擬南芥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(AtPDI1)活性位點(diǎn)對(duì)抗逆功能的影響

1、擬南芥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 （AtPDI1 ）活性位點(diǎn)對(duì)抗逆功能的影響蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（ protein disulfide isomerase,PDI ）可以催化二硫 鍵異構(gòu)化、氧化及還原 , 也往往具有分子伴侶功能。來(lái)源于不同動(dòng)、植物的 PDI 的活性中心都有 2 對(duì)保守半胱氨酸（ Cys）, 突變后造成催化活性喪失 , 但不影響 PDI 的分子伴侶功能。前期研究表明體外重組表達(dá)的擬南芥 AtPDI1 具有二硫鍵異構(gòu)酶活性 , 且能 提高大腸桿菌細(xì)胞的抗逆能力。為了探究 AtPDI1 在植物體內(nèi)是否有抗逆功能且 是否與其二硫鍵異構(gòu)酶活性有關(guān) , 本研究將編碼 AtPDI1 活性位點(diǎn)的 Cy

2、s 序列進(jìn)行 了突變,并回補(bǔ)擬南芥AtPDII缺失突變體（pdi ）,研究不同株系對(duì)非生物脅迫的 響應(yīng), 主要研究結(jié)果如下 : （1）突變 AtPDI1 活性中心半胱氨酸位點(diǎn)的編碼序列 , 構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥 pdi, 獲得 T3 代純合轉(zhuǎn)基因植株。將編碼 AtPDII 活性位點(diǎn)的 Cys（Cys128/Cys131、Cys467/Cys470）的密碼 子進(jìn)行突變,得到兩個(gè)突變體 AtPDII,即PDI1<sub>C128AC131A</sub和 PDI1_C467AC470AB PDI1<sub>m1</s

3、ub：和 PDI1<sub>m2v/sub表示。 將之前構(gòu)建的野生型 AtPDII 及 PDI1<sub>m1v/sub和 PDI1_m2$化擬 南芥pdi,通過(guò)抗生素篩選、外源基因 PCF鑒定,在T₃代獲得純合的 轉(zhuǎn)基因株系，分別表示為 pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 和 pdi-PDI1 。（2）AtPDI1 活性半胱氨酸位點(diǎn)突變影響了種子萌發(fā)階段對(duì)脅迫的耐受性。對(duì)上述3個(gè)株

4、系及野生型擬南芥（WJ、AtPDI1超表達(dá)株系（WT-PDI1及pdi進(jìn)行不同的處理 , 在非脅迫培養(yǎng)下 , 不同株系的萌發(fā)率及萌發(fā)速度基本一致 , 但脅迫培養(yǎng)下（培養(yǎng)基分別含有 NaC、甘露醇、H<sub>2v/sub>O<sub>2v/sub：和ABA , 各株系的萌發(fā)差異明顯 ,pdi-PDI1_m1 和 pdi-PDI1_m2 的 萌發(fā)率明顯低于pdi-PDI1,pdi-PDI1的萌發(fā)率與WT相似，但低于超表達(dá)株系WT-PDI1;脅迫條件下根長(zhǎng)的差異與萌發(fā)率有相似的趨勢(shì)

5、。（3）AtPDI1 活性半胱氨酸位點(diǎn)突變也影響了幼苗對(duì)脅迫的耐受性。對(duì)苗期 的不同 AtPDI1 株系進(jìn)行脅迫處理 , 結(jié)果表明鹽脅迫、 滲透脅迫、 低溫和高溫處理 后,pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 和 pdi 突變體均表現(xiàn)出較 低的脅迫耐受性,與WT pdi-PDI1和WT-PDI1相比,生長(zhǎng)緩慢,存活率較低;WT-PDI1抗性最強(qiáng),pdi-PDI1與WT較為接近,說(shuō)明野生型PDI1可以回補(bǔ)pdi 功能的缺失,而保守半胱氨酸突變之后則不能回補(bǔ) pdi 功能的缺失,表型與 pdi 相似,

6、 抗逆能力降低。（4）AtPDII抗逆功能與ABA信號(hào)途徑有關(guān)。利用qRT-PCF技術(shù)對(duì)ABA合成 有關(guān)的基因（NCED3 ABA1 ABA2的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下 pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 與 pdi 突變體的上調(diào)倍數(shù)差異 不大，但明顯低于pdi-PDI1、WT和WT-PDI1;鹽脅迫也影響了 ABA1號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 相關(guān)基因（RD29A KIN1、Ann At）的表達(dá),不同株系變化趨勢(shì)的差異與 ABA合成 有關(guān)的基因類(lèi)似。說(shuō)明AtPDI1提高植物的抗逆能力與ABA合成和其信號(hào)途

7、徑有關(guān),且保守Cys 對(duì)AtPDI1功能的發(fā)揮起重要作用。（5）AtPDI1活性位點(diǎn)突變影響了植物體內(nèi) ROS 清除能力。對(duì)鹽和滲透脅迫處理后的ROS積累量進(jìn)行了 NBT染色檢測(cè),pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 與 pdi 的染色程度最深, 說(shuō)明其RO馭累多;pdi-PDI1與WT勺染色次之,但重于WT-PDI1的染色。各株系 活性氧清除相關(guān)基因SOD POD CAT和APX的表達(dá)與ROS勺積累相反，WT-PDI1 表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最多，而 pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1<sub&g