的形式存在，無法直接發(fā)揮作用。而在高活性B一葡萄糖苷酶 存在的條件下可以充分的將其降解成大豆異黃酮。 133 生產(chǎn)天然色素梔子藍(lán) 色素是食品添加劑中的一個(gè)重要組分。但是，目前食品行業(yè)中所用色素多為人工

27、合成色素，大多都具有一定的毒性，給人體安全帶來隱患。而應(yīng)用天然色素就不會(huì)出 現(xiàn)此類問題。梔子苷在p一葡萄糖苷酶的作用下，可與伯氨基酸發(fā)生聚合反應(yīng)生成梔子 藍(lán)色素。用此方法制得的天然色素不但對(duì)人體無毒害，而且效果好，顏色鮮亮【煳。 134 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用 爭葡萄糖苷酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中也有應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)人體的很多組織也可以分泌p-葡 萄糖苷酶，人們以此進(jìn)行癌癥的診斷和治療，通過對(duì)血清中的p-葡萄糖苷酶活性檢測 來診斷癌癥。此外，p一葡萄糖苷酶已被用于篩選抗HIV一1的藥物，通過對(duì)外源凝集素 對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶和葡萄糖苷酶等糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)了能夠用于檢測HIV1的雙香豆 精例。 4 北京化工大學(xué)碩士學(xué)

28、位論文 135 其他應(yīng)用 爭葡萄糖苷酶還能水解野黑櫻苷，釋放HCN，對(duì)植物體起到一定的抗病蟲害作用。 p葡萄糖苷酶還被用于日化行業(yè)中生產(chǎn)烷基糖苷，在乳品行業(yè)中去除乳制品中的乳糖， 提高奶酪質(zhì)量。此外，p葡萄糖苷酶還在飼料、紡織等多個(gè)行業(yè)都有所應(yīng)用。 14爭葡萄糖苷酶的來源及分類 爭葡萄糖苷酶最早被發(fā)現(xiàn)存在于苦杏仁中，在后來的研究中，人們發(fā)現(xiàn)p葡萄糖 苷酶的來源很廣泛，在動(dòng)物、植物和微生物中，都發(fā)現(xiàn)了該酶的存在。 該酶的植物來源有蘋果籽、番木瓜、黑櫻桃、水稻、大豆、木薯【2l】和玉米等。其 在植物的各組織中均有分布，尤其以在種子中存在最多。該酶在動(dòng)物體中的分布主要 有動(dòng)物的肝臟和福壽螺、蠑螺【2

29、01。其微生物來源主要有霉菌、酵母和一些細(xì)菌【22】。6 葡萄糖苷酶在古生菌、細(xì)菌和真菌三大類微生物中都有分布。曲霉是目前報(bào)道的最有 效的爭葡萄糖苷酶產(chǎn)酶菌株，比如黑曲霉、無花果曲霉和青霉等。 以氨基酸序列作為分類標(biāo)準(zhǔn)【20】，D葡萄糖苷酶被劃分為糖苷水解酶的l和3族。1 族來源為細(xì)菌和植物；3族來源于真菌。 根據(jù)其對(duì)底物的特異性，該酶可被分為三類【2J：以烴基或芳香基D葡萄糖苷為底 物，比如硝基苯酚pD葡萄糖苷；只能夠利用烴基p。葡萄糖苷為底物；只能夠利用芳 香基肛葡萄糖苷為底物。 15菌株改造研究進(jìn)展 由于動(dòng)植物體中的p葡萄糖苷酶含量較低，且提取操作繁瑣，因此，微生物是D 葡萄糖苷酶最好的

30、來源。細(xì)菌中p一葡萄糖苷酶的活性普遍較低，目前較高產(chǎn)的菌株大 多來自真菌，黑曲霉被認(rèn)為是產(chǎn)p葡萄糖苷酶最有效的菌株。雖然p葡萄糖苷酶在各 類微生物中普遍存在，但是，野生型的菌株產(chǎn)酶活力較低，因此對(duì)高產(chǎn)p葡萄糖苷酶 菌株進(jìn)行選育就顯得十分有必要。 菌株選育的方法通常包括非定向誘變和定向誘變【141。非定向誘變是隨機(jī)的，以物 理、化學(xué)誘變因子使微生物的遺傳物質(zhì)發(fā)生隨機(jī)突變，通過有效篩選從而獲得目的菌 株。非定向誘變育種技術(shù)包括傳統(tǒng)理化誘變、原生質(zhì)體誘變和原生質(zhì)體融合等。通常 直接采用外源的誘變因子處理菌株，使其遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，通過有效的篩選方法獲 得目的菌株。采用非定向誘變育種時(shí)，無需完全清楚地

31、了解微生物的代謝途徑和機(jī)制。 定向誘變育種應(yīng)首先了解目標(biāo)產(chǎn)物在微生物體內(nèi)的合成途徑，一般包括如下的程序 【14J： 1 選擇合適的酶； 2 根據(jù)其結(jié)構(gòu)確定氨基酸序列； 3 確定突變位點(diǎn)。 5 文獻(xiàn)綜述 151 常規(guī)誘變育種技術(shù)在選育p一葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株中的研究進(jìn)展 目前，關(guān)于B葡萄糖昔酶產(chǎn)酶菌株的選育工作多利用傳統(tǒng)誘變技術(shù)。以物理、化 學(xué)或生物誘變劑對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行單因子誘變或復(fù)合誘變選育目的菌株。常用的物理誘 變劑有紫外線、Y射線、C060輻射和N+注入等，常用的化學(xué)誘變劑有硫酸二乙酯 DES 、 亞硝基胍 NTG 等。近些年，隨著航天技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了航空誘變或利用空間微 重力輻射儀模擬太

32、空條件對(duì)菌株進(jìn)行誘變的技術(shù)。其中，利用紫外線輻射誘變和化學(xué) 誘變劑操作成本低，所需設(shè)備簡單，尤其是紫外線誘變因?yàn)槠洳僮骱啽悖覍?duì)人體安 全而被廣泛應(yīng)用。 在常規(guī)誘變育種選育高產(chǎn)菌株時(shí)，篩選平板的選擇很關(guān)鍵。有效的篩選平板可以 極大的減少后期菌株篩選的工作量。篩選平板通過待篩菌株對(duì)平板中的底物降解或發(fā) 生其它反應(yīng)而產(chǎn)生顏色變化或出現(xiàn)水解圈來選育菌株。利用透明圈法篩選是根據(jù)透明 圈直徑與菌落直徑的比值大小來判斷菌株的水解能力。目前已報(bào)道的篩選平板有七時(shí) 苷平板和D一葡聚糖岡0果紅營養(yǎng)平板法【2引。 表1-1國內(nèi)黑曲霉菌株誘變選育研究情況表 Table1-1Themutationresultsin

33、studies reported 在誘變選育B葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的研究中，多數(shù)都以黑曲霉作為出發(fā)菌株，因 為它具有較強(qiáng)的D葡萄糖苷酶分泌能力且是被公認(rèn)的安全生產(chǎn)菌株?，F(xiàn)將國內(nèi)有代表 性的常規(guī)誘變選育B葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株，并取得較好效果的研究結(jié)果總結(jié)如表11 所示。 由于B葡萄糖苷酶活力的測定方法有多種，且在各個(gè)研究中所定義的酶活力單位 也不統(tǒng)一，因此已有報(bào)道中的結(jié)果差異很大。雖然應(yīng)用傳統(tǒng)誘變技術(shù)可使野生型菌株 的產(chǎn)酶水平有了很大幅度的提高，但是，到目前為止，并未選育出能夠適合于工業(yè)化 發(fā)酵生產(chǎn)B葡萄糖苷酶的菌株。 6 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 152 原生質(zhì)體技術(shù)在選育爭葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株中的

34、研究進(jìn)展 隨著Buchman報(bào)道了粗糙孢霉原生質(zhì)體的制備方法后，原生質(zhì)體技術(shù)被應(yīng)用于研 究絲狀真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和分泌特性。隨后，人們發(fā)現(xiàn)了原生質(zhì)體在菌株選育工作中更 重要的意義。隨著原生質(zhì)體技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了大量關(guān)于原生質(zhì)體的制備、再生和誘 變以及原生質(zhì)體融合選育菌株的報(bào)道【25,26J。 1521原生質(zhì)體的制備和再生 Weibull等提出。它具有與原始細(xì)胞相似的結(jié)構(gòu)、活性和功能。但是，由于脫去了細(xì) 胞壁而對(duì)外界條件極為敏感，其必須在高滲條件下才可穩(wěn)定存在。原生質(zhì)體的制備方 法有酶法和機(jī)械法，酶法由于脫壁效率高且保持了原生質(zhì)體的完整性而在實(shí)際中應(yīng)用 廣泛。 不同菌株的原生質(zhì)體由于細(xì)胞壁的差異而有

35、不同的制備方法。且同種菌株由于培 養(yǎng)條件的不同，原生質(zhì)體的制備方法也有所差異。真菌中使用較多的脫壁酶有蝸牛酶、 纖維素酶：細(xì)菌中應(yīng)用【27】較多的是溶菌酶。在實(shí)際操作中，不同的酶系配比會(huì)對(duì)原生 質(zhì)體的釋放產(chǎn)生很大影響。 此外，在原生質(zhì)體的制備過程中還有許多重要的影響因素。比如，菌絲培養(yǎng)方式、 培養(yǎng)時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間、緩沖溶液和滲透壓穩(wěn)定劑等均對(duì)原生質(zhì)體的制備有 很大影響。且這些條件在菌株之間的差異性很大。在原生質(zhì)體釋放過程中重要的幾個(gè) 影響因素如下： 第一，菌齡。制備原生質(zhì)體的菌絲的菌齡對(duì)原生質(zhì)體的釋放很關(guān)鍵。培養(yǎng)時(shí)間過 短，菌絲細(xì)嫩，原生質(zhì)體脆弱；培養(yǎng)時(shí)間過長，菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得致密，

36、難于被酶 解，也不利于原生質(zhì)體釋放。一般選取對(duì)數(shù)生長期的菌絲來制備原生質(zhì)體，此階段的 菌絲生長旺盛，制得的原生質(zhì)體活性高，易于再生。 第二，緩沖體系及滲透壓穩(wěn)定劑。在原生質(zhì)體的釋放過程中，緩沖體系中存在的 離子及緩沖能力對(duì)原生質(zhì)體的形成有很重要影響。常用的緩沖體系有檸檬酸鹽緩沖體 系、磷酸鹽緩沖體系、醋酸鹽緩沖體系，緩沖體系根據(jù)菌株不同有所區(qū)別。滲透壓穩(wěn) 定劑能夠保護(hù)釋放的原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，避免其因大量水的滲入而脹破。常用的滲透 壓穩(wěn)定劑有KCI、NaCl等無機(jī)鹽類及蔗糖、甘露醇等有機(jī)物。滲透壓穩(wěn)定劑的濃度一 M。 般為0308 第三，酶系配比和酶液濃度。不同菌種的細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)各不相同，所以酶系 的配比在各菌株間差異很大。真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中，纖維素、幾丁質(zhì)等成分較多，所 以常用的破壁酶有纖維素酶和蝸牛酶、溶壁酶。酶液的濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放影響很大。 酶液濃度過高，雖然利于脫壁，但是會(huì)破壞原生質(zhì)體，過低則不利于釋放。 原生質(zhì)體的再生對(duì)利用原生質(zhì)體技術(shù)選育菌株也有重要影響。再生率的高低直接 7 文獻(xiàn)綜述 影響到利用原生質(zhì)體技術(shù)選育菌株的效果。一般情況下原生質(zhì)體的再生率可達(dá)到 30-40，但是在適宜條件下其再生率可達(dá)90以上。