丹參2C-甲基-D-赤蘚醇 2,4-環(huán)焦磷酸合成酶的cDNA的全長克隆

1、 分類 年 級(jí) 07級(jí) 成 都 中 醫(yī) 藥 大 學(xué)藥學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文丹參2C-甲基-D-赤蘚醇 2,4-環(huán)焦磷酸合成酶的cDNA的全長克隆 姓名：馬曉惠指 導(dǎo) 教 師：黃璐琦研究員 高偉副教授 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：學(xué) 士 專業(yè)名稱：中藥學(xué) 論文提交時(shí)間：2011 年5 月 論文答辯時(shí)間：2011 年 6 月學(xué)位授予單位：成都中醫(yī)藥大學(xué)答辯委員會(huì)主席： 評(píng)閱人： 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2011年 5月目 錄目錄中文摘要英文摘要第1章 綜述1.1丹參研究概況1.2丹參酮類化合物的藥理作用1.3丹參酮生物合成途徑1.3.1 IPP和DMAPP的合成1.3.2 GGPP合成1.3.3 GGPP下游合成1.4

2、MECPS研究現(xiàn)狀1.5本課題研究的意義及思路 1.5.1研究意義 1.5.2研究思路及技術(shù)路線第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料來源2.1.2 菌株和質(zhì)粒2.1.3 主要試劑2.1.4 主要儀器設(shè)備2.2 試驗(yàn)方法 2.2.1 植物材料培養(yǎng)及處理方法 丹參毛狀根的懸浮培養(yǎng) 植物材料的處理 丹參總RNA提?。–TAB-LiCl法）與檢測(cè)2.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 2.2.3 第一鏈cDNA的合成 2.2.4 cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE） 2.2.5 T-A連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)/白菌落篩選及陽性克隆PCR鑒定 2.2.6 SmMEC

3、PS的全長cDNA第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 丹參總RNA3.2 5RACE 3.3 3RACE 3.4 SmMECPS全長序列及序列分析第4章 討論與結(jié)論參考文獻(xiàn)致謝摘要丹參藥用歷史悠久，是一種常用的中藥，其主要成分包括丹酚酸類水溶性成分和丹參酮類脂溶性成分。丹參酮為松香烷型二帖類化合物，現(xiàn)代藥理研究表明丹參酮類化合物具有心臟保護(hù)、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、保肝等多重藥理作用，是丹參中最主要的有效成分之一。挖掘與丹參酮類化合物生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶，并對(duì)編碼這些關(guān)鍵酶基因進(jìn)行深入的功能分析及其調(diào)控研究，逐步闡釋丹參中丹參酮形成的分子機(jī)制并加以利用，將是改良丹參種質(zhì)資源品質(zhì)、提高丹參酮含量和開展丹

4、參酮類化合物代謝工程的重要途徑，對(duì)于推動(dòng)丹參現(xiàn)代化具有重要意義。丹參酮類化合物生物合成途徑中編碼很多關(guān)鍵酶的基因如SmAACT、SmHMGS、SmHMGR、Sm DXS、Sm DXR、Sm CMK、SmIPPI、SmGGPPS、SmCPS、Sm GPPS和Sm KSL已克隆獲得。2C-甲基-D-赤蘚醇 2,4-環(huán)焦磷酸合成酶（簡稱為MECPS）是MEP途徑中第五個(gè)關(guān)鍵酶，對(duì)丹參酮生物合成具有重要作用。本研究以丹參毛狀根為材料,用Ag+和酵母提取物（YE）刺激丹參毛狀根，研究丹參酮類生物合成途徑中編碼MECPS的基因的克隆，通過設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行快速cDNA末端擴(kuò)增(RACE)，首次從丹參中克隆得

5、到了含1062bp的 MECPS全長cDNA序列（SmMECPS），該序列具有完整的開放閱讀框 (ORF)，且3端有poly(A)尾。SmMECPS開放閱讀框(ORF)分析表明，基因編碼區(qū)共編碼261個(gè)氨基酸的蛋白。為后期對(duì)SmMECPS蛋白異源表達(dá)、基因的功能鑒定和分析奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：丹參酮 生物合成 2C-甲基-D-赤蘚醇2,4-環(huán)焦磷酸合成酶 SmMECPSAbstractSalvia miltiorrhiza(Danshen) is commonly used as a medicine for a long history.The content of danshen can

6、be separated into lipid-soluble and water-soluble compounds. Tanshinones are abietane diterpenes.Modern pharmacology study suggests that tanshinones have the function of heart protection,antitumor activity,anti-inflammatory activity,antimicrobial activity,antioxidant activity and liver protection.Ta

7、nshinones are one of the most effective constituents in danshen. Find the key enzymes of the biosynthesis pathway of tanshinones , analyse the function of the genes which encode the key enzymes, find the controlling progress, make the mechanism of the biosynthesis of the tanthinones clear and make f

8、ull use of it.Then improve the germplasm resources of danshen,improve the content of tanshinones and carry out the metabolic engineering.It is of great significance to promote danshens modernization. Many key enzymes of the biosynthesis of tanshinones have been gained，such as SmAACT、SmHMGS、SmHMGR、Sm

9、 DXS、Sm DXR、Sm CMK、SmIPPI、SmGGPPS、SmCPS、Sm GPPS and Sm KSL.2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase(MECPS) is the fifth key enzyme in MEP pathway.It is important for the biosynthesis of tanshinones.The research use salvia miltiorrhiza hairy root as material and stimulate it by Ag + and y

10、east extract (YE). the cloning of full-length cDNA encoding MECPS(SmMECPS) from S.miltiorrhiza by rapid amplification of cDNA ends(RACE) was investigated. The cDNA has an open reading fram(ORF) of 1062 nueleotides，which eneodes 261 amino acids.The research lays the foundation for protein heterlolgou

11、s expression and its function identity and analysis.Key words:tanshinones biosynthesis 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase SmMECPS 第1章 綜述1.1丹參研究概況丹參為唇形科多年生草本植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根莖，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰之功效，用于胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，瘡瘍腫痛1。丹參藥用歷史悠久

12、，始載于神農(nóng)本草經(jīng)2，被列為上品，歷代本草均有記載?，F(xiàn)代藥理研究表明3，丹參具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化及在心血管方面的多種藥理活性，臨床廣泛用于心血管疾病、微循環(huán)障礙、肝纖維化、腫瘤、失眠、健忘等多種疾病的治療。到目前為止，已從丹參中分離出70多種化學(xué)成分4，其化學(xué)成分可分為脂溶性成分和水溶性成分兩大部分。脂溶性成分主要為二萜醌類化合物，從20世紀(jì)30年代日本學(xué)者中尾萬三首次從丹參中分離得到丹參酮類成分至今，已從丹參中分離出了40多種二萜醌類化合物 5。丹參脂溶性成分又統(tǒng)稱為丹參酮類化合物(tanshinones)。包括丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB，隱丹參酮、異隱丹參酮、新

13、隱丹參酮，異丹參酮I、異丹參酮IIA、異丹參酮 IIB，二氫丹參酮I、等，其中丹參酮I、丹參酮II、隱丹參酮為其最主要的活性成分3。 水溶性成分主要為酚酸類化合物，包括丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、B、C、D、E、紫草酸等3。對(duì)水溶性成分的研究相對(duì)較晚，20世紀(jì)80年代初，我國藥物研究人員對(duì)丹酚酸等水溶性成分進(jìn)行了研究，首先報(bào)道了丹參素的結(jié)構(gòu)，即3，4一二羥基苯乳酸(3，4一hydroxybenzy1)lactic acid，是各種丹酚酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)6。其中丹酚酸A、丹酚酸B為最主要的抗氧化成分。丹參中部分主要成分結(jié)果如圖1-1。丹參酮IIA丹參酮IIB 丹參酮I隱丹參酮丹酚酸A丹參素

14、迷迭香酸丹酚酸B圖1-1丹參部分主要成分結(jié)構(gòu)1.2丹參酮類化合物的藥理作用現(xiàn)代藥理研究表明，丹參酮類化合物具有廣泛的藥理作用，其中丹參酮I、丹參酮II、隱丹參酮為其最主要的活性成分。Wang X7等研究表明丹參酮對(duì)心臟具有明顯的保護(hù)作用，對(duì)心肌缺血再灌注損傷8、心肌梗死、異丙腎上腺素異常導(dǎo)致心肌肥大9等多種心臟病變均有明顯的作用。丹參酮對(duì)白血病10乳腺癌11肝癌12,13肺癌14前列腺癌15等多種腫瘤具有治療作用。丹參酮IIA具有植物雌激素樣作用，通過抑制NO、IL-1,IL-6,TNF-及iNOS產(chǎn)量及mRNA表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用5。此外，丹參酮具有抗菌作用廣泛的抗菌譜，其中隱丹參酮和二氫丹參

15、酮的抗菌活性強(qiáng)于丹參酮I和丹參酮IIA16?？赏ㄟ^提高雌激素水平和抑制骨更換而預(yù)防和治療視黃酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松17。丹參酮具有抗氧化性，可用于過氧化氫的清除18丹參酮通過抗氧化作用而減緩神經(jīng)損傷19。丹參酮還有保肝作用，它通過抑制線粒體膜通透性而保護(hù)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞免受CCl4的毒性作用20。丹參酮IIA通過阻礙轉(zhuǎn)化生長因子（TGP-）/Smad3信號(hào)通路和降低干細(xì)胞中IGFBP7的表達(dá)，提高肝功能，抑制肝星狀細(xì)胞，減少細(xì)胞基質(zhì)，保護(hù)肝細(xì)胞21。1.3丹參酮生物合成途徑丹參酮類成分屬于松香烷型二萜醌類化合物，來源于兩個(gè)5碳通用前體：異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。丹參酮

16、類生物合成途徑詳見圖1-2。1.3.1 IPP和DMAPP的合成。植物體中共有兩條途徑參與IPP和DMAPP的形成，位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑（MVA pathway）和位于質(zhì)體中的脫氧木酮糖-5-磷酸途徑（DXP pathway）或甲基蘚醇4-磷酸途徑（MEP pathway）。MVA途徑合成的IPP和MEP與DXP途徑合成的DMAPP可在IPP異構(gòu)酶(IPPI)的作用下實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化，IPP在MVA和DXP途徑中起到了橋梁作用。丹參酮合成通用前體IPP主要是通過DXP途徑合成的，但也依賴于與MVA途徑的相互轉(zhuǎn)化22。MVA途徑又稱為細(xì)胞質(zhì)途徑(cytosolic pathway)，甾醇、倍半

17、萜和泛醌等主要是通過該途徑進(jìn)行生物合成。此途徑的限速反應(yīng)步驟是3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)在3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(HMGR)的催化下被還原為甲羥戊酸(MVA)，HMGR為MVA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。廖攀23從丹參中克隆到丹參酮生物SmHMGR的全長cDNA，并對(duì)它進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)譜分析、誘導(dǎo)子作用下的表達(dá)分析。此外，王學(xué)勇24從丹參克隆到了MVA途徑中的乙酰乙酰CoA轉(zhuǎn)運(yùn)酶 (AACT)基因SmAACT,王敬25從丹參中克隆得到編碼3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(HMGS)的基因SmHMGS,并對(duì)其進(jìn)行了簡單的序列特征分析和表達(dá)分析。M

18、VA pathway乙酰CoA（Acety-CoA）AACT*乙酰乙酰CoA（Acetoacety-CoA）HMGS*3-羥基-3-甲基戊二酰CoA（ HMG-CoA）HMGR*甲羥戊酸（MVA）5-焦磷酸甲羥戊酸（MVAPP）MK甲羥戊酸二磷酸鹽（Mevalonate diphosphare）PMKMEP/DXP pathway丙酮酸（Pytuvate）+3-磷酸甘油（Glyceradehyde3-phosphate）DXS*1-脫氧-D-木酮糖-5一磷酸（DXP）DXR*2-C-甲基-D-赤蘚醇-4一磷酸（MEP）MCT4-(5一焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇（CDP-ME）CMK

19、*4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸（CDP-MEP）MECPS2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸（ME-CPP）HDS羥甲基丁烯基-4-磷酸（HMBPP）異戊烯基焦磷酸（IPP）二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）IPPI*GPPS*牻牛兒基焦磷酸（GPP）法呢基焦磷酸（FPP）FPPSGGPPS*牻牛兒牻牛兒焦磷酸（GGPP）CPS*柯巴基焦磷酸（CPP）MiltiradieneKSL*Diterpene tanshinoues圖1-2 丹參酮類生物合成途徑途徑MEP/DXP途徑又稱質(zhì)體途徑（plastid pathway）,單萜、倍半萜烯、雙萜、類胡蘿卜素、葉綠素和

20、質(zhì)體醌等主要通過該途徑進(jìn)行生物合成。丙酮酸(pyruvate)和一分子的3-磷酸甘油(glyceraldehydes-3-phosphate)在(DXS)催化下生成1-脫氧-D-木酮糖-5一磷酸(DXP)，此步反應(yīng)是質(zhì)體途徑中最為關(guān)鍵的一步反應(yīng)，也是萜類物質(zhì)代謝工程中最為重要最具吸引力的靶點(diǎn)26。王敬25已從丹參葉片中成功克隆到了兩個(gè)1-脫氧-D-木酮糖合成酶（DXS）成員SmDXS1和SmDXS2，并對(duì)它進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)譜分析、誘導(dǎo)子作用下的表達(dá)分析。DXP在DXP還原異構(gòu)酶(DXR)作用下經(jīng)過分子內(nèi)重排、還原成2-C-甲基-D-赤蘚醇-4一磷酸(MEP)，該反應(yīng)亦是MEP途徑

21、中的一步關(guān)鍵性的限速反應(yīng)27。Wu28等首次報(bào)道從丹參毛狀根中克隆得到DXR基因SmDXR，他們通過實(shí)驗(yàn)推測(cè)SmDXR可能參與控制代謝流動(dòng)并可能是丹參酮合成代謝調(diào)控的靶點(diǎn)。Yan29等從丹參葉片中分離得到SmDXR基因并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)分析和顏色互補(bǔ)功能驗(yàn)證試驗(yàn)。王學(xué)勇等30采用差異表達(dá)的基因克隆技術(shù)從丹參毛狀根中克隆到了4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶（CMK）基因SmCMK，初步證明了SmCMK基因表達(dá)量與丹參酮類成分積累之間的關(guān)系。此外，王學(xué)勇等采用差異表達(dá)的基因克隆技術(shù)從丹參毛狀根中還克隆到了IPPI（命名為SmIPPI）酶基因并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析24。1.

22、3.2 GGPP合成IPP作為活化的異戊二烯單元與DMAPP在烯丙基轉(zhuǎn)移酶（prenyltransferase）催化作用下經(jīng)頭尾縮合生產(chǎn)C10的牻牛兒焦磷酸（GPP），GPP經(jīng)法呢基叫磷酸合酶（FPPS）催化加上一個(gè)IPP形成C15法呢基焦磷酸（FPP），F(xiàn)PP經(jīng)GGPP合酶（GGPPS）催化再加上一個(gè)IPP形成二萜合成的基本骨架GGPP。廖攀23從丹參中克隆到GGPPS基因SmGGPPS的全長cDNA，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)譜分析、誘導(dǎo)子作用下的表達(dá)分析,并進(jìn)行了原核表達(dá)、進(jìn)一步采用顏色互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了SmGGPPS的功能。1.3.3 GGPP下游合成GGPP在柯巴基焦磷酸合酶

23、(CPS)催化下生成柯巴基焦磷酸 (CPP), CPP在類貝殼杉烯合酶(KSL)作用下生成一種松香烷型二萜化合物miltiradiene 31，miltiradiene進(jìn)一步反應(yīng)丹參新酮、新隱丹參酮、隱丹參酮、丹參酮IIB、丹參酮IIA、丹參酮I等丹參酮類化合物。黃璐琦研究員課題組在丹參酮生物合成下游特異途徑的研究方面作出了突出貢獻(xiàn)，得到了丹參酮GGPP下游生物合成途徑的兩個(gè)酶基因，即柯巴基焦磷酸合酶(CPS)和類貝殼杉烯合酶(KSL)32,24,31，并對(duì)SmCPS和SmKSL進(jìn)行了表達(dá)分析和功能驗(yàn)證。SmCPS和SmKSL被證明是參與丹參酮生物合成下游特異途徑GGPP后的連續(xù)兩步催化反應(yīng)中

24、的酶，這兩個(gè)丹參酮生物合成特異途徑的酶基因的獲得和功能驗(yàn)證為丹參酮類化合物的生物合成途徑的研究邁出了關(guān)鍵的一步。1.4 MECPS研究現(xiàn)狀2C-甲基-D-赤蘚醇 2,4-環(huán)焦磷酸合成酶（MECPS）是MEP途徑中第五個(gè)重要的酶，催化4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸 (CDP-MEP)轉(zhuǎn)化為2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸(ME-CPP)。Veau, B33實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MECPS參與植物中類異戊二烯積累的調(diào)控，證明了MECPS基因表達(dá)與萜類MIA積累的相關(guān)性。由于在人體中沒有與MECPS直接同源的酶，MECPS將成為潛在的藥物作用靶點(diǎn)，用于的疾病的治療。近年來MECPS

25、已成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。Richard SB34 首次揭露了MECPS的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)因素、基礎(chǔ)酶作用物、產(chǎn)物、Mn2+識(shí)別和包含環(huán)焦磷酸異戊二烯前體MECDP生物合成中可能的催化機(jī)理。他們通過2.8-A resolution得到了MEDCP合成酶的兩種X射線晶體結(jié)構(gòu)。其中第一個(gè)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)Mn2+結(jié)合位點(diǎn)，第二個(gè)結(jié)構(gòu)包含CMP,MECDP和Mn2+。這個(gè)蛋白接受4個(gè)同源三聚體組成了疏水腔中心和3個(gè)表面活性位點(diǎn)，每個(gè)活性位點(diǎn)位于兩個(gè)鄰近單元之間，四面體作為轉(zhuǎn)運(yùn)金屬結(jié)合位點(diǎn)，可能被Mn2+占據(jù)，位于活性位點(diǎn)縫隙處。MEDCP氧化磷酸鹽和側(cè)鏈中天冬氨酸、組氨酸及組氨酸結(jié)合金屬離子等位點(diǎn)。Kishida

26、 H35也對(duì)MECPS的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理進(jìn)行了研究。Richard SB34和Kishida H35均發(fā)現(xiàn)MECPS催化作用具有高度的特異性，其中Mn2+在其催化作用中起著至關(guān)重要的作用，他們的研究為今后進(jìn)一步對(duì)MECPS的化學(xué)合成研究和增加其活性奠定了基礎(chǔ)。Calisto BM 36比較了MECPS在擬南芥和細(xì)菌中的結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)MECPS在植物中具有高保真度，其在細(xì)菌和植物中可能具有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。光學(xué)純化的CDP-MEP作為MECPS催化的底物，其獲得成為研究MECPS的一個(gè)重大阻礙，為了進(jìn)一步研MECPS的作用,Narayanasamy P 37用商業(yè)上常用的D-阿拉伯糖合成了光學(xué)純化的

27、CDP-MEP，建立了體外MECPS催化CDP-MEP轉(zhuǎn)化為ME-CPP方便、敏感的實(shí)驗(yàn)方法，為MECPS的體外研究奠定了基礎(chǔ)。對(duì)編碼MECPS的基因的克隆有助于進(jìn)一步在分子水平上闡釋MECPS在生物次生代謝產(chǎn)物合成中所起的作用，進(jìn)而提高植物中次生代謝產(chǎn)物的含量。目前為止，編碼MECPS的基因已從細(xì)菌38、衣原體39及擬南芥36銀杏40北美紅豆杉42三尖衫42等中克隆得到，他們的研究表明，SmMEDPS在不同植物中具有高度的相似性，推測(cè)MECPS在不同植物中具有相似的功能。1.5本課題研究的意義及思路1.5.1研究意義中藥有效成分，多來源于藥用植物次生代謝過程中合成的天然產(chǎn)物，是植物長期演化過

28、程中特有基因共同調(diào)控的產(chǎn)物，在生物體內(nèi)由一些關(guān)鍵酶通過一系列催化反應(yīng)所合成，存在特定生物合成途徑。挖掘與中藥有效成分生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶，并對(duì)編碼這些關(guān)鍵酶基因進(jìn)行深入的功能分析及其調(diào)控研究，逐步闡釋中藥有效成分形成的分子機(jī)制并加以利用，將是改良中藥種質(zhì)資源品質(zhì)、提高有效成分含量和開展有效成分代謝工程的重要途徑，對(duì)于推動(dòng)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。丹參酮類化合物主要通過MEP途徑進(jìn)行生物合成，MECPS參與丹參酮類化合物的合成，對(duì)丹參酮合成具有重要作用。SmMECPS的過表達(dá)可能會(huì)通過MEP途徑增加質(zhì)體中C10，C20，C40的生成，進(jìn)而增加丹參酮類地生成量。編碼MECPS的基因目前已從擬南芥36

29、銀杏37北美紅豆杉38三尖衫39等植物中克隆得到，但目前尚未從丹參中獲得。對(duì)SmMECPS的克隆有助于進(jìn)一步在分子水平上闡釋MECPS在丹參酮類生物合成中所起的作用。本課題通過對(duì)編碼MECPS的基因進(jìn)行克隆，首次從丹參中獲取編碼MECPS的基因，以便后期對(duì)其進(jìn)行深入的功能分析及其調(diào)控研究，逐步闡釋丹參酮類化合物形成的分子機(jī)制并加以利用，提高丹參中丹參酮類化合物的含量，推動(dòng)丹參的現(xiàn)代化研究。 1.5.2研究思路及技術(shù)路線研究表明，Ag+和酵母提取物（YE）能刺激丹參毛狀根丹參酮類成分的迅速積累43,44,此時(shí)丹參酮生物合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，可提取丹參酮生物合成mRNA,mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄即可獲取

30、cDNA,根據(jù)前期丹參深測(cè)序所獲取的基因片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第一鏈cDNA快速擴(kuò)增（RACE）獲取目的片段，克隆獲得大量目的片段，通過測(cè)序以獲得目的片段序列，連接3和5端序列即獲得目的基因全長。技術(shù)路線如圖1-3。根據(jù)基因片段設(shè)計(jì)引物丹參誘導(dǎo)材料丹參RNA提取RACE克隆測(cè)序拼接獲得全長cDNA圖1-3 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料來源丹參毛狀根，用發(fā)根毛狀菌ATCC15834感染丹參苗（陜西商洛）獲得（由中國林業(yè)科學(xué)學(xué)院邱德有研究員惠贈(zèng)）。6-7V培養(yǎng)基,黑暗條件下25培養(yǎng)保存。2.1.2 菌株和質(zhì)粒DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；pM

31、D19-T Vector購自Takara公司。2.1.3主要試劑TaKaRa LA Taq，TaKaRa LA Taq with GC Buffer，TaKaRa Ex Taq，均購自TaKaRa公司；酵母提取物(Yeast Extract)購自oxoid公司；硝酸銀購自BioBasic公司；羧芐青霉素(Amp)購自欣經(jīng)科公司；IPTG(Isopropyl-D-thiogalactoside)購自Sigma公司；其他試劑均是分析純。2.1.4主要設(shè)備儀器微量移液器： Eppendorf公司產(chǎn)品；ND-1000型Nano Drop 定量儀：基因有限公司產(chǎn)品；Gene Amp PCR Syster

32、m 9700:基因有限公司產(chǎn)品；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀：北京市六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)：基因有限公司產(chǎn)品；PIG-30型培養(yǎng)箱： CARBOLITE公司產(chǎn)品；超聲波清洗機(jī)SB25-12DTD：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Elix3超純水系統(tǒng)： Minipore公司產(chǎn)品；Micro one微型離心機(jī)：基因有限公司產(chǎn)品；5810R型臺(tái)式高速（冷凍）離心機(jī)： Eppendorf公司產(chǎn)品；BS210S和BS2000S型電子天平： Sartorius公司產(chǎn)品；3510PH計(jì)： JENWAY有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋：基因有限公司產(chǎn)品；TNA-8002型電熱恒溫水浴鍋：鞏義市予華

33、儀器有限公司產(chǎn)品；RB-5A型低溫水浴鍋： TECHNE公司產(chǎn)品；DHG-9145型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海-恒科技有限公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床：江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；3410型超低溫冷凍冰箱：基因公司產(chǎn)品；SC-242型立式保鮮柜：海爾公司產(chǎn)品；MDF-388-C型低溫冰箱：SANYO公司產(chǎn)品；SW-CJ-1G和SW-CJ-2FD型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。2.2試驗(yàn)方法2.2.1植物材料培養(yǎng)及處理方法丹參毛狀根的懸浮培養(yǎng)6-7V培養(yǎng)基配制：大量元素（mg·L-1）(NH4)2SO4 100,KNO3 800, Na2HPO4·12H2O 20，Mg

34、SO4·7H2O 250，CaC12 200，NaH2PO4·2H2O 150，KCI 200；鐵鹽(mg·L-1，)：(EDTA)2FeNa 18.4；微量元素(mg·L-1)：NaMoO4·2H20 0.25，CuSO4·5H2O 0.25，CoC12·6H2O 0.25，KI 0.05，MnSO4·4H20 4，ZnSO4·7H2O 1.5，H3BO3 5；有機(jī)元素(mg·L-1)：Bl 0.5，B6 0.5，煙酸 1.5，肌醇 100；根據(jù)需要加入蔗糖30g·L-1，然后調(diào)節(jié)p

35、H5.5-6.0。取6-7V培養(yǎng)基（不含激素）暗藏保存的丹參毛狀根，在無菌條件下將2g濕根接種于裝有200mL無激素的6-7V液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)至18d后作為試驗(yàn)材料。培養(yǎng)條件為25，80r.min-1，黑暗條件下懸浮培養(yǎng)。植物材料的處理酵母提取物（yeast extract,YE）生物誘導(dǎo)子的制備：取25g酵母提取物溶于125mL蒸餾水中，加入100mL無水乙醇，置于4 冰箱靜置4d，傾去上清液，膠狀沉淀溶于125mL蒸餾水中，加入無水乙醇（乙醇含量達(dá)80%）二次沉淀，離心，沉淀溶于100mL蒸餾水中，120 滅菌20min，冷卻后置于4 冰箱備用

36、。誘導(dǎo)子Ag+溶液配制：取AgNO3 5.096g 溶于100mL蒸餾水中，制備得300mmol·L-1的Ag。酵母誘導(dǎo)子和Ag+處理：2g濕根接種于裝有50mL無激素的6-7V 液體培養(yǎng)基的125mL三角瓶中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，向培養(yǎng)18d的丹參毛狀根培養(yǎng)基中分別加入誘導(dǎo)子組合YE+Ag+（YE 500l、Ag+ 16.7l）進(jìn)行誘導(dǎo)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別于YE+Ag+處理后24h，36h后收獲，用吸水紙吸干，于液氮速凍后-70保存，用于提取總RNA。丹參總RNA提取（CTAB-LiCl法）與檢測(cè)試劑配制：提取緩沖液：2%CTAB（W/V）；100mmol·

37、L-1Tris-HCl（Ph8.0）；25mmol· L-1EDTA；2.0 mol·L-1NaCl；2%PVP40；0.5g·L-1亞精胺；以上溶液滅菌后加入巰基乙醇使其濃度為2%。SSTE：0.5%SDS；1 mol·L-1NaCl；10m mol·L-1Tris-HCl（Ph8.0）；1mmol·L-1EDTA。處理：研缽、杵子、試劑瓶等玻璃器皿均用錫紙包裹，180烘烤8h；離心管、槍頭等均用0.1%DEPC處理；RNA提取過程中所用溶液除Tris外，均用DEPC（終濃度為0.1%）37處理12h，然后高壓滅菌備用。操作步驟：（

38、1）取10ml提取緩沖液放置50ml離心管預(yù)熱至65；（2）取材料約2g，在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的離心管中，充分振蕩混勻；（3）用等體積氯仿萃取兩次，7500g離心15min，上清液加入1/4體積的10 mol·L-1LiCl，混勻后放置4沉淀過夜；（4）7500g離心20min，沉淀用500lSSTE在65溶解5min，用等體積氯仿抽提，13000g離心5min；（5）上清液加入2倍體積無水乙醇，-70放置2h；（6）413000g離心20min，沉淀室溫干燥10min后溶于40-100lDEPC處理的水中，置于-80冰箱備用?？俁NA檢測(cè)：RNA溶液用DE

39、PC處理過的水稀釋10-15倍，利用GenQuant核酸定量儀測(cè)定OD260/280的比值，確定RNA的含量和純度。取稀釋液5-8l在1.5%瓊脂糖凝聚上以15Vcm-1電壓快速電泳，觀察28S與18S的比值以確定RNA的完整性。2.2.2引物設(shè)計(jì)及合成特異引物（Gene-Specific Primers,GSPs）的設(shè)計(jì)原則：23-28nt；50-70%GC，Tm65，最好是Tm70(可用于Touchdown PCR)。根據(jù)GSPs設(shè)計(jì)原則，針對(duì)基因芯片所獲得的MECPS基因片段使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)5和3端特異性引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。2.2.3第一鏈cD

40、NA的合成試劑：SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)試劑盒操作步驟(按照試劑盒說明書進(jìn)行)： （1）將以下試劑混勻，在微型離心管中短暫離心，放于室溫至第（6）步反應(yīng)，作為3和5第一鏈cDNA合成的反應(yīng)體系。2.0l 5X First-Stand Buffer 1.0l DTT(20mM)1.0l Dntp mix(10mM) 4.0l Total Volume（2）將下列試劑加入無菌離心管中5-RACE-Ready cDNA 3-RACE-Ready cDNA RNA樣品 1-3l RNA樣品 1-3l5-CDS primer A 1l

41、 3-CDS primer A 1l加無菌水至 終體積3.75l 加無菌水至 終體積4.75l（3）充分混合后短暫離心（4）72溫浴3min，42冷卻2min,14000g離心10s，使內(nèi)容物聚集于離心管底部。(5)向5-RACE-Ready cDNA反應(yīng)體系中加入1l SMARTer IIA oligo。 (6) 在微型離心管中依次加入以下試劑，室溫混勻4.0l Buffer Mix from Step 10.25l RNase Inhibitor(40u/l)1.0l SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(100u) 5.25l Total Volume(

42、7)將（6）中所得的混合液加入第（5）步的5-RACE-Ready cDNA或第（4）步3-RACE-Ready cDNA反應(yīng)體系中，使總體積為10l。（8）充分混合后短暫離心（9）循環(huán)加熱器中42溫浴90min,70溫浴10min。（10）溫浴后，加100l Tricine-EDTA Buffer稀釋第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物（11）將所得到得第一鏈cDNA產(chǎn)物-20保存?zhèn)溆茫杀４?個(gè)月）。2.2.4cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）試劑：SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)試劑盒操作步驟(按照試劑盒說明書進(jìn)行)：（1）制備PCR Master

43、Mix：每50lPCR反應(yīng)體系中，加入如下試劑，輕輕混勻。PCR-Grade Water 34.5l 10× Advantage 2 PCR Buffers 5l dNTP Mix(10mM) 1l 50×Advantage 2 Ploymerse Mix 1l總體積(Master Mix) 41.5l（2）充分混勻（不能產(chǎn)生氣泡），然后短暫離心。5-RACE反應(yīng)體系 3-RACE反應(yīng)體系 5-RACE-Ready cDNA 2.5l 3-RACE-Ready cDNA 2.5lUPM(10M) 10l UPM(10M) 10lGSP1(10M) 1l GSP2(10M)

44、1lMaster Mix 41.5l Master Mix 41.5l總體積 100l 總體積 100l（4）PCR反應(yīng)條件：5個(gè)循環(huán)： 94 30s 72 2min5個(gè)循環(huán)： 94 30s 70 30s 72 2min25個(gè)循環(huán)：94 30s 68 30s 72 2min如果沒能得到特異清晰的目的條帶，則可以考慮在此基礎(chǔ)，同樣條件下增加5-10個(gè)循環(huán)，進(jìn)行二輪PCR。2.2.5 T-A連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)/白菌落篩選及陽性克隆PCR鑒定使用TaKaRa公司的pMD19-T Simple Vector，實(shí)驗(yàn)前合成pMD19-T Simple Vector的通用引物 (M13R：CAG GAA ACA

45、 GCT ATG ACC ;M13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGT)進(jìn)行陽性克隆PCR鑒定和采用酶切的方法鑒定陽性克隆。(1)在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5l pMD19-T Simple Vector 1l Insert DNA(回收得到的5-RACE產(chǎn)物) 4l總體積 5l (2)加入5l (等量)的Solutionl(在冰中溶解使用)；(3)16連接過夜；(4)全量(10l)加入到100l的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min；(5)42加熱45s后，再放置冰中l(wèi)min；(6)加入500l不含Amp的LB培養(yǎng)基，37靜置培養(yǎng)60min，10000rpm離

46、心1min,傾去上清液，約剩200l左右；(7)在LB固體培養(yǎng)基的平板中央，滴加40l的X-gal(2%)、7l的lPTG(20%)和200l上述培養(yǎng)60min過后的菌液，通過藍(lán)/白菌落篩選法進(jìn)行陽性克隆的初步篩選;(8)用涂布器涂布均勻，37避光正立培養(yǎng)，直至涂布的全部菌液吸收完全，37恒溫箱中倒立培養(yǎng)過夜;觀察出現(xiàn)籃白斑情況；(9)挑斑過程在紫外線滅菌后的超凈臺(tái)中操作:挑取平板中的白斑(大小適中、獨(dú)立、均勻等)，置于預(yù)先加有500l含AMP的LB培養(yǎng)基的EP管中；(10)靜置數(shù)分鐘，將挑取的菌液充分混懸于培養(yǎng)基中(11)37恒溫振蕩培養(yǎng)約3h后，取3l菌液進(jìn)行PCR，檢測(cè)目的片段是否與載體

47、有效連接上25l PCR反應(yīng)體系: Ex Taq(5U/l) 0.2l dNTP Mixture(各2.5mM) 2.0l 10×Ex Taq Buffer 2.5l Primer M13-R 0.5l Primer M13-F 0.5l菌液(DNA模板) 1l加無菌水至總體積 25lPCR反應(yīng)條件:94 5min35個(gè)循環(huán)： 94 30s56 30s 72 2min*72 7min(備注:*表示PCR產(chǎn)物的片段>3kb，且每加1比則延伸溫度延長 1min)(12)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將出現(xiàn)目的片段條帶的菌液，取100l送測(cè)序，其余則加甘油至終濃度為15-30%于-70

48、保存。2.2.6 SmMECPS的全長cDNA用軟件DNAMAN將克隆所得3端和5端測(cè)序片段拼接; 拼接所得SmMECPS序列在NCBI()數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用NCBI ORF Finder (/gorf/gorf.html)對(duì)SmMECPS基因的全長序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)分析。第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1丹參總RNA使用CTAB-LiCl法提取的丹參總RNA,OD260/280的比值為1.90，濃度約為462.5ng·l-1，28S與18S比值約為2，未降解，符合逆轉(zhuǎn)錄要求。瓊脂糖

49、電泳結(jié)果如圖3-1。圖3-1丹參毛狀根總RNA電泳圖28S18S總RNA3.2 5RACE以設(shè)計(jì)的GSPI(5' CGTCGGAGTGAGCTTCGCAGCCTCGAT 3')為5RACE特異引物，進(jìn)行cDNA5末端的擴(kuò)增。PCR條件為 94 5min，94 30s、72 2min(5個(gè)循環(huán)) ，94 30s、70 30s、72 2min（5個(gè)循環(huán)）94 30s、68 30s、72 2min(25個(gè)循環(huán))，72 10min。擴(kuò)增得到長約500bp的特異性cDNA片段(圖3-2)?？寺y(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明測(cè)得的片段與其他植物物種中的MECPS基因有較高的同源性，并

50、且與原始SmMECPS的5'端部分序列重合，所以認(rèn)為這一片段即SmMECPS cDNA的5'端序列。M1100bp250bp500bp750bp2000bp圖3-2 5RACE電泳產(chǎn)物 M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）；1：5RACE產(chǎn)物MCS551000bp3.3 3RACE根據(jù)己知MECPS基因片段設(shè)計(jì)的3RACE特異引物為GSP2(5' CAGTTCGGCTAATGCACGAGGCAGGCT 3')，以GSP2為擴(kuò)增引物，進(jìn)行SmCPS cDNA3末端的擴(kuò)增。PCR條件為 94 5min，94 30s、72 2min(5個(gè)循環(huán)) ，94 30s、70

51、30s、72 2min（5個(gè)循環(huán)）94 30s、68 30s、72 2min(25個(gè)循環(huán))，72 10min。擴(kuò)增得到長約500bp的DNA片段(圖3-3)?？寺y(cè)序結(jié)果（表3-2）進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明測(cè)得的片段與其他植物物種中的MECPS基因有較高的同源性，并且與原始SmMECPS的3'端部分序列重合，所以認(rèn)為這一片段即SmMECPS cDNA的3'端序列。M12000bp1000bp750bp500bp250bp100bp目的條帶圖3-3 3RACE電泳產(chǎn)物M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）；1：3RACE產(chǎn)物3.4 SmMECPS全長序列及序列分析拼接所得序列如

52、圖3-4所示，SmMECPS基因的全長序列共1062bp，扣除3末端poly(A)，實(shí)際為1034bp。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與蘿芙木等植物中的已知的MECPS基因序列識(shí)別率均高于70%，推測(cè)其即為丹參中的克隆MECPS的基因序列。5ATGGGGACAGCGGCTCATTCACCTTCCAAACCAGCAGCCAGAACCACACGCGCCGCCGCACGCGCCCACGAATTCTTCGATATGGCTATGGCTGGTTCCCTCTGCTACGCCGGCCCGCTTCCCATCAAGACCTCCTCAAAGCAACCCACCGTGCGATCACCCGGAGCGGGGCCGTGCGCAGCGCGAAACTTGCAGCTTCCCTCGTTGAAATTCGCGGCGAGACCGTCTTCCTCGACGGTGGTGGCGGCCGCCGCGAGCACGGTGGGAGCAGAGATTCAGTCCGGAGCTGCAACTCCGGCGAAGGTTCTGCCTTTCCGCGTCGGCCACGGATTTGACCTTCATCGGCTCGAGCCGGGGTATCCCCTCATTATCGGCGGCATCAATATTC