真核生物基因定位的基本方法和遺傳圖的制作.doc

1、真核生物基因定位的基本方法和遺傳圖的制作圖距(map distance）即指兩個(gè)基因在染色體圖上距離的數(shù)量單位,它是以重組值1%去掉號(hào)表示基因在染色體上的一個(gè)距離單位，即某基因間的距離為一個(gè)圖距單位（map unit， mu）。后人為了紀(jì)念現(xiàn)代遺傳學(xué)的奠基人摩爾根,將圖距單位稱為”厘摩"（centimorgan, cM）。假設(shè)兩基因ab間的重組率為17%，即這兩個(gè)基因相距17個(gè)圖距單位(17cM） ?；蚨ㄎ唬╣ene mapping）是指將基因定位于某一特定的染色體上，以及測(cè)定基因在染色體上線性排列的順序與距離?；蚨ㄎ坏哪康氖峭ㄟ^將基因定位到染色體的基因座上后，以幫助我們理解和開

2、發(fā)生物性狀的遺傳性質(zhì),特別是通過遺傳連鎖將一種性狀的遺傳與另一種性狀或標(biāo)記相聯(lián)系，或者通過將表型差異與染色體結(jié)構(gòu)的改變聯(lián)系起來。這在商業(yè)上可用于改良動(dòng)植物的性狀、定位和克隆人類的疾病基因等。1兩點(diǎn)測(cè)交（twopoint testcross):兩點(diǎn)測(cè)交是指每次只測(cè)定兩個(gè)基因間的遺傳距離，這是基因定位的最基本方法。（我僅重點(diǎn)介紹三點(diǎn)測(cè)交）2三點(diǎn)測(cè)交(threepoint testcross）：三點(diǎn)測(cè)交就是通過一次雜交和一次測(cè)交，同時(shí)確定三對(duì)等位基因（即三個(gè)基因位點(diǎn)）的排列順序和它們之間的遺傳距離，是基因定位的常用方法。用三點(diǎn)測(cè)交能測(cè)出雙交換，因此更能準(zhǔn)確地反映出連鎖基因間的相對(duì)距離。同樣，在做三點(diǎn)

3、測(cè)交時(shí)需要用這三個(gè)基因的雜合子（abc/+，或ab+/+c，或a+/+bc等)同這三個(gè)基因的隱性純合子(abc/abc）測(cè)交.下面還是以玉米的上述三個(gè)基因?yàn)槔齺碚f明，假如用于三點(diǎn)測(cè)交的兩個(gè)親本為：+ + + / + + +和c sh wx / c sh wx,則F1代的基因型為：+ + + / c sh wx，然后F1與三隱性純合體c sh wx / c sh wx測(cè)交，獲得如下的結(jié)果。從上表可以看出，8種表型的實(shí)得籽粒數(shù)各不相等，且相差懸殊，說明它們是連鎖的。下面我們先不考慮wx，只考慮CSh間的情況,這樣就可以計(jì)算出C-Sh間的重組值：C-Sh = (98+107+39+19）/6033

4、= 4。36%。按照同樣的方法可算出ShWx和CWx間的交換值分別為:ShWx = (672+662+39+19)/6033 = 23。07%和CWx = (98+107+672+662)/6033 = 25。51。根據(jù)這三個(gè)數(shù)據(jù)我們可以將這三個(gè)基因作如下的排列：很明顯，25。51 不等于14。36+23。07。剛才我們講過，在兩個(gè)基因之間如果發(fā)生雙交換，從表型上是檢測(cè)不出來的,也就是說雙交換的結(jié)果等于不交換,現(xiàn)在我們?cè)倩氐缴媳?其中（39+19）個(gè)個(gè)體分別在計(jì)算C-Sh和ShWx之間各用了一次，說明有（39+19）的個(gè)體是發(fā)生了雙交換，但是我們?cè)谟?jì)算CWx間的圖距時(shí)，沒有將這個(gè)雙交換值算進(jìn)去

5、，顯然C-Wx間的圖距被縮小了，因此我們必須對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行校正。我們先算雙交換值：（39+19）/ 6033 = 0。96%。由于一次雙交換實(shí)際上包含了二次單交換，所以在計(jì)算C-Wx間圖距時(shí),應(yīng)加上2倍雙交換值，即C-Wx = 25。51+2×0。96 = 27.43.這樣,27。43就等于4。36+23.07了。所以在這里特別要注意：在有雙交換發(fā)生的時(shí)候，計(jì)算圖距時(shí)一定要加上2倍雙交換值。從任何一個(gè)三點(diǎn)測(cè)交的結(jié)果中,我們可以發(fā)現(xiàn)，所得的F2后代的8種可能的表型中，最多的2種是親組合,最少的2種的雙交換產(chǎn)物,中間數(shù)量的4種是單交換的產(chǎn)物。根據(jù)這些規(guī)律,對(duì)于一個(gè)三點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在不計(jì)算重

6、組值的情況下，一眼就能正確判斷這三個(gè)基因的排列次序,即用雙交換類型與親本類型相比較，改變位置了的基因就是處于中間位置的基因。在上面的例子中：只有當(dāng)Sh位于中間的時(shí)候，同時(shí)發(fā)生兩個(gè)單交換后,才可能產(chǎn)生+ sh +或c + wx的個(gè)體,所以這三個(gè)基因的順序是c-shwx，這自然跟我們?cè)谟?jì)算重組值后所得的結(jié)論一致。要注意的是,與兩點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一樣，用三點(diǎn)實(shí)驗(yàn)必需要用三雜合體,因?yàn)槿绻皇请s合體，我們就無法判斷是否發(fā)生了交換。根據(jù)概率知識(shí)，我們知道對(duì)于兩個(gè)獨(dú)立事件,它們同時(shí)發(fā)生的概率等于各自概率的乘積。對(duì)同一染色體上的三個(gè)基因來說，發(fā)生雙交換的概率應(yīng)該是兩個(gè)單交換概率的乘積，在上面的例子中,理論上雙交換率應(yīng)

7、為：23.07 4。36 = 1。0%，可是它的實(shí)際雙交換值只有0.96%，實(shí)際雙交換值小于理論雙交換值.在這里實(shí)際值與理論值相差不是很大,而在有些例子中，理論雙交換值與實(shí)際雙交換值相差很大，譬如說理論雙交換值為0.90%，可實(shí)際只有0。15?？梢娒堪l(fā)生一次單交換時(shí)，它的鄰近基因間也發(fā)生一次交換的機(jī)會(huì)就會(huì)減少，這種現(xiàn)象稱為干涉(interference)。干涉的程度通常用并發(fā)系數(shù)（coefficient of coincidence， c）來表示：并發(fā)系數(shù)（c) = （實(shí)際雙交換值）/(理論雙交換值）其中理論雙交換值為兩個(gè)單交換百分率的乘積。并發(fā)系數(shù)在01之間。如果并發(fā)系數(shù)=1，則說明兩個(gè)單交

8、換之間沒有干涉；如果并發(fā)系數(shù)=0，則說明發(fā)生了完全干涉，也就是說第一個(gè)交換的發(fā)生完全干涉了第二個(gè)交換的發(fā)生，即沒有雙交換。在上面的例子中，并發(fā)系數(shù)=0.96/1.0=0。96, 干擾=1-0.96=0。04。另外在微生物發(fā)生基因轉(zhuǎn)變的時(shí)候，并發(fā)系數(shù)可以大于1,這表示存在負(fù)干涉(negative interference），即一次交換的發(fā)生使第二次發(fā)生交換的頻率增加了。以上講的干涉是就一個(gè)完整的染色體為單位來說的,也叫染色體干涉(chromosomal interference)。我們知道,在減數(shù)分裂的前期，二價(jià)體是由4條染色單體組成的，交換并不限于某二條非妹妹染色單體之間,因而存在1-3、1-

9、4、2-3、2-4各種不同形式的交換 (A,B，C，D），在23之間已發(fā)生了一次交換的基礎(chǔ)上，再發(fā)生2-3二線雙交換、13三線雙交換、24三線雙交換和14四線雙交換的機(jī)會(huì)是均等的。如果在兩條非姊妹染色單體之間的一次單交換會(huì)干涉其它非姊妹染色單體之間的交換，這叫做染色單體干涉(chromatid interference)，一般說來第一次交換僅對(duì)于2-3二線雙交換有干涉，對(duì)其他類型的雙交換沒有干涉。文檔為個(gè)人收集整理，來源于網(wǎng)絡(luò)文檔為個(gè)人收集整理，來源于網(wǎng)絡(luò)遺傳學(xué)圖(genetic map)又稱基因連鎖圖（linkage map)或染色體圖（chromosome map），是一種依據(jù)基因之間的交

10、換值(或重組值），表示連鎖基因在染色體上相對(duì)位置的簡(jiǎn)單線性示意圖。通過一系列的三點(diǎn)測(cè)交或二點(diǎn)測(cè)交，我們可以把一對(duì)同源染色體上各基因的次序及相對(duì)距離標(biāo)定出來，從而構(gòu)成一個(gè)基因的連鎖群。所謂一個(gè)連鎖群（linkage group）是指位于一對(duì)同源染色體上的所有基因群。通過大量的實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)知道一個(gè)生物連鎖群的數(shù)目是等于或少于染色體的對(duì)數(shù)。對(duì)于這一點(diǎn)很容易理解，因?yàn)榛蛭挥谌旧w上，至于少于染色體數(shù)，那是因?yàn)橛行┻B鎖群還未被發(fā)現(xiàn)。圖104是果蠅的遺傳學(xué)圖，我們看到4個(gè)連鎖群正好與4對(duì)染色體數(shù)相符?；蛟谶z傳學(xué)圖上的位置叫座位(locus),一般以最先端的基因位置為0，如果發(fā)現(xiàn)有新基因在更先端的位置時(shí)

11、，就把0點(diǎn)讓給新基因，其余基因的位置亦作相應(yīng)的移動(dòng)。在前面我們已經(jīng)討論，交換值介于0到50,但在遺傳學(xué)圖上我們可以看到超過50圖距單位的,這是因?yàn)樵谶@兩基因間發(fā)生了多次交換，但實(shí)際上這兩基因間的重組值不會(huì)超過50，所以由實(shí)驗(yàn)得到的重組值與圖上的重組值不一定是一致的，因此要從圖上知道基因間的重組值只限于鄰近的基因座位間。我們?cè)谶@里所講的遺傳學(xué)圖的界標(biāo)是一些表型性狀，Botstein等于1980年了提出現(xiàn)代遺傳連鎖圖的概念，主要是將這些單純的表型多態(tài)性界標(biāo)改變?yōu)镈NA序列的多態(tài)性作為界標(biāo)，如RFLP、VNTR、STR、SNP等。文檔為個(gè)人收集整理，來源于網(wǎng)絡(luò)個(gè)人收集整理，勿做商業(yè)用途脈孢霉四分子及

12、其遺傳學(xué)分析 利用脈孢霉（Neurospora crassa)進(jìn)行遺傳學(xué)分析具有許多優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體小,生長(zhǎng)迅速，便于培養(yǎng)；具有象高等生物那樣的染色體，研究結(jié)果可在遺傳學(xué)上廣泛應(yīng)用;除無性繁殖外,還可進(jìn)行有性繁殖，一次雜交可產(chǎn)生大量后代;其無性世代是單倍體,沒有顯隱性,基因型直接在表型上反映出來；一次只分析一個(gè)減數(shù)分裂的產(chǎn)物，而二倍體合子是兩個(gè)不同減數(shù)分裂產(chǎn)生的配子相互結(jié)合的結(jié)果，只有通過測(cè)交實(shí)驗(yàn)才能分析減數(shù)分裂的結(jié)果，手續(xù)麻煩得多。脈孢霉也叫紅色面包霉（Neurospora crassa）,其生活史見上圖。脈孢霉是一種絲狀真菌，它在培養(yǎng)基上象網(wǎng)狀一樣伸展生長(zhǎng)，其單倍體世代是由多細(xì)胞菌絲體(myce

13、lium）和分生孢子(conidium）所構(gòu)成,由分生孢子萌發(fā)形成新的菌絲,這是它的無性世代。在一般情況下，它這樣循環(huán)往復(fù)地進(jìn)行無性繁殖，這時(shí)都是進(jìn)行有絲分裂，因而都是單倍體。脈孢霉的有性過程是由兩個(gè)不同的交配型(mating type)菌絲通過原生質(zhì)的融合和異型核的結(jié)合而形成二倍體的合子。二倍體合子存在的時(shí)間很短,它們能迅速長(zhǎng)成長(zhǎng)形的子囊（ascus)。每個(gè)子囊中的核都進(jìn)行兩次減數(shù)分裂,產(chǎn)生出4個(gè)單倍體的細(xì)胞核，再經(jīng)一次有絲分裂形成8個(gè)核，每個(gè)核被厚膜所包圍形成子囊孢子（ascospores).由此我們可以看出，每一個(gè)子囊中的8個(gè)子囊孢子是單一減數(shù)分裂的產(chǎn)物。子囊孢子在適宜的環(huán)境中萌發(fā),通過

14、連續(xù)的有絲分裂產(chǎn)生新的菌絲體。脈孢霉的合子在子囊內(nèi)進(jìn)行二次減數(shù)分裂所形成的4個(gè)子囊孢子叫四分子（tetrad），對(duì)四分子進(jìn)行的遺傳分析就叫四分子分析（tetrad analysis)。由于脈孢霉的子囊很狹窄，以至分裂的紡錘體不能重疊，只能縱立于它的長(zhǎng)軸之中，所以在子囊里面進(jìn)行分裂的細(xì)胞核是嚴(yán)格按直線順序排列的，因此，在交配中,等位基因通過減數(shù)分裂所產(chǎn)生的細(xì)胞就呈現(xiàn)有規(guī)律的排列-順序四分子(ordered tetrad）。通過四分子分析,我們可以獲得許多重要的對(duì)于遺傳分析的直接資料，譬如我們可以取得分離規(guī)律的直接證據(jù),可以檢驗(yàn)到有無連鎖和交換等。 如用產(chǎn)生紅色菌絲的正常脈孢霉菌種與產(chǎn)生白色菌絲的

15、變種交配，兩個(gè)分生孢子的單核結(jié)合成為二倍體的合子，在子囊中進(jìn)行減數(shù)分裂和有絲分裂，生成8個(gè)單倍的子囊孢子，在子囊未破裂之前將各子囊中的子囊孢子按順序一個(gè)個(gè)地在顯微鏡下用很細(xì)的針剝離出來，進(jìn)行分別培養(yǎng)而獲得每個(gè)孢子的菌絲，結(jié)果將會(huì)見到每個(gè)子囊中有四個(gè)孢子長(zhǎng)出紅色菌絲,另外四個(gè)孢子長(zhǎng)出白色菌絲，成1:1的比例，這是由于等位基因在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生分離的結(jié)果，這樣就更為直接地證明了分離規(guī)律。假設(shè)在同源染色體上有一對(duì)等位基因A和a，如果在著絲點(diǎn)和這對(duì)等位基因之間沒有發(fā)生過交換，那么在第一次減數(shù)分裂時(shí)A和a就完全分開進(jìn)入不同的兩極，第二次減數(shù)分裂時(shí),染色單體分開，進(jìn)入四個(gè)孢子,進(jìn)一步的有絲分裂形成8個(gè)子囊孢

16、子,8個(gè)子囊孢子呈AAAAaaaa(或aaaaAAAA)的排列方式,在這種方式中，A和a基因的分離發(fā)生在減數(shù)分裂的第一次分裂,我們將這種分離方式叫第一次分裂分離（first division segregation，MI)。當(dāng)非姊妹染色單體在著絲粒和基因座(A， a)間發(fā)生交換時(shí),在第一次減數(shù)分裂后，由于在這個(gè)過程中只有同源染色體的分離,因而等位基因A和a仍同時(shí)存在于同一核中，只有到減數(shù)分裂第二次分裂時(shí)，A和a才進(jìn)入不同的核中,所以稱這種情況為第二次分裂分離(second-division segregation,MII）,由此得到的等位基因的排列模式AAaaAAaa(或它的鏡像排列aaAAa

17、aAA)稱為MII模式(圖10-9）。這種模式的特征是在一半的四分子產(chǎn)物中發(fā)生了重組，這種交換型排列模式還有可能出現(xiàn)AAaaaaAA（或aaAAAAaa）,這是由于紡錘體的隨機(jī)趨向所致，”A上a下”和”A下a上"或”A下a上"和"A上a下”都是隨機(jī)的，而且它們的頻率也大致相當(dāng).我們知道染色體上兩個(gè)基因座之間的距離愈遠(yuǎn),則它們之間發(fā)生交換的頻率愈高，因此當(dāng)?shù)诙畏至逊蛛x的子囊愈多，則說明有關(guān)基因和著絲粒的距離愈遠(yuǎn)。所以根據(jù)第二次分裂分離子囊的頻數(shù)，就可以計(jì)算出某一基因和著絲粒間的距離,這距離稱為著絲粒距離（locus-tocentromere distance）。這

18、種以著絲粒作為一個(gè)座位，計(jì)算某一基因與著絲粒的距離（重組值），叫著絲粒作圖（centromere mapping)。下面來看看如何進(jìn)行著絲粒作圖。通過一個(gè)實(shí)例來說明，假設(shè)有兩種不同接合型的脈孢霉菌株，一種是能合成賴氨酸的野生型菌株（記作+），該菌株成熟的子囊孢子呈黑色，另一種是賴氨酸缺陷型（記作-)，這種菌株的子囊孢子成熟后呈灰色。將這兩種菌株進(jìn)行雜交（+×-)，根據(jù)黑色孢子和灰色孢子的排列次序,雜種子囊中減數(shù)分裂的產(chǎn)物共有6種子囊型，其計(jì)數(shù)的結(jié)果見表（表丟了，精神領(lǐng)會(huì)就行了.）表中1和2、3和4、5和6子囊中的子囊孢子的排列方式是互為鏡影的，這說明減數(shù)分裂是一個(gè)交互過程。凡屬第一次

19、分裂分離的子囊，均是著絲粒和所研究的基因間末發(fā)生過交換的，所以稱作非交換型，如子囊型1和2,其基因座的分離方式為2：2。子囊型3、4、5和6均屬于第二次分裂分離的子囊，它們?cè)跍p數(shù)分裂后形成的子囊孢子的排列順序是+_+_(或_+_+)(基因座的分離方式為1:1:1：1)以及+_ _+(或_+_）（基因座的分離方式為1：2：1）。由此可見，凡是第二次分裂分離的子囊，一定是在著絲粒與所研究的基因之間發(fā)個(gè)過交換的,故MII型也稱作交換型。根據(jù)以上分析,合成賴氨酸的基因與著絲粒間的重組值為：即合成賴氨酸的基因與著絲粒間的圖距為7.3cM。以上講的是一對(duì)基因的四分子分析，下面我們來看看二對(duì)基因的四分子分析

20、。在二對(duì)基因雜交時(shí)，如果只考慮性狀的組合，而不考慮孢子排列的順序,可以將子囊分為下列三種類型：1、親二型（parentalditype,PD)： 2種基因型都跟親代一樣； 2、非親二型(nonparental-type，NPD）：2種基因型都跟親代不一樣，是重組型；3、四型(tetratype,T）：4種基因型，2種跟親代一樣，2種跟親代不一樣。 通過四分子分析，可以幫助我們確定二對(duì)基因之間是否連鎖。當(dāng)二對(duì)基因位于不同的染色體上時(shí)，由圖10-12可以看到，在沒有交換時(shí),親二型（PD）和非親二型（NPD）各占50%；在發(fā)生交換時(shí)產(chǎn)生四型(T)，其中親本類型和重組類型也都是各占50%。因此總的來說

21、，當(dāng)二對(duì)基因位于不同的染色體上時(shí)，重組類型占50%，親本類型占50%，這符合自由組合規(guī)律。也就是說當(dāng)親二型的頻率與非親二型的頻率相等時(shí)(PD=NPD)，我們可以說兩個(gè)基因是自由組合的。當(dāng)二對(duì)基因位于同一染色體上即這兩對(duì)基因連鎖時(shí)，產(chǎn)生親二型和非親二型四分子的頻率是不一樣的。如果在二個(gè)基因之間沒有交換，將產(chǎn)生PD型子囊（圖a)；如果在二個(gè)基因之間發(fā)生一個(gè)單交換，將產(chǎn)生T型子囊（圖b)；如果在二基因之間發(fā)生二線雙交換，由于沒有重組子代的產(chǎn)生，仍為PD型子囊（圖c)；如果在二基因之間發(fā)生三線雙交換，因涉及到四條染色體中的三條，則會(huì)有兩種不同的方式，23,4（或13,4）三鏈雙交換和3-1，2（或41

22、，2)三鏈雙交換，但都產(chǎn)生T型子囊（圖d)；如果在二基因之間發(fā)生四線雙交換，將產(chǎn)生NPD型子囊(圖e)。文檔為個(gè)人收集整理,來源于網(wǎng)絡(luò)個(gè)人收集整理,勿做商業(yè)用途綜上所述，親二型(PD）是通過非交換和二線雙交換而產(chǎn)生的，非親二型(NPD）僅僅通過四線雙交換產(chǎn)生，而四線雙交換只是四種可能的雙交換之一（見圖10-13c，d,e），非常之少。因此如果親二型的頻率遠(yuǎn)大于非親二型的頻率(即PD>NPD),我們可以說兩個(gè)基因是連鎖的。一旦我們知道兩個(gè)基因是連鎖的，以及我們知道了每一種減數(shù)分裂四分子類型的相對(duì)數(shù)目，通過下述公式我們就可以算出兩個(gè)基因間的距離: 其中：重組子數(shù)目 = /T + NPD，非重

23、組子數(shù)目（即親本型數(shù)目）= /T + PD。 細(xì)菌的遺傳分析與基因定位由于細(xì)菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，世代周期短,通常20分鐘一代，而且容易獲得各種類型的突變型如合成代謝功能突變型、分解代謝功能突變型、抗性突變型等，所以自20世紀(jì)40年代以來細(xì)菌已成為遺傳學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)材料.細(xì)菌不但可在液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng),也能在瓊脂固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在固體培養(yǎng)基上，我們可以觀察到由單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成的菌落,細(xì)菌的遺傳分析通常是在這樣的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行的.細(xì)菌屬于原核生物(prokaryotes），沒有明顯的細(xì)胞核，不進(jìn)行減數(shù)分裂，其基因的傳遞方式是非減數(shù)分裂式的。細(xì)菌的染色體是裸露的,它比較容易接受帶有相同或不相同物種的基因

24、或DNA片段的插入。細(xì)菌之間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移主要有以下三種方式：轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)化(transformation）是指通過外源DNA進(jìn)行的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化可以分為自然轉(zhuǎn)化（natural transformation）-細(xì)菌能自然地吸收DNA及遺傳轉(zhuǎn)化，和工程轉(zhuǎn)化（engineered transformation)-通過遺傳改變使細(xì)菌能吸收DNA及進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。接合(conjugation)是指由供體菌（donor）和受體菌(recipient）之間的直接接觸而導(dǎo)致的遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移.轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction）是指以噬菌體為媒介所介導(dǎo)的DNA從供體菌到受體菌的轉(zhuǎn)移。自從Aver

25、y等于1944年發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化作用后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化作用在細(xì)菌中是非常普遍的現(xiàn)象。但是對(duì)于某些細(xì)菌如枯草桿菌來說容易被轉(zhuǎn)化，而另一些細(xì)菌如野生型大腸桿菌就不容易轉(zhuǎn)化，因?yàn)檫@些菌所產(chǎn)生的一些酶很容易將外來的DNA降解，后來經(jīng)過科學(xué)家的探索，發(fā)現(xiàn)用一些化學(xué)試劑處理后可增加細(xì)胞膜對(duì)DNA的滲透性,目前在基因工程中就是利用這種方法來轉(zhuǎn)化E。 coli的.不管是自然轉(zhuǎn)化還是工程轉(zhuǎn)化，在一次實(shí)驗(yàn)中只可能是一小部分細(xì)胞（約1%）能夠真正吸收外源DNA。轉(zhuǎn)化時(shí)供體細(xì)菌DNA斷裂成小片段，這些片段的平均長(zhǎng)度約為20000個(gè)核苷酸對(duì)，當(dāng)外源DNA一旦被不同遺傳型組成的受體菌所吸收，外源DNA片段可以和染色體形成部

26、分二倍體,也可能與受體菌染色體之間發(fā)生重組，從而使受體細(xì)胞發(fā)生穩(wěn)定性的遺傳轉(zhuǎn)化。下面以枯草桿菌的自然轉(zhuǎn)化為例說明轉(zhuǎn)化的過程：供體DNA片段帶有野生型a+基因(相對(duì)于受體菌而言），在DNA的吸收過程中，雙鏈DNA中的1個(gè)鏈被降解，因此最后在細(xì)胞內(nèi)僅能發(fā)現(xiàn)1個(gè)完整的線狀DNA鏈，這條單鏈與受體細(xì)胞內(nèi)的環(huán)狀染色體上的同源DNA配對(duì)，形成一個(gè)三鏈結(jié)構(gòu)，在三鏈之間發(fā)生雙交換從而發(fā)生重組，結(jié)果產(chǎn)生一重組受體染色體:在兩個(gè)交換之間的區(qū)域，一個(gè)DNA鏈帶有供體的a+ DNA片段,另一條鏈帶有受體的a DNA片段(產(chǎn)生的另一條鏈被降解），在受體染色體復(fù)制一輪后，其中一個(gè)染色體的二條鏈都帶有a+，即成為a+的轉(zhuǎn)化

27、子，另一子代為a非轉(zhuǎn)化子，它們產(chǎn)生的頻率是相同的。通過轉(zhuǎn)化技術(shù)我們可以判斷所轉(zhuǎn)化的兩個(gè)基因是連鎖的還是獨(dú)立遺傳的，其中一個(gè)可靠的證據(jù)是觀察當(dāng)DNA濃度降低時(shí)轉(zhuǎn)化頻率的改變：如果當(dāng)DNA濃度下降時(shí)，AB共轉(zhuǎn)化(cotransformation)的頻率下降和A或B轉(zhuǎn)化頻率下降程度相同，則說明A和B是連鎖的；如果AB轉(zhuǎn)化頻率的下降將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過A或B轉(zhuǎn)化頻率的下降程度，則說明A和B是不連鎖的.這種方法的原理是這樣的：在較低的濃度范圍內(nèi),DNA濃度與轉(zhuǎn)化頻率成正比關(guān)系,假如兩個(gè)基因在同一分子上,那么濃度降低10倍時(shí)，兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化的頻率也將減少10倍；但是如果兩個(gè)基因在不同的DNA片段上,那么DNA濃度

28、下降10倍時(shí)，兩個(gè)基因共轉(zhuǎn)化的概率將減少100倍(10*10)，而不是10倍，由此可以確定A和B之間是否連鎖。在確定了基因的連鎖關(guān)系之后利用轉(zhuǎn)化我們可以進(jìn)一步作圖。例如，如果基因p和q是經(jīng)常共轉(zhuǎn)化的，基因q和o也是經(jīng)常共轉(zhuǎn)化的，但基因o和p從不能共轉(zhuǎn)化，那么基因的順序一定是pq-o。如果已知幾個(gè)基因之間是緊密連鎖的，我們也可以通過轉(zhuǎn)化來計(jì)算重組值.例如Nester等用枯草桿菌的一個(gè)菌株trp2+ his2+ tyr1+作為供體，提取其DNA向受體trp2 his2 tyr1菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化,結(jié)果如表47所示。從表可以看出，數(shù)目最多的轉(zhuǎn)化子（11940）是3個(gè)座位同時(shí)被轉(zhuǎn)化的類型，這說明所研究的3個(gè)

29、座位在染色體上是緊密連鎖的.由表中計(jì)算的結(jié)果表明，3個(gè)基因的次序是trp2his2tyr1.表106供體trp2+ his2+ tyr1+向受體菌trp2 his2 tyr1轉(zhuǎn)化的結(jié)果及重組值的計(jì)算細(xì)菌主要是無性繁殖,直到1946年J Lederberg和E Tatum發(fā)現(xiàn)不同品系的大腸桿菌間可以雜交并進(jìn)行基因重組，人們才注意到大腸桿菌也存在“性別"差異。 下面我們先來看看1946年Lederberg和Tatum的一個(gè)實(shí)驗(yàn):大腸桿菌K12中有兩個(gè)菌株A和B，菌株A需要在培養(yǎng)基中補(bǔ)充甲硫氨酸met和生物素bio，同時(shí)為鏈霉素敏感，菌株B需要在培養(yǎng)基中補(bǔ)充蘇氨酸t(yī)hr、亮氨酸leu和硫胺

30、素thi,同時(shí)為抗鏈霉素突變型，這種必須在培養(yǎng)基中添加某些物質(zhì)才能生長(zhǎng)的細(xì)菌叫營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph），相對(duì)于缺陷型的野生型菌株則不需要添加任何附加物,叫原養(yǎng)型(prototroph）。對(duì)這幾個(gè)性狀而言，原養(yǎng)型菌株及A、B突變型菌株的基因型分別是： 原養(yǎng)型菌株：met+ bio+ thr+ leu+ thi+。 A菌株：met bio- thr+ leu+ thi+。 B菌株：met+ bio+ thr- leu thi-。 若將菌株A、B分別涂在基本培養(yǎng)基上,則均不能產(chǎn)生任何菌落，若將A和B混合培養(yǎng)在含以上五種成分的培養(yǎng)基上，幾小時(shí)后，離心沉淀物,把沉淀物洗滌后涂布在基本培養(yǎng)基上，發(fā)

31、現(xiàn)長(zhǎng)出了少數(shù)菌落（野生型)，頻率為10-7。但是E。 coli許多生化突變型回復(fù)突變的頻率也是10-7，那么這少數(shù)菌落是不是由于基因突變呢？答案是否定的，因?yàn)榫闍要回復(fù)突變成野生型的話，有2個(gè)基因需同時(shí)發(fā)生回復(fù)突變，其概率只有10-7×10-7=1014;同理，若菌株B要回復(fù)突變成野生型的話，其概率只有10-7×10-7×107=1021，這與重組子出現(xiàn)的頻率相差太遠(yuǎn)。因此從這個(gè)結(jié)果表明在兩個(gè)菌種間發(fā)生了遺傳物質(zhì)的交換。為了證明這種遺傳物質(zhì)的交換是否需要細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸，B Davis設(shè)計(jì)了一種U型管,中間用過濾器隔開，濾器的孔很小，使細(xì)菌不能通過,但培養(yǎng)液和

32、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以通過，在U型管的一臂添加菌株A，另一臂添加菌株B，然后在一端加壓力或吸力，使培養(yǎng)液在兩臂間流通，經(jīng)幾小時(shí)培養(yǎng)后，分別在固體培養(yǎng)基上添平板，未見有菌落的出現(xiàn)，即沒有產(chǎn)生重組子。由此說明這種遺傳交換不可能是由于細(xì)胞破碎產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化因子DNA或從細(xì)胞中分泌的某些物質(zhì)后產(chǎn)生的,而需要兩個(gè)菌株間的直接接觸。換句話說，大腸桿菌也有某種類型的交配系統(tǒng)，這種交配系統(tǒng)能夠?qū)嵭芯c菌之間遺傳物質(zhì)的交換,我們叫這一系統(tǒng)為接合（conjugation)。以上實(shí)驗(yàn)為接合的研究奠定了基礎(chǔ)，那么在細(xì)菌中這種遺傳物質(zhì)的交換是單向的還是雙向的呢？W Hayes在1953年做了這樣一個(gè)雜交實(shí)驗(yàn)，他同樣用大腸桿菌K12的

33、菌株A和菌株B,首先他用高劑量的鏈霉素處理菌株A或菌株B(用鏈霉素處理菌株可以阻礙細(xì)菌的分裂，但并不殺死它們），把處理過的菌株A跟未處理過的菌株B混合，或把處理過的菌株B跟未處理過的菌株A混合，發(fā)現(xiàn)結(jié)果大不相同： 這個(gè)實(shí)驗(yàn)意味著這兩個(gè)菌株在雜交中的作用是不相同的，即不是一個(gè)交互的過程,也就是說大腸桿菌中遺傳物質(zhì)的交換不是交互的，而是單向的。事實(shí)上一個(gè)菌株（如A）是供體(相當(dāng)于雄性)，而另一菌株(如B）是受體（相當(dāng)于雌性)。供體經(jīng)鏈霉素處理后不能分裂，但仍能轉(zhuǎn)移基因，而受體未經(jīng)處理，當(dāng)然仍能分裂，所以接受轉(zhuǎn)移過來的基因后,有可能在基本培養(yǎng)基上形成菌落。至此，Hayes認(rèn)為細(xì)菌的接合是異宗配合(h

34、eterothallic)過程，兩個(gè)親本在雜交中所起的作用不同，提供遺傳物質(zhì)的是供體，相當(dāng)于雄性，接受遺傳物質(zhì)的是受體，相當(dāng)于雌性。Hayes進(jìn)一步假設(shè)在兩個(gè)菌之間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是通過一種叫F的可育因子所介導(dǎo)的，在大腸桿菌中并不是每個(gè)細(xì)胞中都有這種游離的F因子，只有供體細(xì)胞才含有F因子,這種菌株叫F+,受體細(xì)胞則不含有F因子,記作F-，在細(xì)菌的分裂增殖中，F(xiàn)+細(xì)菌產(chǎn)生F+細(xì)菌,F-細(xì)菌產(chǎn)生F-細(xì)菌，但F+與F-混合培養(yǎng)時(shí)，可使F-變成F+。F因子(F factor）又稱為性因子(sex factor)或致育因子（fertility factor）,它實(shí)際上是一種微小的質(zhì)粒,一種封閉的環(huán)狀DNA

35、分子，全長(zhǎng)約94.5kb，僅為大腸桿菌染色體長(zhǎng)度的2%左右,每個(gè)細(xì)胞內(nèi)含1-3個(gè)F因子。F因子結(jié)構(gòu)包含3個(gè)區(qū)域:、復(fù)制起點(diǎn)或原點(diǎn)（)，這區(qū)含有轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)和2個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)oriT是在染色體轉(zhuǎn)移時(shí)進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制時(shí)的復(fù)制起點(diǎn)，oriV是在營(yíng)養(yǎng)時(shí)期，即游離在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立復(fù)制時(shí)的復(fù)制起點(diǎn);、致育基因區(qū)，這些基因使它具有感染性,其中一些基因是編碼生成F纖毛(F pili)的蛋白質(zhì)，即F+細(xì)胞表面的管狀結(jié)構(gòu)，稱為接合管，F(xiàn)纖毛與F- 細(xì)胞表面的受體相結(jié)合，在兩個(gè)細(xì)胞間形成細(xì)胞質(zhì)橋；、配對(duì)區(qū)，這一區(qū)中有4個(gè)插入序列（insertion sequence, IS)，通過和宿主染色體上的IS同源重組或轉(zhuǎn)座(

36、transposition），F(xiàn)因子可以整合到宿主的不同位點(diǎn)上,成為細(xì)菌染色體的一部分，由于宿主染色體上IS的方向不同，F(xiàn)因子整合的方向也隨之不同。如果是兩個(gè)F+或兩個(gè)F混合則不會(huì)產(chǎn)生接合。當(dāng)將F+與F 細(xì)胞混合時(shí),它們即發(fā)生接合（圖10-29),在接合的過程中,供體細(xì)胞（F+)的F因子通過接合管向受體細(xì)胞（F)移動(dòng)，轉(zhuǎn)移時(shí)F因子雙鏈DNA分子中的一條鏈在復(fù)制起點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)缺口，DNA從這里開始復(fù)制，在復(fù)制的同時(shí),一個(gè)拷貝的F因子轉(zhuǎn)移到F 細(xì)胞，在F- 細(xì)胞中合成另一條互補(bǔ)鏈。因此這種F因子的轉(zhuǎn)移有一個(gè)極性問題，即復(fù)制起點(diǎn)總是最先轉(zhuǎn)移，接著以某一特定的方向（順時(shí)鐘或逆時(shí)鐘）轉(zhuǎn)移F因子的其它部分，

37、當(dāng)完整的F因子被轉(zhuǎn)移后，F(xiàn)- 細(xì)胞即成為F+細(xì)胞。在F+與F-的交配中，只有F因子的傳遞而細(xì)菌染色體很難發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此盡管F因子轉(zhuǎn)移頻率很高，但兩者染色體之間重組的頻率卻很低，大約為106。因此F+品系稱為低頻重組（low frequency recombination， Lfr）。文檔為個(gè)人收集整理，來源于網(wǎng)絡(luò)個(gè)人收集整理，勿做商業(yè)用途用一些菌株與F菌株雜交獲得了各種不同的染色體基因，出現(xiàn)重組子的頻率很高，幾乎比正常的F+F-雜交高出一千倍，這種菌株稱為高頻重組菌株(high frequency recombination strain)，簡(jiǎn)稱Hfr。 高頻重組菌株是通過一種非常少見的單交換

38、將F因子整合到細(xì)菌染色體上產(chǎn)生的，當(dāng)F因子整合后，它自己就不能再自行復(fù)制，而只能隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制.它雖然整合在宿主染色體上，但它仍然起作用，即Hfr細(xì)胞能夠與F-細(xì)胞交配，并且所發(fā)生的過程與F+是相似的（:已整合的F因子的兩條鏈中的一條鏈產(chǎn)生一個(gè)缺刻，從這缺刻的地方開始復(fù)制，在復(fù)制的同時(shí)，部分F因子首先轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，隨著時(shí)間的進(jìn)行，供體細(xì)菌的染色體開始也被轉(zhuǎn)移到受體中，如果進(jìn)入受體內(nèi)的那段供體染色體上的基因與受體染色體基因存在差異，就能將重組子分離出來。這種重組是通過供體DNA與受體染色體DNA的一個(gè)雙交換產(chǎn)生的，這過程類似于轉(zhuǎn)化。受體細(xì)胞通過復(fù)制將重組子傳給后代細(xì)胞,而線性DNA片

39、段則被降解。 受體細(xì)胞要成為F+細(xì)胞，它必須接受一個(gè)完整的F因子拷貝,然而在HfrF的雜交中,因?yàn)樵诮雍祥_始的時(shí)候,僅僅一部分F因子被轉(zhuǎn)移，而其余部分位于供體染色體的末端，也就是說，如果受體要獲得完整的F因子，則必須將完整的供體染色體也完整的轉(zhuǎn)移過去，但這種頻率非常低，因?yàn)樵谧詈笠徊糠諪因子轉(zhuǎn)移之前很久,染色體就已經(jīng)斷裂了,所以在Hfr F的交配中，F(xiàn)-細(xì)胞幾乎不可能獲得F+的表型。 由于F+轉(zhuǎn)變成為Hfr的頻率很低,約10-4，因而我們就容易理解為什么在F+ F-雜交中,染色體基因的重組頻率如此之低了，另外在F+轉(zhuǎn)變成為Hfr的同時(shí)，F(xiàn)因子也以很低的頻率又從Hfr上分離出來成為F+細(xì)胞.在分

40、離過程中，F(xiàn)因子形成一個(gè)環(huán)突出于Hfr染色體外，然后通過一個(gè)單交換（象整合一樣），產(chǎn)生一個(gè)環(huán)狀的寄主染色體和一個(gè)環(huán)狀的F因子。有時(shí)F因子從Hfr染色體上分離出來時(shí)并不是很精確的,結(jié)果分離出來的這種F因子帶有一小段宿主染色體，這種含有細(xì)菌基因組的F因子就叫做F因子（Fprime factor）.F因子的大小可以達(dá)到細(xì)菌染色體大小的四分之一.F因子從Hfr染色體上分離出來使這些品系回復(fù)成F+狀態(tài),從而失去高頻供體的能力，即不能將供體的DNA片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，但不精確分離的結(jié)果產(chǎn)生了含有細(xì)菌基因組的F因子。例如在大腸桿菌中F因子插在lac+區(qū)域的旁邊（lac+為一套降解乳糖所必需的基因）,如果分

41、離出來的F因子環(huán)不是很精確,那么與它相鄰的lac+基因也有可能被環(huán)化出去，結(jié)果，通過單交換，從宿主染色體上環(huán)化出去新產(chǎn)生的質(zhì)粒除F因子外還含有l(wèi)ac+基因群，這種新產(chǎn)生的質(zhì)粒就是F'因子.F'因子的命名主要是根據(jù)其中所含的細(xì)菌基因來命名的，如帶有l(wèi)ac+區(qū)域的F因子叫F（ lac+）等。由于F因子含有所有F因子的功能，故帶有F因子的細(xì)胞能夠與F-細(xì)胞接合。根據(jù)正常的接合，一個(gè)F因子的拷貝被轉(zhuǎn)移到F-細(xì)胞，使之成為F+表型,同時(shí)受體菌也接收了在F因子上的細(xì)菌基因,這樣就可能使得lac細(xì)胞的F-菌株成為F+ lac+表型。當(dāng)F'因子轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞后，由于引入了供體細(xì)胞的部分

42、基因,從而構(gòu)成了部分二倍體(partial diploid),即F'lac+ / Flac。在這種部分二倍體細(xì)胞中，受體的完整基因組叫內(nèi)基因子（endogenote)，由供體所提供的部分基因組稱為外基因子(exogenote)。這種利用F'因子將供體細(xì)胞的基因?qū)胧荏w形成部分二倍體的過程叫性導(dǎo)(sexduction）. 這種部分二倍體既可以發(fā)生重組也可以不發(fā)生重組，如果出現(xiàn)重組，即F因子所帶的供體細(xì)菌染色體同受體細(xì)菌染色體之間發(fā)生同源重組,如果發(fā)生單交換，就會(huì)導(dǎo)致F因子整合到受體染色體上而形成Hfr品系，同時(shí)F因子上所攜帶的基因也一起發(fā)生重組；如果發(fā)生雙交換，則只是F因子的細(xì)菌

43、基因和受體染色體上的等位基因之間發(fā)生互換,形成F品系和重組的細(xì)菌染色體。如果這種部分二倍體不發(fā)生重組，那么F'因子自主復(fù)制，在細(xì)菌細(xì)胞中可延續(xù)下去. 性導(dǎo)所形成的部分二倍體可用作不同突變型之間的互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)，以確定這兩個(gè)突變是屬于同一個(gè)基因或者是兩個(gè)不同的基因。例如在精氨酸合成中，包括有12個(gè)不同的基因（argA、argB、argC等），它們的突變都會(huì)產(chǎn)生相同的表型-其生長(zhǎng)依賴精氨酸，其中有4個(gè)基因在大腸桿菌的遺傳學(xué)圖譜中靠得很近，很難通過重組將它們分開。因此當(dāng)發(fā)現(xiàn)2個(gè)精氨酸依賴突變型大腸桿菌時(shí)，我們就無法知道這兩個(gè)突變型到底是由同一基因還是由兩個(gè)不同的基因造成的。我們先假設(shè)這兩個(gè)突變型是

44、由兩個(gè)不同的基因argB和argC的突變?cè)斐傻?，我們首先?zhǔn)備一個(gè)F'因子,這個(gè)F因子中含有對(duì)這兩個(gè)基因中的一個(gè)是互補(bǔ)的，如基因型為argB argC+的F'因子，這里的基因argC+與突變型argC是互補(bǔ)的，將這個(gè)F因子分別與兩個(gè)突變株接合,如果突變發(fā)生在argC基因，則由于argC+基因產(chǎn)物可補(bǔ)充位于染色體上argC的缺限，產(chǎn)生一個(gè)野生型表型，然而如果突變發(fā)生在argB基因，將不會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)，因而菌株的生長(zhǎng)仍需依賴精氨酸（圖1034)。個(gè)人收集整理，勿做商業(yè)用途個(gè)人收集整理，勿做商業(yè)用途因此當(dāng)這種F因子分別導(dǎo)入這兩個(gè)突變株時(shí)，在缺乏精氨酸的情況下，一個(gè)菌株生長(zhǎng),而另一個(gè)菌株不生

45、長(zhǎng)，這時(shí)我們可以說這兩個(gè)突變株是由兩個(gè)不同的基因突變引起的。這種互補(bǔ)可以通過下面的精氨酸代謝途徑圖解來解釋.相反，如果這兩個(gè)突變株是由同一基因突變引起的，則要么兩個(gè)都能生長(zhǎng)(如argC突變),要么兩個(gè)都不能生長(zhǎng)（如argB突變)。 如果我們將含有性因子的細(xì)菌叫雄性菌株,那么我們現(xiàn)在已經(jīng)知道有三種不同類型的雄性菌株,即含F(xiàn)因子的菌株、含F(xiàn)因子的菌株和Hfr菌株?，F(xiàn)將三種致育因子及其關(guān)系概述如下：F因子是一種細(xì)菌染色體外的環(huán)狀DNA分子；F因子可通過簡(jiǎn)單的交換整合到細(xì)菌染色體上，形成Hfr染色體；反過來F因子又可以從Hfr染色體上環(huán)化出來,由于環(huán)化的不準(zhǔn)確性，使得環(huán)化出來的F因子上帶有部分細(xì)菌染色

46、體DNA，這時(shí)稱作F因子。F因子可由供體細(xì)胞進(jìn)入F受體細(xì)胞使其成為F+細(xì)胞，但供體染色體基本不轉(zhuǎn)移；Hfr能以高頻率把細(xì)菌染色體轉(zhuǎn)移到F細(xì)菌中,但在Hfr F的交配中，F(xiàn)-細(xì)胞幾乎不可能獲得F+的表型;F因子能使受體菌形成部分二倍體,便于進(jìn)行重組研究，在F× F-的交配中，F(xiàn)-細(xì)胞成為F+表型。細(xì)菌的接合過程像轉(zhuǎn)化一樣，一個(gè)菌株起著供體的作用，而另一菌株起著受體的作用。在這種情況下,某一細(xì)菌是否是供體決定于是否有F因子整合到染色體上使之成為Hfr菌株。因此要進(jìn)行制作遺傳學(xué)圖的接合雜交實(shí)驗(yàn),首先應(yīng)該通過F+F-雜交，將F因子導(dǎo)入一個(gè)合適的供體菌，然后再從中篩選出一個(gè)Hfr菌株。 F J

47、acob和E Wollman在1961年研究了染色體基因從Hfr菌株轉(zhuǎn)移到F-細(xì)胞的情況，雜交是這樣的： HfrHthr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strs Fthr leu azis tons lac gal strr Hfr H菌株是原養(yǎng)型的，對(duì)鏈霉素敏感；F菌株帶有鏈霉素抗性基因和一系列的突變基因：蘇氨酸和亮氨酸依賴型（thr、leu），對(duì)疊氮化鈉敏感(azis），對(duì)噬菌體T1的感染敏感(tons），不能利用乳糖(lac）或半乳糖(gal）作為碳源。 在實(shí)驗(yàn)開始前，將兩個(gè)菌株混合在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)，幾分鐘后，將培養(yǎng)物稀釋以阻止新的交配，這一過

48、程是為了保證兩細(xì)胞間染色體轉(zhuǎn)移的同步。每隔一定時(shí)間從交配混合物中取樣，把菌液放入攪拌器內(nèi)攪拌以打斷配對(duì)的接合管,使接合的細(xì)胞分開以中斷雜交，將這種中斷接合的細(xì)菌涂布于均含有鏈霉素的幾種不同的培養(yǎng)基（基本篩選培養(yǎng)基）上，觀察形成了什么樣的重組子。例如在不含蘇氨酸的基本篩選培養(yǎng)基上形成了菌落,它的基因型必定是thr+ strr。實(shí)驗(yàn)表明，thr+是最先進(jìn)入F細(xì)胞的，接合8分鐘時(shí)就出現(xiàn)了重組子，接著leu+出現(xiàn)。因此他們就選用thr+，leu+和strr這三個(gè)基因作為選擇標(biāo)記(selected marker）,即在培養(yǎng)基中含有鏈霉素但不含有蘇氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基，其它的基因就是非選擇標(biāo)

49、記（nonselected marker).經(jīng)不同時(shí)間的多次中斷雜交和取樣選擇,得到大量的thr+ leu+ strr重組子菌落，將這些重組子菌落影印培養(yǎng)在若干不同的選擇培養(yǎng)基（如加有azi或加有ton等）上，就可以分析Hfr染色體上其它非選擇性標(biāo)記基因進(jìn)入F-細(xì)菌的順序和所需的時(shí)間，從而繪制出連鎖圖。這種根據(jù)供體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的順序和時(shí)間繪制連鎖圖的技術(shù)，稱為中斷雜交技術(shù)(interrupted mating technigue）。 文檔為個(gè)人收集整理，來源于網(wǎng)絡(luò)本文為互聯(lián)網(wǎng)收集，請(qǐng)勿用作商業(yè)用途11分鐘時(shí)，開始出現(xiàn)對(duì)T1噬菌體有抗性的菌落，混和后18分鐘和25分鐘取樣時(shí)，又陸續(xù)出現(xiàn)乳糖能

50、利用（lac+)和半乳糖能利用（gal+）的菌落(表108)。 表108HfrH的非選擇性標(biāo)記基因進(jìn)入F所需的時(shí)間 分鐘 從HfrH上轉(zhuǎn)移的基因 <9 0 9 azir 11 azir tonr 18 azir tonr lac+ 25 azir tonr lac+ gal+ 從Hfr菌株的基因在F-細(xì)菌中出現(xiàn)開始，隨著時(shí)間的推移，具有這一基因的菌落逐漸增加，直到某一百分?jǐn)?shù)為止，而且某一基因出現(xiàn)的時(shí)間愈早，它所達(dá)到的百分?jǐn)?shù)也愈高，但不可能達(dá)到100%，這是因?yàn)檫@一頻率反映的是這一基因和thr+ leu+同時(shí)重組入受體染色體的頻率,這和它與選擇標(biāo)記的距離有關(guān),相距越近,同時(shí)重組的頻率越高，

51、相距越遠(yuǎn)，同時(shí)重組的頻率就越低。例如非選擇標(biāo)記中疊氮化鈉抗性基因出現(xiàn)最早，在24分鐘時(shí)就達(dá)到大約90的F菌落，這時(shí)這一頻率趨于平衡，不再上升；半乳糖發(fā)酵基因出現(xiàn)最遲,即使在混和后60分鐘時(shí)取樣，也只有30的菌落屬于能利用型。這些事實(shí)說明，從染色體的一端開始，這一端稱為原點(diǎn) （origin)或O(圖1036)，Hfr細(xì)菌的基因按一定的時(shí)間順序依次地出現(xiàn)在F細(xì)胞中，基因離開原點(diǎn)越遠(yuǎn),進(jìn)入F細(xì)胞越遲，離開原點(diǎn)較遠(yuǎn)的基因，可能在轉(zhuǎn)移過程停止以前，仍未轉(zhuǎn)移，因而斜率較低，達(dá)到的最高值也較小。 以上實(shí)驗(yàn)表明，Hfr特定基因進(jìn)入受體的時(shí)間和該基因在染色體上的排列順序成正比關(guān)系。因此利用中斷雜交技術(shù),用雜交后

52、Hfr基因在受體菌中出現(xiàn)的時(shí)間先后作為指標(biāo)，就可以制作出連鎖圖（圖1038）。根據(jù)這些數(shù)據(jù),我們可以得出結(jié)論認(rèn)為Hfr染色體是以直線的方式轉(zhuǎn)移到F-細(xì)胞的。如果讓Hfr F-雜交繼續(xù)進(jìn)行，長(zhǎng)達(dá)2h后，發(fā)現(xiàn)某些F受體轉(zhuǎn)變?yōu)镠fr,換句話說，致育因子最后轉(zhuǎn)移到受體,并使它們成為供體，但效率很低，是線性染色體的最后一個(gè)單位（圖10-38）。 圖1038根據(jù)中斷雜交技術(shù)所作的E。 coli連鎖圖，圖距單位為分鐘這種方法是根據(jù)兩個(gè)基因作為重組子在受體菌中出現(xiàn)，以時(shí)間分鐘作為兩個(gè)基因間圖距單位的。大腸桿菌大片段染色體的遺傳學(xué)圖就是用這種方法,以隨意的起始點(diǎn)用時(shí)間分鐘為單位完成的. 同一個(gè)Hfr菌株的轉(zhuǎn)移起

53、始點(diǎn)以及基因的轉(zhuǎn)移順序在不同的實(shí)驗(yàn)中都是相同的，但是因?yàn)橛捎贔因子能在很多地方整合到細(xì)菌染色體上,并且由于F因子本身就決定了基因轉(zhuǎn)移的方向，因此一個(gè)F+品系可產(chǎn)生許多Hfr品系.因此用這些不同品系的Hfr菌株進(jìn)行中斷雜交實(shí)驗(yàn)，染色體的轉(zhuǎn)移可以是以不同的方向和從不同的地方開始轉(zhuǎn)移的（表10-9)。 表10-9不同Hfr菌株的基因轉(zhuǎn)移順序 菌株 基因轉(zhuǎn)移順序 HfrH 0 thr pro lac pur gal his gly thi Hfr1 0 thr thi gly his gal pur lac pro Hfr2 0 pro thr thi gly his gal pur lac Hfr3

54、 0 pur lac pro thr thi gly his gal 從表109所看到的4種Hfr菌株的基因轉(zhuǎn)移次序好象很亂，很難理解，但如果仔細(xì)比較，基因的排列是存在一定的順序的,我們可以將轉(zhuǎn)移基因的鄰接順序排列成： HfrHthrprolacpurgalhisglythi Hfr1pro lacpurgalhisglythithr Hfr2lacpurgalhisglythithrpro Hfr3 galhisglythithrprolacpur 考慮到基因之間的重疊，從這些數(shù)據(jù)中我們能夠作出的最簡(jiǎn)單圖形是一個(gè)圓形，如圖10-39，這個(gè)圖形是一個(gè)非常有意義的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)檫@跟以前所有真核生物染

55、色體的線狀遺傳學(xué)圖是不同的,大腸桿菌的遺傳圖譜是環(huán)形的.中斷雜交作圖是根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的先后次序，以時(shí)間為單位進(jìn)行基因定位的,較為粗放，在2分鐘以內(nèi)就難以精確測(cè)定。而重組作圖(recombination mapping）則是根據(jù)基因間的重組率進(jìn)行基因定位的，這就克服了在中斷雜交作圖中由于基因轉(zhuǎn)移的先后次序不一而使得各基因發(fā)生重組的機(jī)會(huì)不同的缺陷.這兩種方法可以相互補(bǔ)充，以提高基因定位的精確性，如在基因距離較遠(yuǎn)時(shí)采用中斷雜交作圖是很有效的,但在基因距離較近時(shí),特別是基因間轉(zhuǎn)移時(shí)間在兩分鐘之內(nèi)，那么僅用中斷雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因定位就不那么精確可靠，不過它仍可為重組作圖提供某些基因間的連鎖關(guān)系及其先后次序的

56、依據(jù).細(xì)菌重組作圖的基本原理與真核生物的重組作圖是相同的,即常用三點(diǎn)或二點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。下面我們來看看兩者之間的主要不同之處：通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)及接合的基因轉(zhuǎn)移大部分只能使受體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成部分二倍體，即含有供體染色體片段和完整的受體染色體,因而細(xì)菌的重組通常發(fā)生在部分合子（半合子merozygote）中，而不是發(fā)生在真核生物中的那種真正意義上的合子即二倍體細(xì)胞中；半合子的重組過程是通過一個(gè)雙交換將供體染色體整合到受體基因組中，從而產(chǎn)生一個(gè)完整的重組子染色體，在供體染色體和受體染色體間的單交換不會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完整的染色體,而在二倍體合子中重組的產(chǎn)生可以只通過一個(gè)單交換，且基因間的雙交換倒往往無法觀察到;在細(xì)菌半合子中的這種偶數(shù)次交換得到的重組子只有一種類型，因?yàn)橄喾吹闹亟M子(reciprocal recombinant）是一個(gè)線狀的片段，不能復(fù)制，隨著細(xì)胞