Artemin在大腸桿菌中的表達(dá)及寡聚體的電鏡觀察

1、文章編號：10071032(2005)03£253£5artemi n在大腸桿菌中的表達(dá)及寡聚體的電鏡觀察陳韜(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128)摘 要：通過定點(diǎn)突變生成的方法，分別構(gòu)建了全長artemin cdna和2個c末端缺失突變體arc&9和ar-ca35, 以及2個單點(diǎn)替代突變體ar-c22和ar-c61,并在大腸桿苗bl21pro中得到表達(dá)，重組蛋白的表達(dá)水平約占細(xì)胞 總蛋白的23%電鏡檢測結(jié)果表明，巫組artemin寡聚體呈規(guī)則的花環(huán)狀，直徑為18nm左右，大于鐵蛋白重 鏈的寡聚體(12 nm)和來自于休眠卵的artemin寡聚體(1

2、6 nm), 2個c末端的缺失突變對artemin的寡聚化沒有明顯 影響，而單點(diǎn)替代突變ar-c22對寡聚化影響較小，arc61則完全不能寡聚化，說明cy$對于維持artemin的空 間構(gòu)象有著重要的作用.關(guān) 鍵詞：artemin; 6xhn標(biāo)記；表達(dá)；寡聚體；透射電鏡 中圖分類號：tq937文獻(xiàn)標(biāo)識碼：aexpression of artemin in e.coli and tem observation of oligomerchen tao(college of animal science and technology, hnau, changsha 410128, china)abs

3、tract: full-length artemin. 2 c-terminal deletions ar-ca19 and ar-ca35f and 2 single-point substitutions ar-c22 and ar-c61 were constructed by site-directed mutagenesis and expressed in e. coli bl21pro, yielding the production of recombinant artemin to 2%-3% out of total cellular protein examination

4、 of electronic microscopy showed a regular, rosett-like structure of recombinant artemin oligomer wilh a diameter of about 18 nmf larger than that of horse ierritin heavy chain(12 nm) and native artemin from diapause cysts (16 nm). there was no obviously effect of two c-tcrminal deletions on oligome

5、rization however. i wo single-point deletions presented diflerent impact on oligomerization, ar-c22 appeared relatively less influencial, whereas ar-c61 resulted in oligomerization failuret suggesting that cys6i plays a key role to maintain the conformation of artemin.key words: artemin; 6><hn

6、-iag; express!on； oligomer»【ransparent electronic microscopeartemin 是存在于鹵蟲 artemia franciscana 休眠 卵中的2種主要蛋白質(zhì)之一，其含量為細(xì)胞內(nèi)可溶 性蛋白的1015%.但隨著休眠卵的激活而發(fā)育成 幼蟲,artemin的含塑逐漸減少并至完全消失卩円由 于鹵蟲休眠卵在這一階段具有相對較強(qiáng)的抗脅迫能 力，artemin被認(rèn)為是一種脅迫蛋白，與細(xì)胞的抗逆 性有密切的關(guān)系® 早期的研究認(rèn)為，artemin對 于維持休眠胚胎細(xì)胞內(nèi)水的平衡有一定作用；由 于在artemin 級結(jié)構(gòu)中有9個半胱氨

7、酸殘基， artemin可能和微管蛋白國一樣，通過其氧化還原作 用，為細(xì)胞內(nèi)提供一個還煉的狀態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)的蛋 白質(zhì)避免由于氧脅迫造成的修飾作用.最近的研究 表明，artemin具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，是一種rna 的分子伴侶，在細(xì)胞內(nèi)能結(jié)合一些可翻譯的rna,收稿日期：2005-03-11基金項目：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)穩(wěn)定人才基金資助(700302) 作者簡介：陳 韜(1969)，男，漢族，湖南長沙人，博 士，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授.與rna的穩(wěn)定有關(guān)切利用edman降解法對artemin的測序結(jié)果表明, artemin單體由229個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì) 量為25 976®,除缺少第一個甲硫氨

8、酸外，與從 cdna推導(dǎo)的氨基酸序列完全相同.序列同源性 分析表明，雖然artemin比鐵蛋白多了 4550個氨 基酸殘基，但二者具有相似的一級結(jié)構(gòu)，并裝配成 亞基數(shù)目相同的寡聚體純化的artemin沉降系數(shù) 為19s,相對分子質(zhì)量為573 000610 000,表明其 寡聚體含有24個亞基，亞基之間通過二硫犍結(jié)合在 一起.為進(jìn)一步了解artemin的結(jié)構(gòu)，以及特定的 氨基酸殘基和結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)構(gòu)的影響，筆者通過定點(diǎn) 突變生成的方法，在大腸桿菌(e co")中表達(dá)了不同的artemin突變體，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究.1材料與方法1. 1可表達(dá)的重組artemin cdna的構(gòu)建以 arte

9、min cdna 克隆(ar03-g12,genbank ac no. ay062896)為模板和合適的引物(表1),通過 pcr擴(kuò)增合成全長的artemin編碼序列，擴(kuò)增片段 克隆到ta克隆載體pcr2.1(invitrogen)后轉(zhuǎn)化 ecoli dh5a,利用藍(lán)白斑篩選獲得含有插入片段 的克隆，將提取的質(zhì)粒(promega)用限制性內(nèi)切酶 sall和bamhi消化后，利用gfx凝膠回收試劑盒 (amersham biosciences)回收 artemin 插入片段，然 后連接到用sall和bamw消化的原核表達(dá)載體 6xhn 標(biāo)記的 pprotet. e133 (bd bioscien

10、ces)中, 此質(zhì)粒載體稱為pprar然后以pprar為模板， 利用定點(diǎn)突變生成(svatagene)合成2個缺失突變和 2個單點(diǎn)替代突變(表1).所有的更組cdna都通過 dna測序以確保序列的正確性，然后轉(zhuǎn)化e. coli bl21pro(bd biosciences),用于表達(dá)重組蛋白.表1用于構(gòu)建全長artemin編碼序列和突變體的引物table 1 primers used :n constructing full-length artemin coding sequence 2nd musn"artemin cdnas齟基酸殘基缺失或替代引物名稱引物序列(53)ar-fl

11、nonefl-5/-upgtggtcgacatggcaacagaaggtgcaagfl-b/n-dngggatccaacttggacgggcaactcar-ca19212-230ai9upgtcaacaagtgacctag aatctaattagccgaacgaattatttgacgctgaa19dnicagcgtcaaataattcgttcggct.aati'agattctaggtcacttgtrgacar-ca35196-23035upcaagaattgtcatgagcaaaitctagcatcccaagataccttctttga35dncaaagaaggtatcttgggatgc

12、t.xgaaintgctcal'gacaattc1tgar-c22c?2a22c22upggcaaagttcaaatggacgccccaagcaggc acaatc22dna/yi'tgtgcctgcltggggcgtccalitgaacrn'gccar-c61c61uptl'ctatgccagagacgccaaggctgccgtggc61dnccacggcagccttggcgtctctggcatagaa12 重組artemin的表達(dá)與純化為表達(dá)重組的artemin及其突變體，將含有重 組基因的ecoli bl2ipro培養(yǎng)在含有spe(spectin- omy

13、cin,50 pg/ml)和 cm(chloramphenicol,34 pg/ml) 的lb液體培養(yǎng)基中,37 °c下?lián)u床培養(yǎng)(200 f/min)2 3 h至 od600接近0.5,加入 atc(anhydrotetracy- cline, bd biosciences 400 ng/ml),在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng) 8h.將培養(yǎng)物冰上放置15 min,離心15min(4 °c, 3 000xg)收集細(xì)菌，用預(yù)冷的pbs溶液洗滌細(xì)菌i 次蛋白質(zhì)粗提方法i®如下：將收獲的細(xì)菌懸浮在 e/w(equilibration/washing buffer ,50 mmol/

14、lsodium phosphate, ph 7.5, 300 mmol/l naci)緩沖 液(2 ml/100 ml培養(yǎng)物)中，依次加入溶菌酶(0.75 mg/ml), pmsf(phenylmethylsulfonyl fluoride , 1 mmol/l), pepstatin a(1 pg/ml)and leupeptin(l pg/ml) 后室溫下消化15 min,用液氮和42弋水浴快速凍 融3次，然后用超聲波(branson ultrasonics)理3 次，每次10 s,間以冰浴2 min.細(xì)苗裂解物離心 20 min(4 x：, looooxg)后，將上清轉(zhuǎn)移到一新的離 心管

15、中，一20 £保存或立即用于純化巫組artemin 的純化(bd talon meta! affinity resins)方法如 下：將金屬親和樹脂用eav緩沖液平衡3次，每次 平衡后700xg離心2 min,將蛋白粗提物加入到樹 脂中，室溫下置于旋轉(zhuǎn)混合器上20 min,使6xhn 標(biāo)記的重組artemin與親和樹脂結(jié)合，700蜜離心2 min,去掉e/w緩沖液，用1520倍體積的含有咪 瞰imidazole, 10 mmol/l)的e/w緩沖液洗滌樹脂3 次后將樹脂轉(zhuǎn)移到洗脫柱中，加入5倍體積的洗脫 緩沖液(50 mmol/l sodium phosphate, ph 7.5,

16、300 mmol/l naci, imidazole, 150 mmol/l),室溫靜置 5 min,然后分部收集純化的蛋白質(zhì)，毎個分部0.5 ml蛋白粗提物用12.5%的sds聚丙烯酰胺凝膠 電泳(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophresis, sds-page)后，英一用考馬斯亮藍(lán) 染色，脫色后直接照相，利用image quant軟件對 目標(biāo)蛋白和總蛋白進(jìn)行定量，以其比例作為冃標(biāo)蛋 白的相對表達(dá)水平;其二是轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素脫上, 進(jìn)行western bio【分析.將轉(zhuǎn)移有蛋白質(zhì)的硝酸纖 維素膜用 tbs 緩沖液(tri

17、s/hci 0.01 mol/l, naci0.14 mol/l, ph 7.4)沖洗后，用 0.2%的 ponceau-s 溶液染色至蛋白質(zhì)條帶可見，蒸惚水沖洗后用5% 的脫脂牛奶tbs-tween 20(0 tween 20)封閉 45 min,然后分別與稀釋在tbs-tween 20中的 anti6xhn 抗體(bd biosciences, 1 : 2 000,本文結(jié) 果沒有顯示)和抗artemin抗體(1 : 20 000)室溫放置 15 min,用 tbs-tween 20,hst(tris/hcl 0.01 mol/l, nacl, 1 mol/l 0.5% tween20, p

18、h 7.4)各洗 2 次， tbs-tween 20洗1次后與用tbs-tween 20稀釋的 二抗 hrp(horscradish peroxidase )結(jié)合的羊抗兔 igg(jackson immunochemicals, inc., 1 : 10 000)室 溫培育 10 min,分別用 tbs-tween 20(2 次)，hst(2 次)，tbs(1 次)洗滌各 3 min，用 ecl(enhanced chemiluminesccncc, amersham pharmacia biotech) 反應(yīng)后用rx-bx光片(labscientific inc.)曝光.1.3電鏡檢查將 5

19、 jil鐵蛋口(horse,heavy light chain,sizma) 和不同的重組artemin溶液(0.1 pg/pl)轉(zhuǎn)移到銅格上 (塑料膜一側(cè)朝上)，室溫處理1 min,小心用吸水紙 吸去多余的溶液，再滴加5pl乙酸鈾溶液，負(fù)染1 min,同樣用吸水紙吸去多余溶液后用于電鏡檢 測.將處理過的樣品于透射電鏡(fe1, tecnai-12)下 檢測并照相.2結(jié)果2. 1可表達(dá)的全長和突變的artemin cdna的構(gòu)建 通過pcr擴(kuò)增的方法獲得含全長的artemin編 碼序列，克隆到原核表達(dá)載體6xhn標(biāo)記的 pprotct. e133中，在插入序列的上游，有1個21 個氨基酸殘基的

20、附加片段，其中包括12個殘基的 6xhn標(biāo)記和5個殘基的腸肽酶(enterokinase, ek) 識別位點(diǎn)，因此，含全長artemin融合韮因的表達(dá) 產(chǎn)物長度為251個氨基酸殘基.2個缺失突變是通 過定點(diǎn)突變生成的方法，分別將第196和212個氨 基酸殘基的密碼子替代為終止密碼子tag,使產(chǎn)物 的按基末端缺失35和19個氨基酸殘基，2個單點(diǎn) 替代突變則是用同樣的方法，將第22和61個殘基 半胱氨酸替代為丙氨酸，所有產(chǎn)物如圖1所示.2. 2 在e col/中表達(dá)重組的artemin將轉(zhuǎn)化有重組 artemin cdna 的 e.coli bl21 pro 用atc(400 ng/ml)誘導(dǎo)8

21、h后，通過凍融和超聲波 處理后獲得蛋白質(zhì)粗提物，樣品通過sds-page電 泳后，用于考馬斯亮藍(lán)直接染色(圖2町以及western blot分析(圖2b)電泳結(jié)果表明，除ar<a35(占總 蛋白的0.6%左右)外，所有的重組蛋白在誘導(dǎo)后都得 到較高水平的表達(dá)(占總蛋白的2%-3%,圖2c),分 別在相對分子質(zhì)量為35 000(ar- fl, ar-c22, ar-c61)和33 000(ar-ca19)左右増加了 1個明顯的 條帶，與western blot結(jié)果一致.c-ienmnal extension«xhna-llchxar-flmm qi1b ii21 aa11 aa

22、19 aa6xhnar- ca19ar- ca356xhn c/a 22arc22ar-c61«xhnc/a用召 ij圖1 artemin突變體的示意圖fig j schematic diagram of artemin mutants116.066.245.03502345625.0184144asds-page: m2白質(zhì)分子址標(biāo)準(zhǔn).1空白對服，錢白粗提物來 自于轉(zhuǎn)化有不含描入片段的農(nóng)達(dá)錢體pprotcte的大腸桿曲，2全長 artemin, 3 ar-ca19t 4 ar<d35t 5 ar-c22f 6 ar-c6i; b western blot: 抗artemin抗

23、體的檢測結(jié)采;cjfi組artemin的相對表達(dá)水平用u標(biāo)傲白 條帶和細(xì)胞總蛋白的光密度的比值百分比來示圖 2 重組 artemin 的 sds-page 和 western blot 結(jié)果flg.2 the results of sds-page and western blot for recombinant artemin2.3電鏡檢測結(jié)果鐵蛋白和重組artemin的電鏡檢測結(jié)果如圖 3電鏡下鐵蛋白的寡聚體呈表面光滑的球狀體，直 徑約為】2nnb中心有一明顯的空腔，內(nèi)含鐵原子（約 4 500個，黑色部分）何，直徑68nm左右,在重組 的artemin中，除ar-c61外，都觀察到有規(guī)則的

24、花 環(huán)狀的寡聚體，直徑為18 nm左右，明顯大于鐵蛋 白的寡聚體和來自于休眠卵中純化的artemin的寡 聚體（約16 nm），而在artemin寡聚體的中心部分 是否有空腔存在無法確定.8 馬的鐵蛋白蟲鏈;b全長 artemin; c.ar-ca19; d ar-ca35; e. ar-c22; f.ar<61圖3鐵蛋白與重組artemin s聚體的電鏡照片fig.3 electroo microscopic pictures of fcrritio and recombinant artemin oligomers3 討論低的ar-ca35也曾獲得很高的表達(dá)（本文沒有顯示所有的重組結(jié)

25、構(gòu)都通過限制性內(nèi)切酶消化， pcr擴(kuò)增和測序的分析.結(jié)果證明與克隆ar03- g12序列相比，用pcr構(gòu)建的全長artemin編碼序 列中，有4個核昔酸發(fā)生改變（本文沒有顯示結(jié)果）, 推導(dǎo)的氨基酸序列則完全相同.對發(fā)生改變的4個 核昔酸位置分析表明，變化均出現(xiàn)在密碼子的第3 個堿基位置，對編碼的氨基酸殘基沒有影響，而其 他的重組結(jié)構(gòu)序列與全長編碼序列完全一致.sds-page 結(jié)果顯示,ar-fl,ar-c22 和 ar-c61 以及對應(yīng)的純化的蛋白質(zhì)（本文沒有顯示結(jié)果）均出 現(xiàn)在34 000的位置,ar-ca19岀現(xiàn)在32 000的位f大于相對實際分子質(zhì)量（約28 000和26 000）,而

26、純 化的鹵蟲休眠卵a(bǔ)rtemin電泳結(jié)果顯示為27 000左 右，說明位于n末端的標(biāo)記序列對其電泳遷移率 有一定彫響.從重組殞白的表達(dá)水平來看，原核表 達(dá)載體pprotet. e在完全誘導(dǎo)的情況下表達(dá)的蛋 白質(zhì)最高可達(dá)細(xì)胞總蛋白的10%（clontech）,本 實驗中獲得的最高表達(dá)水平為3.4%,即使是表達(dá)最 結(jié)果），表達(dá)水平下降的原因尚不清楚.鐵蛋白是1個24聚體蛋白，相對分子質(zhì)量為 450 000-500 000,其內(nèi)部空腔和外部的直徑分別為8 nm和12 nm,鐵原子jc存在內(nèi)部的空腔中說】.artemin 和鐵蛋白具有相似的一級結(jié)構(gòu)，預(yù)測的二級結(jié) 構(gòu)和寡聚體的空間排列也相同.在寡聚體中

27、，n末 端朝向寡聚體的表面，c末端指向寡聚體的內(nèi)部 .由于artemin的n末端比鐵資白多了 1520個 氨基酸殘基,再加上21個氨基酸殘基組成的標(biāo)記序 列，因此，觀察到的artemin寡聚體立徑（18 nm）明 顯比鐵蛋白的（12 nm）的大，同時較長的n末端延伸 指向寡聚體的表面,使得其外形也有很大的區(qū)別此 外，重組artemin寡聚體宜徑（18 nm）大于天然 artemin寡聚體（16nm）,可能是由于n末端21個氨 基酸殘基的標(biāo)記序列造成的.在artemin的c末端 有一個鐵蛋白所沒有的35個氨基酸殘基組成的延 伸，這個延伸將指向寡聚體的內(nèi)部，占據(jù)其中的空 腔部分，只是在二聚體的2個

28、亞基之間存在很弱的 相互作用.因此可以預(yù)測在全長的artemin寡聚體 中不存在空腔或空腔很小，而在ar-ca19和 ar-ca35則由于c末端的缺失，可以分別形成相應(yīng)的空腔.此外，c末端的缺失對于artemin的寡聚化 也沒有明顯的影響，這一結(jié)果證明了對artemin三 級結(jié)構(gòu)預(yù)測是正確的.不過，c末端的缺失是否 影響artemin功能，還有待于進(jìn)一步的研究.在artemin的一級結(jié)構(gòu)中含有9個半胱氨酸殘 基，這些半胱氨酸殘基相互之間可能形成分子內(nèi)和 分子間的二硫鍵，對于寡聚體的形成或蛋白質(zhì)的功 能或許有著不同的作用.而對人類和馬的鐵蛋白 重鏈結(jié)構(gòu)分析，一些氨基酸殘基在二聚體的形成起 著十分

29、重要的作用，它們分別同時與不同的氨基酸 殘基形成分子間的相互作用，如人類的鐵蛋白重鏈 中的 ser6og-asp44odl（氫鍵），gln7ne2-asp44odl （氫犍），馬的鐵蛋白重鏈中的ser5n-asp44od2（氫 鍵）2鐵說明在鐵蛋白重鏈的二聚體中，se6（人） 或se5（馬）和asp。在空間位置上十分靠近，同吋這 2個氨基酸殘基分別位于二級結(jié)構(gòu)中的a鏈和b鏈 上，即二級結(jié)構(gòu)的表面.在artemin的一級結(jié)構(gòu)中, 與這2個氨基酸殘基對應(yīng)的分別是cys22和cys61, 在單體的二級結(jié)構(gòu)中均沒有相鄰的半胱氨酸，這意 味這2個氨基酸殘基有可能形成分子間的二硫鍵， 對于二聚體的形成有一

30、定的作用，因此構(gòu)建了這2 個氨基酸殘基的替代突變.電鏡檢測結(jié)果以及蔗糖 密度梯度離心結(jié)果（本文沒有顯示結(jié)果）顯示， ar-c22可以觀察到寡聚體的存在，但存在較多的單 體，說明cys22的改變對于artemin寡聚體的形成具 有一定的影響.但這種影響相對較小，而ar-c61 則完全沒有寡聚化，顯示cys61的改變則導(dǎo)致寡聚 體不能形成.這一結(jié)果表明，cys22和cys6】可能形 成二硫鍵，但其對二聚體的形成不是決定性的影響 因索.而cys61則同時還與其他氨基酸殘基形成某 種分子間的相互作用，這種相互作用在寡聚化過程 中十分關(guān)鍵.參考文獻(xiàn)：（1slobin l i. eukaryotic el

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