不同溫度下貯藏一年后唐山秋瓜超干種子抗氧化酶活性的變化

1、目錄中文摘要1Abstract 2引言31材料與方法 51.1材料 51.2實(shí)驗(yàn)方法 51.2.1酶液提取 51.2.2丙二醛（MDA含量測定 61.2.3超氧化物歧化酶（SOD活性測定 61.2.4過氧化氫酶（CAT活性測定 61.2.5愈創(chuàng)木酚過氧化物（POD酶活性測定 71.2.6 超氧陰離子自由基的測定 71 .2 7有機(jī)自由基清除的測定 82 結(jié)果與分析82.1 貯藏一年后種子內(nèi)丙二醛含量的變化 92.2貯藏一年后種子內(nèi)SOD舌性的變化 102.3貯藏一年后種子內(nèi)CAT活性的變化112.4貯藏一年后種子內(nèi)POD舌性的變化 122.5 貯藏一年后種子超氧陰離子自由基變化 132.6 有

2、機(jī)自由基清除的測定 133 討論 143.1 超干種子的抗氧化系統(tǒng)分析 143.2 種子在含水量貯藏問題 15致謝 16參考文獻(xiàn) 17不同溫度下貯藏一年后唐山秋瓜超干種子抗氧化酶活性的變化摘要 ：本文測定剛經(jīng)過超干處理不同含水量的黃瓜種子的丙二醛含量、過氧化氫酶和超氧 化物歧化酶活性， 愈創(chuàng)木酚過氧化物酶活性， 和在不同貯藏溫度下貯藏一年后再次測定不同 含水量的黃瓜種子的丙二醛含量、 過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性， 愈創(chuàng)木酚過氧化物酶 活性， 超氧陰離子自由基活性以及去自由基的消除速率等， 來比較不同貯藏溫度下， 以及不 同含水量下，酶系統(tǒng)活性的變化，來研究超干貯藏。結(jié)果顯示 : 黃瓜種子含

3、水量降低至不低 于 2%時(shí)，對種子發(fā)芽率無不利影響，對種子活力指數(shù)也無顯著影響。種子過氧化氫酶和超 氧物歧化醉等酶系統(tǒng)保持完好， 有所下降，但不是特別明顯， 丙二醛含量有些許升高， 也無 顯著變化。研究認(rèn)為超干處理唐山秋瓜貯藏一年后酶活性顯示黃瓜種子唐山秋瓜適宜超干貯 藏，且在含水量 2%時(shí)，酶活性相對較高，適合貯藏。關(guān)鍵詞： 黃瓜種子；超干貯藏；生理生化特性；最適貯藏含水量 ：Change of antioxidant enzymes activity of cumcumber(cv.tangshan qiugua ) ultra-dry seeds stored at differentt

4、emperature after a yearStudent majoring in Seed science and engineering zhufengSupervisor Yan MinAbstract: This paper deal with just after ultra- dry processing the cucumber seed different moisture to testactivity of MDA ，CAT ，SOD ，POD ，and Superoxide radicalactivity and to free radical eliminate ra

5、te, etc. And in different storage temperature storage a year later testagain . To compare different storage temperature, and different watercontent, the activity of enzyme system changes, to study ultra- dry storage. The results show: Cucumber seed moisture content is reduced to no less than 2% of s

6、eed germination rate, no adverse effect on seed vigor index, nor a significant impact CAT,SODOf Cucumber seed enzyme system remain intact ,just a little drcease.Content of MDA also no significant change in,just a little rise.Studies suggest that ultra-dry processing tangshan autumn melon storage a y

7、ear later enzyme activity show cucumber seed tangshan autumn melon, and for ultra- dry storage in moisture content 2% when, enzyme activity is relative taller, suitable for storage.Key words: ； Cucumber seed ； ultra-dry storage ； Physiological and biochemical characteristics ； The optimum storage wa

8、ter conten t引言種子是植物種質(zhì)資源的主體， 當(dāng)今世界各國把更多的注意力放在建設(shè)現(xiàn)代化 種子低溫庫上 1 ，但這對發(fā)展中國家來說建庫和維持其運(yùn)轉(zhuǎn)的巨額費(fèi)用是難以承 受的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。尋求取代低溫庫的其他經(jīng)濟(jì)簡便的方法已是一個亟待解決的問 題。根據(jù)貯藏溫度與種子自身含水量之間存在某種程度上的互補(bǔ)關(guān)系 , 即通過降 低種子含水量可以在提高溫度條件下達(dá)到較高含水量在低溫下貯藏的同樣效果。 因此 , 采用低水分貯藏是對發(fā)展中國家或貧困地區(qū)避免種質(zhì)流失的一種具有實(shí) 用性且耗資低的有效途徑 , 也是保護(hù)生物多樣性并可持續(xù)利用的有利措施。研究表明, 將種子水分降至 5%以下的超干貯藏 , 常溫下可達(dá)相

9、近貯藏效果而 節(jié)約費(fèi)用。種子超干貯藏作為一項(xiàng)新技術(shù)已普遍為人們所關(guān)注 1 。種子超干的目 的是在節(jié)能的前提下有效地保存種質(zhì)資源及其遺傳完整性， 防止種質(zhì)資源和基因 的丟失。這就要求種質(zhì)資源超干及超干貯藏后其遺傳基因是相對穩(wěn)定的， 不能因 為超干及超干貯藏而影響其遺傳穩(wěn)定性 2 。芝麻、花生、亞麻、洋蔥、芥菜、油 菜、葛芭、 向日葵等作物種子的研究證實(shí)， 超干處理可以使種子活力長時(shí)間保持 較高水平，延緩種子衰老， 且對種子無傷害。 雖然超干處理能提高種子的抗老化 能力，但當(dāng)種子含水量低于某一臨界值時(shí)， 種子壽命將不再延長， 甚至出現(xiàn)干燥 損傷，種子活力下降的現(xiàn)象。因此，不同類型種子超干貯藏的最適

10、含水量不同。朱誠、程紅焱、 Eillis 3 等將一些種子的含水量降低到安全“下限”以下 , 可顯著地提高其抗老化的能力 , 具有較好的耐藏性。 Smith 和 Berjar 指出脂質(zhì)過 氧化是種子老化的主要原因之一。迄今為止 , 已對花生、甜菜、油菜、高粱、杜 仲、柑桔、芝麻、紅花等 30 多種植物進(jìn)行了超干燥研究。孫愛清等進(jìn)行了超干 種子生理和細(xì)胞學(xué)研究。周詳勝等研究表明 , 油菜、蘿卜、黑芝麻種子適宜超干 保存4 。朱誠等研究了花生種子超干貯藏中 , 酶系統(tǒng)活性和丙二醛變化。陶梅等 探索了種子超干脫水的實(shí)用方法 5 。種子的貯藏過程就是生命的衰老過程， 衰老的自由基學(xué)說是當(dāng)前很受重視的

11、熱點(diǎn)學(xué)說 。正常生理狀態(tài)下，自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，只有當(dāng)種子處 在不利于生長的物理和化學(xué)因素下， 這樣產(chǎn)生的自由基得不到消除， 或者內(nèi)源性 自由基的產(chǎn)生和消除失去平衡時(shí)，自由基對機(jī)體常常會造成損傷 6。自由基游離 在細(xì)胞內(nèi)， 有較強(qiáng)的氧化作用， 能引發(fā)膜上不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應(yīng)， 使生 物膜受到嚴(yán)重破壞。超干過程中脂質(zhì)過氧化程度的減弱與大分子水膜失去導(dǎo)致自由基毒害加劇 的傳統(tǒng)說法相矛盾， 其機(jī)理可能是在脫水過程中， 特異蛋白質(zhì)以及可溶性糖等物 質(zhì)代替水保護(hù)了生物大分子， 使其免受自由基傷害。 研究認(rèn)為種子中自由基在低 水分下運(yùn)動受阻和攻擊力減弱，超干種子內(nèi)高水平的自由基對種子基本

12、沒有傷 害。超干處理使種子內(nèi)自由基水平增高， 而回水處理和吸脹過程中自由基可以顯 著地清除 6。丙二醛是種子在貯藏過程中隨著劣變的發(fā)生而逐漸積累的有毒的脂質(zhì)過氧 化產(chǎn)物，其含量可以表現(xiàn)種子脂質(zhì)過氧化程度； 釋放的揮發(fā)性醛類物質(zhì)是種子脂 質(zhì)經(jīng)過各種途徑氧化的綜合結(jié)果，同時(shí)反映脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的劣變程度7 。種子內(nèi)自由基清除系統(tǒng)與種子活力之間的關(guān)系十分密切。 超氧化物歧化酶 ( SOD) 、過 氧化物酶 (POD) 及過氧化氫酶 (CAT) 是種子自身抵制活性氧、 清除自由基的酶促 系統(tǒng) 。經(jīng)過一年時(shí)間貯藏的黃瓜 8等超干種子吸脹萌發(fā)后仍能保持較高的酶活 性，與低溫貯藏種子并無明顯的差異， 但是未超

13、干種子的脫氫酶活性則大部分喪 失。這表明超干種子內(nèi) POD 等清除自由基的酶促系統(tǒng)并未受破壞，一旦種子吸 水萌動，可協(xié)同抗氧化劑共同清除在貯藏期間劣變積累的自由基等毒害物質(zhì)， 從 而保證超干種子較高活力水平。目前的一些研究表明 , 超干保存中種子的最適含水量在不同類型的種子中并 不相同 , 這就要求對不同類型的種子進(jìn)行超干保存效果及最適含水量的研究, 以便為提高超干保存種質(zhì)的效果提供依據(jù) 8 。黃瓜種子超干貯藏方面已有相關(guān)報(bào)道 但超干最適含水量和具體操作技術(shù)方面還有待深入研究。為此, 我們研究了超干對黃瓜種子活力及其抗氧化系統(tǒng)的影響。本試驗(yàn)在已有的研究基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步展開對超干處理方法對黃瓜種

14、子生化影 響的研究， 在生化指標(biāo)測定上內(nèi)容更多， 涵蓋了黃瓜種子的自由基的測定， 去自 由基的測定，抗氧化酶活性測定和MDA含量的測定，用更多方面的數(shù)據(jù)來研究超 干處理方法對黃瓜種子生化影響。本文在不同貯藏溫度下貯藏一年后測定了 CAT,POD,SOD|由基酶活性指標(biāo)，以及自由基的消除速率，研究超干處理后得到 的不同含水量的黃瓜種子在貯藏一年后對生化指標(biāo)的變化， 以期探尋到超干處理 黃瓜種子的最適含水量，為更好的貯藏黃瓜種子奠定良好基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料黃瓜(Cucumis sativas L.)種子，品種唐山秋瓜，原始含水量 7.1%,發(fā)芽率 88%。實(shí)驗(yàn)于 2011 年 5 月在

15、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)種子生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.2 實(shí)驗(yàn)方法參照朱誠的方法 9,采用硅膠干燥法,種子置于尼龍網(wǎng)袋,埋于干燥器內(nèi)硅膠中，硅膠與種子重量比為10:1, 25C恒溫下脫水干燥，每天更換經(jīng)120C充分 干燥冷卻后的硅膠。 每隔一定時(shí)間稱重, 以制備不同含水量的種子。 制備好的超 干黃瓜種子用雙層鋁箔袋包裝，并分別放在15C、25C、35C下貯藏。種子含水量測定根據(jù)國際種子檢驗(yàn)規(guī)程 (ISTA,2007) 7 中的國際標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，在 103C± 1C下烘干17h后，放人干燥器中，待其冷卻后稱重。再按種子含水量的 測定方法 8準(zhǔn)確測定含水量， 獲得種子的含水量分別為： 1.0%、 2.0%

16、、 3.0%、 4.0%、 5.0%。超干種子用雙層鋁箔袋包裝，分別放在15C、25C、35C下貯藏。1.2.1 酶液的提取分別取不同含水量的種子 2克用液氮研磨成粉末， 再加 10毫升 KH2PO4-K2HPO4 緩沖液(50 mmol/L, pH 7.0)。在4C的條件下，15000 rpm離心2 Omin。上清 液即為酶提取液 9 。1.2.2 丙二醛 (MDA) 的測定參照朱誠的方法 9 。丙二醛的提取同抗氧化酶提取相同。利用硫代巴比妥酸 (TBA) 在酸性下加熱與組織中 MDA 產(chǎn)生粉紅色的 3,5,5-三甲基惡唑 -2,4-二酮。取1ml提取液中加入5ml 0.5% TBA，混合液

17、在95C的水浴中保溫30min后， 立即置于冰浴中冷卻，然后在15000g下離心10min,測定波長532nm、600nm和 450nm下的吸光度值。計(jì)算公式：用公式 CTBARS(nmol/L)=(A532-A600)-0.0571* (A450-A600) /0.155計(jì)算 TBARS 的濃度，以干重為基礎(chǔ)計(jì)算 TBARS 的含量1.2.3超氧物歧化酶(SOD)活性測定采用 SOD 抑制氮蘭四唑 (NBT) 在光下的還原作用來測定 SOD 活性。取質(zhì)地 相同，透光度好的150X15mm試管40支，其中暗中對照管1支(調(diào)零)，光下 對照管 3 支，樣品測定管 36支(每個含水量設(shè)三個重復(fù))

18、。分別向各支試管中加 入 50 mmol/L pH 7.8 的磷酸緩沖液 1.5ml ,130 mmol/L 甲硫氨酸 0.3ml ,750 卩 mol/LNBT 0.3ml, 0.1 mmol/L EDTA-Na2 0.3ml。再向樣品測定管中加入 0.1ml酶提取液 和0.5ml蒸餾水，向光下對照管和暗中對照管中加入蒸餾水0.6ml。然后向各支試管中加入20卩mol/L核黃素(用時(shí)現(xiàn)配)0.3ml,立即給暗中對照管用雙層黑色 紙?zhí)渍诠?。將試管?nèi)試劑搖勻，放入1300-1500IX的光下，溫度為30E的環(huán)境下， 進(jìn)行光照反應(yīng)40min。反應(yīng)時(shí)間達(dá)到時(shí)，用雙層黑色塑料袋遮蓋各試管，以終止 反應(yīng)

19、。以暗中對照管調(diào)零，于560nm下進(jìn)行光密度測定。SOD活性以抑制NBT 光化學(xué)反應(yīng)的 50%為一個酶活性單位。計(jì)算公式為SOD 活性(U g-1FW h-1) =( (A0As) >Vt >60)/(A0>.5 :FW VsXt)A0 光下對照管吸光度， As 樣品測定管吸光度， Vt 樣品提取液總體積( ml)， Vs 測定時(shí)粗酶液量( ml)， t 顯色反應(yīng)光照時(shí)間( min)， FW 樣品鮮重( g)。1.2.4過氧化氫酶(CAT)活性測定取10ml試管4支，三支樣品測定管(S1 S2 S3)，一支對照空白管(S0)。 測定管每管加粗酶液 0.1ml ，磷酸緩沖液(

20、PBS) 3ml。對照空白管加 0.1ml 酶液，磷酸緩沖液( PBS) 3ml。將所有試管在25r下預(yù)熱后，將對照管中溶液倒入石英比色皿中，再加入0.1ml 1M/L的"Q立即在240nm下測定吸光度。樣品測定管加入 0.1ml1M/L HQ 測加入后第 4 min 吸光度，待 3 只管全部測定完后，計(jì)算酶活性。計(jì)算公式：以每分鐘A240減少0.1的酶量為一個酶活性單位CAT活性U/(g.min)= A240X Vt/ (0.1 > VsX t > FW,其中 240=AS0- (AS1+AS2+AS3/3AS0:對照管的吸光度AS1 AS2 AS3 :樣品測定管的吸光

21、度Vt :提取酶液總體積(ml)Vs: 測定時(shí)所用酶液體積( ml)FW為樣品鮮質(zhì)量(g)t :加H2Q2開始到最后一次讀數(shù)的時(shí)間(min)0.1為A240下降0.1時(shí)的1個酶活性單位(U)1.2.5 愈創(chuàng)木酚過氧化物酶活性測定POD)9參照朱誠的方法。在H2O2存在下過氧化物酶可將愈創(chuàng)木酚生成四鄰甲氧基 苯酚，該產(chǎn)物在 470nm 下有特殊吸收峰，因此可用分光光度法間接測定過氧化 物酶的活性。取上清液120卩加入試管中，加入50mmol pH7.0的磷酸緩沖液3ml,加0.1% 的愈創(chuàng)木酚1ml,25的水浴中預(yù)熱3min，加入100 mmol的H2O2 1.0ml，在470nm 下反應(yīng)測定A

22、470的動力學(xué)變化。用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，測第 4min的吸光度，重復(fù) 3次。以每克鮮組織每分鐘 A470值變化0.10為一個酶活性單位(U),計(jì)算酶的 活性。計(jì)算公式：POD 活性(Ug-1FWmin-1) =(XXVt)/(0.1 VSXt >FW)X為樣品測定管吸光度，Vt為提取液總體積(ml),Vs為測定用酶液量(ml)， t為測定時(shí)間(min) , FW為樣品鮮重(g)。1.2.6 超氧陰離子自由基的測定 10原理：超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)氧分子得到一個電子而形成的自由基。根據(jù)核外電子排布規(guī)律，新獲得的電子必然與已有的n電子的自 旋方向相反， 因此該自由基相當(dāng)活躍。

23、 在化學(xué)性質(zhì)上， 既可以做氧化劑又可以作 還原劑，而且本身也可以歧化為 O2和H2O2。由于該自由基活性強(qiáng)，因此可以 直接攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，引起膜脂過氧化 10 。由于羥胺可以被超氧陰離子自由基氧化為亞硝酸， 反應(yīng)靈敏度高，專一性強(qiáng)， 所以可以用氧化羥胺生成的亞硝酸的量來表示該自由基的產(chǎn)生量， 同時(shí)也可以計(jì) 算出其產(chǎn)生速率。步驟：(1) 取 0.5ml 上清酶液，加入緩沖液 0.9ml 和 0.1ml10mmol/ml 鹽酸羥胺，充分混 勻。25°C中反應(yīng)20min。(2) 取出反應(yīng)后溶液，再依次加入 1ml 17mmol/ml 對氨基苯磺酸和 1ml 7mmol/ml a -

24、萘胺。25C下反應(yīng)20min。(3) 分光光度計(jì)下測定 530nm 下 OD 值(4) 用標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鈉溶液與對氨基苯磺酸和 a-萘胺反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（5）根據(jù)樣品的 OD 值讀取對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的含量，計(jì)算超氧陰離子自由基的產(chǎn)生 速率。單位 umol/（min.g） 干重。1.2.7 自由基的清除的測定參考許申鴻和杭瑚（1999）的方法。利用穩(wěn)定性有機(jī)自由基DPPH溶液的特征 紫紅色色團(tuán)和特有的吸收峰，以分光光度法測定加種子提取液后 A517 吸收的下 降表示其對有機(jī)自由基清除能力 10。取0.5g的種胚和子葉研磨，用5ml 50%乙醇25C浸提5h，間歇振搖，2-4C 5000rpm離心15m

25、in，取上清液。反應(yīng)體積2mL, DPPH濃度128mmol/L,以50% 乙醇配制。反應(yīng)時(shí)加0.1ml。室溫下靜置測第20min吸光度變化（以50%乙醇調(diào) 零）。在此條件下保留的 DPPH%，即卩R=（A-B）*100/A。，而ORSC=l-R。A0為未加樣的DPPH （1.9ml DPPH十0.1ml50%乙醇）的吸光度。A 為樣品與 DPPH （1.9ml DPPH 十 0.1ml 樣品）反應(yīng)后的吸光度，B為樣品空白（1.9ml 50%乙醇+0.1ml樣品）的吸光度。重復(fù)3次。2 結(jié)果與分析2.1不同溫度下貯藏一年超干黃瓜種子丙二醛（MDA含量的變化自由基是一類具有奇數(shù)電子的分子、 原子

26、和離子， 游離在細(xì)胞中具較強(qiáng)的氧 化能力，引發(fā)膜上不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)，形成MDA等多種過氧化物的降解產(chǎn) 物，對生物起嚴(yán)重的破壞作用 ; 丙二醛是種子在貯藏過程中隨著劣變的發(fā)生而逐 漸積累的有毒的質(zhì)過氧化產(chǎn)物， 其含量常用以表示種子中脂質(zhì)過氧化程度 12 。丙 二醛（MDA是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量的高低可以反映細(xì)胞膜 系受損的程度。MDA是脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物，MD/積累越多，表明活性氧，自 由基活性越高， 對生物膜系統(tǒng)的毒害越嚴(yán)重。 在酸性和高溫度條件下， 可以與硫 代巴比妥酸（TBA ）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮），其 最大吸收波長在532n

27、m,最小吸收波長在600 nm。但是測定植物組織中 MDA 時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與 TBA 顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最 大吸收波長在 450nm， 532nm 處也有吸收。黃瓜種子超干過程中丙二醛（ MDA） 含量的變化如圖 1。從圖1中可以看出：三個溫度各個相同含水量與未貯藏相比MDAt曾大，而在三個溫度下貯藏一年后 MDA差別不是很大，從圖中看出MDAt曾加的量幅度也不 大，適度的超干處理經(jīng)過貯藏對這些 MDA含量有影響但并不是特別明顯，MDA會 稍增大。25C貯藏時(shí)含水量在2%寸MDA達(dá)到最大，而15C時(shí)含水量5%寸最大， 但都差別不大。含水量%量含圖1 :不同溫度下貯藏

28、1年后唐山秋瓜超干種子 MDA含量2.2不同溫度貯藏一年超干黃瓜種子超氧化物歧化酶 (SOD)活性的變化超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于需氧代謝細(xì)胞中，是一種清除生物體內(nèi)具 有強(qiáng)烈毒性的超氧陰離子自由基的酶，它催化下列反應(yīng)：2O-+2Hf H2Q+Q,反應(yīng) 產(chǎn)物H2Q2可被過氧化氫酶進(jìn)一步分解或被過氧化物酶利用。因此，超氧化物歧化酶有保護(hù)生物體免受活性氧傷害的能力，可以防止膜脂過氧化，減輕膜傷害，提高植物抗性。已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關(guān)系13。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑(NBT在光下的還原作用來確定 酶活性大小。在有可被氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在

29、 有氧的條件下極易再氧化而產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的化合物，藍(lán)色化合物在560nm處有最大吸收，而超氧化物歧化 酶(SQD)可清除超氧陰離子自由基從而抑制了藍(lán)色化合物的形成。因此，光還原 反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深說明酶活性愈低，反之，酶活性越高 網(wǎng)。據(jù)此可計(jì)算出 酶活性大小。超干處理對黃瓜種子 SOD舌性的影響見圖2從圖中看出，經(jīng)過三個溫度貯藏處理的黃瓜， SOD活性比未貯藏要稍微低， 在這三個溫度中，貯藏溫度提高，SOD活性降低，低溫有利于維持S O D活性, 延緩組織衰老。其變化趨勢是在含水量在 2%以上時(shí)，酶活性變化不是很明顯， 尤其在35C下SOD的活

30、性稍低于于其它兩個溫度，大體上在三個貯藏溫度在含 水量2%是活性最高未貯藏 15C25 E35 r圖2不同溫度下貯藏1年后唐山秋瓜超干種子 SOD活性2.3不同溫度下貯藏一年超干黃瓜種子過氧化氫酶 (CAT)活性的變化HO在240nm波長下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液 在240nm波長下吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出 過氧化氫酶的活力。過氧化氫酶催化分解組織中高濃度的 HO,從而使H壓控制 在較低水平，降低H2壓產(chǎn)生0H對機(jī)體造成的危害13。超干處理對黃瓜種子 CAT 活性的影響見圖3。從圖中可以看出，黃瓜種子未貯藏時(shí)在含水量為 2%寸，CAT達(dá)到

31、最高，隨著 含水量的升高，CAT活性先升后降，貯藏一年后，CAT活性與未貯藏的種子相比， 差異明顯，下降顯著。超干貯藏一年后 CAT在各個溫度下，活性下降顯著，CAT 未貯藏時(shí)活性很大，且在 2%寸達(dá)到最大，然而經(jīng)過一年貯藏下降很大，活性很 低。400350 300 性 250 活 200 nA 150 100 -p50 0 !_lU!_ J12345含水量圖3不同溫度下貯藏1年后唐山秋瓜超干種子 CAT活性2.4不同溫度下貯藏一年后POD活性變化POC廣泛存在與植物體中，在 H2O2存在下過氧化物酶可將愈創(chuàng)木酚生成四 鄰甲氧基苯酚，該產(chǎn)物在470nm下有特殊吸收峰，因此可用分光光度法間接測

32、定過氧化物酶的活性。本實(shí)驗(yàn)是以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過氧化物酶的底 物，在該酶存在下，H2Q可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的 4-鄰甲氧基苯酚，其反 應(yīng)為：該紅棕色的物質(zhì)在波長470nm處有最大光吸收,故可通過測470nm處的吸光 度變化來測定過氧化物酶的活性16。從圖4中可以看出：超干處理黃瓜種子在貯藏一年后，總體上三個溫度處理 的POD舌性比未貯藏要高，在這三個溫度中，其變化總趨勢是隨著種子含水量的 增高，酶活性變化不是特別明顯。整體上是隨著溫度的提高POD提高了，可以說 超干處理貯藏一年后在15C和25C下相差不大，POD舌性變化不大,15 C和35C 下含水量在3%寸，POD勺活性

33、達(dá)到最高。而在25E時(shí)含水量在2%寸，POD舌性 高。POD舌性整體上有點(diǎn)隨含水量先增后減，但不是很明顯。100806040200未貯藏15C25 r廠 35°C圖4不同溫度下貯藏1年后唐山秋瓜超干種子 POD活性2.5不同溫度下貯藏一年后超干黃瓜種子超氧陰離子自由基活性變化超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)氧分子得到一個電子而形成 的自由基。根據(jù)核外電子排布規(guī)律，新獲得的電子必然與已有的n電子的自旋方 向相反，因此該自由基相當(dāng)活躍。在化學(xué)性質(zhì)上，既可以做氧化劑又可以作還原 劑，而且本身也可以歧化為 02和H2O2。由于該自由基活性強(qiáng)，因此可以直接 攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，引起

34、膜脂過氧化。從圖5中可以看出：超干處理黃瓜種子在貯藏一年后，三個溫度處理貯藏 一年的自由基生成速率比未貯藏要低很多， 在這三個溫度中，其變化總趨勢是隨 著種子含水量的降低，自由基的含量先下降后有點(diǎn)上升，在含水量2%是自由基產(chǎn)生最少?？傮w上說經(jīng)過超干處理貯藏一年后可以使種子內(nèi)自由基的含量下降， 未貯藏時(shí)含水量在2%寸，自由基含量最少，很明顯5234含水量454035性30性25 由20 自1510510圖5不同溫度下貯藏1年后唐山秋瓜超干種子超氧陰離子自由基變化2.6不同溫度下貯藏一年后超干黃瓜種子自由基消除速率利用穩(wěn)定性有機(jī)自由基 DPP H溶液的特征紫紅色色團(tuán)和特有的吸收峰，以 分光光度法測

35、定加種子提取液后 A517吸收的下降表示其對有機(jī)自由基清除能 力。從圖6中可以看出：經(jīng)過超干處理黃瓜種子在貯藏一年后，三個溫度下貯藏 一年后自由基的消除速率比未貯藏的有下降， 且在三個溫度下自由基消除速率整 體上相差不大，15C含水量2箱口 25E含水量5%寸消除率最低。從總體上來說含 水量低，自由基的消除速率較大。100亶未貯藏 15C25 E35 r1 23459080706050403020100含水量%圖6不同溫度下貯藏1年后唐山秋瓜超干種子自由基消除速率3 討論3.1 超干種子的抗氧化系統(tǒng)分析植物體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生會引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，細(xì)胞膜完整性遭到破壞， 嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。CA

36、T和SOD是植物體內(nèi)清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化的保 護(hù)酶系統(tǒng)16。CAT是重要的H2O2清除酶，清除植物體內(nèi)的 HO2,把H2O2還原成沒 有毒性的水。SOD乍為專一清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶，在自由基清除系 統(tǒng)中起著重要的作用17。MDA是植物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的有害代謝物質(zhì)，測定 MDA 的積累量可以指示種子脂質(zhì)過氧化的程度。超干處理的黃瓜種子經(jīng)過不同溫度貯藏一年后導(dǎo)致種子內(nèi)氧自由基大幅度 下降， MDA 含量也比未貯藏的時(shí)候增加。在超干處理的種子經(jīng)過不同溫度貯藏 一年后中檢測到SODS活性，且在不同含水量種子之間變化不明顯， 貯藏一年后 對這些酶活性并無明顯影響18，相比未貯藏有些許下降

37、。CAT活性變化有點(diǎn)明顯， 顯著降低， cat 活力下降說明種子清除氧自由基的能力有下降，說明超干貯藏一 年后的抗氧化系統(tǒng)有所降低， 但不明顯， 對貯藏種子并無太大影響。 但在超干狀 態(tài)下酶促系統(tǒng)不太可能起作用，因而超干種子內(nèi)的非酶促系統(tǒng)肯定起著重要作 用。程紅焱 (1994) 19 測定不同含水量油菜種子內(nèi)非酶促抗氧化劑的結(jié)果表明， 超 干種子中的VE含量比未超干種子高。盡管在超干狀態(tài)下自由基與敏感區(qū)域的接 觸機(jī)會增加， 但脂質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的自衛(wèi)能力， 其原因可能是由于缺乏化學(xué)反應(yīng)介 質(zhì)，以致包括脂氧合酶介導(dǎo)在內(nèi)的脂質(zhì)過氧化受抑制， 反過來超干種子中脂質(zhì)過 氧化程度的減弱又可以降低非酶類自由基

38、清除劑的消耗， 形成一種良性循環(huán)， 即 使SO併口 CAT等在種子極干燥狀態(tài)下不能啟動，仍能有效地避免脂質(zhì)自動氧化17。 本試驗(yàn)通過對唐山秋瓜種子超干處理后 CAT SOD酶活性指標(biāo)值的研究表明，唐 山秋瓜種子含水量在 2%以上抗氧化系統(tǒng)保持良好。3.2 種子含水量的貯藏問題黃瓜種子經(jīng)過超干老化處理，使其含水量降至 5 以下當(dāng)含水量不低 于 2 時(shí)， 吸脹萌發(fā)前給予適當(dāng)?shù)木彎裉幚恚?其種子活力未受明顯影響； 當(dāng)種 子含水量低于 2時(shí)，對種子活力有一定影響細(xì)胞膜統(tǒng)在細(xì)胞代謝活動中起重 要作用，它不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)交流和運(yùn)輸，而且可以影響代謝途徑中的酶活性， 而有些酶本身就存在于膜上， 因此種子活力

39、喪失的代謝變化或多或少由細(xì)胞膜系 統(tǒng)的損傷引起 膜結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定主要表現(xiàn)在膜的選擇透性上， 劣變種子膜功 能的減弱 致使細(xì)胞內(nèi)大量物質(zhì)滲漏， 從而降低種子活力 脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn) 物是丙二醛 ( MDA) ， 隨著劣變的發(fā)生，丙二醛逐漸積累， 會嚴(yán)重地?fù)p傷生物 膜丙二醛濃度可以表示脂質(zhì)過氧化的程度 因此， 丙二醛的測定可以預(yù)測種 子劣變程度 黃瓜超干種子經(jīng)過貯藏后的丙二醛濃度顯著低于未超干種子的， 這說明超干貯藏可以大大降低 MDA的積累，從而減少對生物膜的破壞作用.這也 從脂質(zhì)過氧化的角度證明 。超干種子的貯藏性能得以提高黃瓜種子的最佳含水量不僅取決于種子內(nèi)在的固有屬性， 與溫度也有稍微的

40、影響，不同含水量的黃瓜種子其貯藏的最佳含水量隨溫度的改變也會發(fā)生改變， 但不是很明顯，總體上，黃瓜種子貯藏一年后含水量在2%以上都能保持較高活力，而且抗氧化酶系統(tǒng)未遭破壞，同時(shí)，在不同含水量種子之間SOD CAT酶活性變化不明顯， 適度超干處理對這些酶活性并無明顯影響。 試驗(yàn)結(jié)果表明黃瓜超 干種子在適度的含水量范圍內(nèi)抗老化能力明顯高于未處理種子的。 黃瓜超干種子 具有良好的耐貯藏性超干種子含水量應(yīng)在 2% 以上因此利用超干技術(shù)保存黃瓜 唐山秋瓜種子種質(zhì)資源是可行的致謝首先我要衷心感謝我的導(dǎo)師嚴(yán)敏副教授。 導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)的科研態(tài)度和開放的 學(xué)術(shù)思想給了我極大的啟迪和幫助， 使得我能順利完成論文的選題、 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及 實(shí)際操作。導(dǎo)師淵博的知識、 敏銳的洞察力、 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和求實(shí)的工作作風(fēng)， 給我留下了深刻的印象， 鞭策我一步一個腳印進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 將使我終生受益， 并激 勵我不斷進(jìn)取， 奮