木薯PHOR1基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達特性

1、    木薯phor1基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達特性    叢漢卿+齊堯堯+朱文麗摘要：為研究木薯中phor1基因如何被逆境信號調(diào)控，根據(jù)楊樹2個phor1同源基因搜索木薯基因組數(shù)據(jù)庫，得到2個高度同源的木薯phor1基因，即mephor1_1和mephor1_2。序列分析表明，它們都具有e3泛素連接酶家族成員特征：含有u-box和armadillo重復(fù)序列。此外其啟動子區(qū)具有乙烯響應(yīng)元件和茉莉酸響應(yīng)元件。以木薯品種華南八號懸浮培養(yǎng)細胞為材料，利用qrt-pcr檢測mephor1_1和mephor1_2基因在乙烯利和茉莉酸甲酯處理后的表達

2、特性。結(jié)果顯示：在乙烯和茉莉酸甲酯分別處理后的細胞懸浮液中，2個phor1基因的表達變化呈現(xiàn)相似趨勢，即乙烯處理后，2個基因的表達均出現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢；而對茉莉酸信號則呈現(xiàn)先上升后下降又上升再下降的波動性趨勢，故推測2個phor1基因可被乙烯和茉莉酸信號調(diào)控，并可在后續(xù)的根生長和淀粉積累等一系列生理生化過程中發(fā)揮作用。關(guān)鍵詞：木薯；phor1基因；乙烯；茉莉酸；表達分析：s533.01 文獻標志碼：a：1002-1302（2016）11-0029-05木薯（manihot esculenta crantz）屬于大戟科（euphorbiaceae）木薯屬（manihot p.miller

3、），原產(chǎn)于熱帶南美洲，是世界三大薯類作物之一，是第六大糧食作物，是重要的能源和淀粉作物。木薯的根作為其主要經(jīng)濟部位，研究其生長發(fā)育和淀粉積累具有重要意義。amador等在研究馬鈴薯（solanum tuberosum）短日照條件下在上調(diào)表達的調(diào)控因子中首次獲得了phor1基因，并通過煙草轉(zhuǎn)基因試驗證明phor1對ga信號途徑具有正調(diào)控作用1。phor1編碼1個cys-pro-ile motif（cpi）結(jié)構(gòu)域和7個armadillo（arm）重復(fù)序列的蛋白2。此cpi結(jié)構(gòu)域具有典型的u-box序列特征，u-box結(jié)構(gòu)一般存在于e3泛素連接酶中3，可促進特異目標蛋白的泛素化4，缺失試驗表明，cp

4、i是一種可被ga抑制的細胞質(zhì)內(nèi)滯留信號。而arm重復(fù)序列是phor1的核定位信號，其核定位功能可為cpi所逆轉(zhuǎn)。目前，對phor1基因的研究已有一定基礎(chǔ)，但在木薯中的表達特性和基因功能還未被研究。茉莉酸（jasmonic acid，簡稱ja）和乙烯（ethylene，簡稱et）是植物逆境響應(yīng)的信號分子，在涉及植物對生物性和非生物性逆境脅迫和植物生長發(fā)育過程中的基因調(diào)控上發(fā)揮著重要作用。ja作為一種逆境脅迫轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，具有誘導(dǎo)植物防御基因的表達、調(diào)控植物對機械傷害、鹽害及紫外線照射等非生物脅迫的反應(yīng)的功能5-6。而et是另外一種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，可影響植物多個生長發(fā)育過程，對植物自身來說，乙烯在種

5、子萌發(fā)、開花、葉片伸展、根的生長、果實成熟及器官衰老等方面發(fā)揮著作用；對植物與外界環(huán)境的關(guān)系來說，乙烯主要參與植物面對外界生物與非生物脅迫的反應(yīng)過程。很多涉及上述相關(guān)過程的基因序列上都有乙烯響應(yīng)元件7-8。楊樹中的phor1同源基因被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控芽和根生長、淀粉積累、木質(zhì)部形成的功能9。根據(jù)楊樹phor1同源基因ptphor1_1（poptr_0007s03730）和ptphor1_2（poptr_0005s05880）的序列在jgi的木薯基因組數(shù)據(jù)庫 v6.110中搜索獲得2個高度同源序列：manes.12g152200和manes.13g071800，分別命名為mephor1_1和meph

6、or1_2。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其具有典型的u-box結(jié)構(gòu)和arm重復(fù)序列，且mephor1_1啟動子區(qū)具有1個乙烯響應(yīng)元件和1個茉莉酸響應(yīng)元件，mephor1_2具有2個茉莉酸響應(yīng)元件。同時利用木薯懸浮培養(yǎng)細胞對其et和ja甲酯誘導(dǎo)表達特性分析中也發(fā)現(xiàn)，phor1基因可受et和ja信號調(diào)控，并呈現(xiàn)不同的表達趨勢。本研究旨在通過序列分析和表達分析，確定et和ja信號是否能對phor1基因表達造成影響，并初步探索表達變化特性及其機制，為進一步研究逆境信號通過phor1基因在木薯塊根發(fā)育和淀粉積累過程中所發(fā)揮的作用提供參考。1 材料與方法1.1 材料與試劑木薯（manihot esculenta

7、crantz）品種華南八號（sc8）懸浮培養(yǎng)細胞，該細胞通過葉片愈傷組織建立，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所。axygen總rna小量制備試劑盒（axygen）；primescripttm reverse transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（takara）；sybr premix ex taqtm （pefect real time）實時定量試劑盒（takara）；引物由invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司合成。1.2 方法1.2.1 材料處理吸取處于指數(shù)增長期的懸浮培養(yǎng)細胞 1 ml 于離心管中并置于搖床25 穩(wěn)定0.5 h，分為3組，其中2組分別以濃度為400 l/

8、l的乙烯利（ethephon）（solarbio）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，簡稱meja）（sigma-aldrich）處理，另一組不進行任何處理作為對照。選取處理后0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h共5個時間點的樣品，微離心后棄上清液氮速凍-80 冰箱保存。此步驟重復(fù)3次，獲得3批生物學(xué)重復(fù)。1.2.2 phor1基因及啟動子區(qū)序列分析使用jgi的木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//pz/portal.html#！info？alias=org_mesculenta_er）獲得mephor1_1和mephor1_2的cds序列

9、（coding sequence）和dna序列（genomic sequence）10。用netgene2 v2.4（http：/www.cbs.dtu.dk/services/netgene2/）分析基因結(jié)構(gòu)11-12。用gsds（http：/）分析內(nèi)含子相位13。用tssp（http：/ 1.2.3 phor1蛋白分析使用blast工具對預(yù)測的氨基酸序列進行比對分析，用portparam（http：//protparam/）預(yù)測其蛋白分子量和等電點16，使用interpro（http：/www.ebi.ac.uk/interpro/）預(yù)測結(jié)構(gòu)域17。利用meme

10、（http：//tools/meme）18和mast（http：//tools/mast）19分析木薯phor1蛋白的基序，基序數(shù)目設(shè)為10，e-values為默認的1.0。用tmhmm server在線工具（http：/www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/）進行跨膜區(qū)預(yù)測20，使用subloc在線工具（http：/1.2.4 序列比對和進化樹分析鑒于目前只有少數(shù)作物對phor1進行了研究，目前我們只找到了除木薯外的已報道的6種植物中的phor1基因。來自木薯的2個phor1基因mephor1_1和mephor1_

11、2、楊樹（populus trichocarpa）的phor1基因ptphor1_1（poptr_0007s03730）和ptphor1_2（poptr_0005s05880）9、馬鈴薯（solanum tuberosum）stphor1（aj306423）1、番茄（lycopersicon esculentum）的lephor1（solyc04g071030）25、擬南芥（arabidopsis thaliana）him1/him2/him33、龍眼（dimocarpus longan l.）dlphor126、白羽扇豆（lupinus albus）中具有完整cds的3條phor1同源con

12、tigs（lagi01_34089、lagi01_33328、lagi01_27558）27。使用mega 6對其氨基酸進行序列比對，并構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，n-j）聚類進化樹。使用bootstrap方法1 000次重復(fù)對進化樹進行驗證。1.2.5 phor1誘導(dǎo)表達的qrt-pcr檢測提取rna后進行cdna反轉(zhuǎn)錄，利用qrt-pcr檢測木薯phor1基因在懸浮培養(yǎng)細胞中受乙烯利和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達情況，所有的qrt-pcr反應(yīng)均來自同一批反轉(zhuǎn)錄的cdna產(chǎn)物，18s rrna為內(nèi)參。所用phor1基因及18s rrna的引物為primer premier 5.0軟件設(shè)

13、計（表1）。2 結(jié)果與分析2.1 基因結(jié)構(gòu)分析基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，mephor1_1和mephor1_2基因僅有1個外顯子，都沒有內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄起始位點預(yù)測顯示：mephor1_1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于起始密碼子上游 857 bp 處，而mephor1_2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于起始密碼子上游1 282 bp處。順勢作用元件位點分析發(fā)現(xiàn)：mephor1_1基因啟動子區(qū)域包含典型啟動子調(diào)控元件 caat-box 和 tata-box及多個光響應(yīng)順式元件、1個乙烯響應(yīng)元件和1個茉莉酸響應(yīng)元件；此外還包含真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件、myb結(jié)合位點以及參與細胞周期和胚乳表達響應(yīng)元件。而mephor1_2除具有典型啟

14、動子調(diào)控元件caat-box和 tata-box外，也存在多個光響應(yīng)順式元件和2個茉莉酸響應(yīng)元件，但不具有乙烯響應(yīng)元件；另外還包含厭氧誘導(dǎo)的響應(yīng)元件、真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件、myb結(jié)合位點以及生長素響應(yīng)元件（表2）。2.2 蛋白分析mephor1_1有418個氨基酸，分子量為46 610.3 u，理論等電點為8.28。mephor1_2有418個氨基酸，分子量為 46 795.6 u，理論等電點為7.47?？缒^(qū)分析顯示此蛋白可能無跨膜結(jié)構(gòu)。亞細胞定位預(yù)測表明，這2個蛋白有可能定位在核上。二者具有相同基序。符合e-value<1的基序有6個，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測mephor1_1和mephor1_2

15、有22個螺旋結(jié)構(gòu)，可參考其三維預(yù)測結(jié)構(gòu)（圖1）。pfp蛋白功能預(yù)測顯示：mephor1_1和mephor1_2基因最符合gene ontology（go）中的go：0005515條目，具有蛋白結(jié)合功能。2.3 phor1基因進化樹分析從進化樹可以看出，同一科植物的phor1基因基本聚為一類，木薯作為大戟科植物，2個phor1處于一個單獨分支上，且在親緣關(guān)系上較為接近楊樹和龍眼（圖2）；楊樹與龍眼作為木本植物處于同一分支，且龍眼的dlphor1與楊樹ptphor1_1的親緣關(guān)系要近于楊樹自身的ptphor1_2；此外擬南芥的3個基因也處于同一分支；馬鈴薯和番茄同為茄科植物，處于同一分支；與此親緣

16、關(guān)系較遠的白羽扇豆位于一個距離較遠的獨立分支上。2.4 茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)木薯phor1表達水平變化為排除phor1基因本底變化造成的影響，將茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)后的qrt-pcr表達量值除以相應(yīng)對照的表達量值，值1.0為本底表達水平。最終獲得其在2種處理下的表達趨勢，結(jié)果顯示兩者呈現(xiàn)不同趨勢：mephor1_1在茉莉酸甲酯的響應(yīng)整體呈現(xiàn)波浪狀，處理0.5 h后表達量提升至1.7左右，又在1 h快速下降至0.7水平，后在4 h時，逐漸恢復(fù)到初始水平，但又在8 h出現(xiàn)劇烈下降至最低水平。而乙烯信號對其的影響呈現(xiàn)先在1 h下降至最低點后又逐漸上升的趨勢（圖3-a）。茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，mephor

17、1_2的趨勢與mephor1_1較為類似，也呈現(xiàn)波浪狀，但表達水平有較大差異，處理0.5 h后表達量提升至2.0以上，又在 1 h 快速下降至初始水平以下，但在4 h時提升到4.0，后又在8 h出現(xiàn)劇烈下降。而乙烯信號對其沒有非常明顯的影響，趨勢線較為平直得維持在略低于初始水平的狀態(tài)下（圖3-b）。 3 結(jié)論與討論植物懸浮培養(yǎng)細胞是分子生物學(xué)實驗中研究信號傳遞和基因響應(yīng)的常用方法。加入外源信號物質(zhì)刺激后，信號物質(zhì)可快速、均勻地分布在每個細胞周圍，操作簡易，為試驗結(jié)果的一致性和重復(fù)性提供了保障。本研究選用的懸浮培養(yǎng)細胞大小接近、生長迅速且生長周期基本一致。本試驗中，phor1基因在逆境信號物質(zhì)施

18、加后0.5 h內(nèi)即作出了響應(yīng)，并且在整個過程中表達量最高可達初始水平的4倍，表明本試驗所選用的材料適用于基因表達分析研究。如同楊樹ptphor19，木薯phor1基因也是一類較為保守的基因，mephor1_1和mephor1_2兩者具有很高的序列相似性。在蛋白結(jié)構(gòu)上具有和已知的植物phor1基因類似的u-box結(jié)構(gòu)和arm重復(fù)序列。進化樹分析中，與楊樹的ptphor1和龍眼的dlphor1基因具有較近的親緣關(guān)系，可以推斷mephor1是一類典型的phor1基因。同時啟動子區(qū)分析發(fā)現(xiàn)mephor1具有乙烯響應(yīng)因子ere及茉莉酸響應(yīng)元件cgtca-motif和tgacg-motif，初步解釋了乙烯

19、和茉莉酸信號可影響phor1基因的表達。盡管mephor1_1有1個乙烯響應(yīng)元件，但乙烯響應(yīng)的變化趨勢卻是下調(diào)的，可能有其他調(diào)控機制抑制了乙烯信號的順勢調(diào)控，具體原因還須進一步探索。mephor1_2沒有乙烯響應(yīng)元件，其et處理后的變化曲線盡管略低于本底水平1.0，但趨勢較為平緩，從一個角度解釋了mephor1_2為何對乙烯信號不敏感。此外，mephor1_2在0.5 h和4.0 h對ja響應(yīng)的表達量要明顯高于mephor1_1，推測與其具有2個茉莉酸響應(yīng)元件有一定關(guān)系。在乙烯和茉莉酸處理后0.5 h內(nèi)，phor1呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)趨勢，et導(dǎo)致下調(diào)而ja導(dǎo)致上調(diào)，表明雖同為逆境信號物質(zhì)，卻對p

20、hor1具有不同的調(diào)控作用。植物中茉莉酸和乙烯與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的激素的交叉相互作用在整個生活周期內(nèi)、不同組織器官間、不同類型細胞中一直存在。不同激素信號的整合共同介導(dǎo)了植物的生長發(fā)育、對環(huán)境的反應(yīng)及衰老死亡。此外，2個phor1基因的啟動子區(qū)還有各自獨有的調(diào)控元件，如生長素響應(yīng)、myb結(jié)合位點等。故此推測，2種不同逆境信號施加后與其他不同激素的綜合作用，產(chǎn)生了迥異的調(diào)控模式，最終造成phor1基因不同的表達特性。楊樹中phor1基因受到抑制后，其莖部和根部的淀粉積累出現(xiàn)了上升9，馬鈴薯中，phor1的下調(diào)可以促進塊莖的生長1。phor1具有抑制根和芽生長的功能，眾所周知，當不利環(huán)境來臨時，

21、植物開始大量合成貯藏營養(yǎng)物質(zhì)，并伴隨著生長的停滯28。因此，phor1是一種當不利環(huán)境來臨時植物將碳水化合物從用于生長轉(zhuǎn)為用于貯藏的調(diào)控機制的一部分。phor1調(diào)控淀粉代謝的方式可能與ga信號途徑有關(guān)29。phor1基因可能在根的發(fā)育過程中起一定的控制作用，楊樹phor1基因的過量表達會顯著減少生根9。有研究表明，ga會嚴重影響生長素的運輸30-32。因此，phor1作為ga信號的一部分，可能會干擾生長素的運輸和其感知定位生長素濃度信息的能力，這對根的形成至關(guān)重要?？傊琾hor1基因即可受光誘導(dǎo)，又可與ga信號互相影響，說明其是鏈接光信號途徑和ga途徑的一個橋梁1。由此推測：隨著季節(jié)更替，日

22、照時間發(fā)生變化，這一光信號將影響到植物phor1基因的表達，進而通過調(diào)節(jié)ga影響植株芽和根的生長，并促進淀粉積累，以迎接即將到來的秋冬季節(jié)的低溫不利環(huán)境。木薯作為重要的糧食作物及工業(yè)乙醇和淀粉來源33-34，根作為其主要經(jīng)濟部位，其生長發(fā)育和淀粉的積累具有重要的科研意義和經(jīng)濟價值，phor1基因作為可以調(diào)控此二者的重要基因，研究逆境信號如何對其造成影響并探索相關(guān)機制，可以進一步為木薯產(chǎn)量的提高和質(zhì)量的提升奠定理論基礎(chǔ)。目前我們已知木薯的phor1基因可受到乙烯和茉莉酸信號影響，并初步確定其表達特性，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑及此蛋白的具體功能，還需要進一步驗證和探索。參考文獻：1amador v，m

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