生物化學(xué)蛋白質(zhì)下PPT課件

1、Your site hereCompany Logo構(gòu)型構(gòu)型構(gòu)象構(gòu)象第1頁/共94頁Your site hereCompany Logo構(gòu)型：指一個分子中各原子在空間的相對分布或排列，構(gòu)型的改變涉及到共價鍵的斷裂和重新形成。第2頁/共94頁Your site hereCompany Logo1.肽平面：肽平面：酰胺平面，參與肽鍵的參與肽鍵的6個原子個原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一平面。位于同一平面。 （一）肽平面（一）肽平面第3頁/共94頁Your site hereCompany Logoccccc2.肽鍵鍵長為肽鍵鍵長為0.133nm具有部分雙鍵性質(zhì)，不具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自

2、由旋轉(zhuǎn)。能自由旋轉(zhuǎn)。3.3.酰胺平面中酰胺平面中肽鍵一般是肽鍵一般是反式構(gòu)型。反式構(gòu)型。扭角變，主鏈構(gòu)象變，扭角變，主鏈構(gòu)象變，當扭角為固定值時，主當扭角為固定值時，主鏈為有規(guī)律的構(gòu)象。鏈為有規(guī)律的構(gòu)象。第4頁/共94頁Your site hereCompany Logo多肽鏈可以看成由多肽鏈可以看成由C串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成第5頁/共94頁Your site hereCompany LogoC 1C 2C 1C 2第6頁/共94頁Your site hereCompany Logo（二）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 早在早在1951年，年，Paul

3、ing和和Corey根據(jù)對一些簡單化根據(jù)對一些簡單化合物，如氨基酸、二肽以合物，如氨基酸、二肽以及三肽的及三肽的X-射線晶體圖的射線晶體圖的研究數(shù)據(jù)，提出了兩個周研究數(shù)據(jù)，提出了兩個周期性的多肽結(jié)構(gòu)：期性的多肽結(jié)構(gòu)： -螺旋（螺旋（ -helix）和）和 -折疊（折疊（ -sheet）結(jié)構(gòu)，）結(jié)構(gòu)，它們是許多它們是許多纖維蛋白和球纖維蛋白和球蛋白蛋白的主要的二級結(jié)構(gòu)。的主要的二級結(jié)構(gòu)。第7頁/共94頁Your site hereCompany Logo二級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈上原子的局部空間結(jié)構(gòu)，即多肽鏈中有規(guī)則的重復(fù)構(gòu)象。并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。主要有-螺旋、折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。

4、第8頁/共94頁Your site hereCompany Logoq -螺旋 -螺旋：是多肽鏈主鏈圍繞螺旋中心軸而成的螺旋式構(gòu)象。 -螺旋的特點：大都為右手螺旋，每3.6個AA殘基旋轉(zhuǎn)一周，沿縱軸的間距為0.54nm；螺旋的穩(wěn)定性靠鏈內(nèi)氫鍵維持，每隔3個AA殘基可形成一個氫鍵。在-螺旋中，AA殘基的R側(cè)鏈分布在螺旋的外側(cè)，其形狀、大小及電荷等均影響螺旋的形成和穩(wěn)定性。第9頁/共94頁Your site hereCompany Logo第10頁/共94頁3.6殘基殘基0.54nm第11頁/共94頁Your site hereCompany Logo第12頁/共94頁Your site here

5、Company Logo-角蛋白角蛋白原纖絲初原纖維中間纖維第13頁/共94頁Your site hereCompany Logo燙發(fā)的生化原理燙發(fā)的生化原理第14頁/共94頁Your site hereCompany Logo膠原蛋白膠原蛋白原膠原分子原膠原分子膠原纖維膠原纖維第15頁/共94頁Your site hereCompany Logoq-折疊v-折疊折疊：若干條肽鏈或一條肽鏈的若干肽段平若干條肽鏈或一條肽鏈的若干肽段平行排列，相鄰肽鏈之間靠氫鍵維持。行排列，相鄰肽鏈之間靠氫鍵維持。v-折疊結(jié)構(gòu)的特點折疊結(jié)構(gòu)的特點：（1）-折疊結(jié)構(gòu)中肽鏈處于幾乎完全伸展狀態(tài)完全伸展狀態(tài), 兩個AA

6、殘基之間的距離由R基決定。（2）肽鏈按層排列,靠鏈間氫鍵鏈間氫鍵維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。（3）相鄰肽鏈走向可以是平行的(=-119，=+113)，也可以是反平行的(=-139，=+135)。（4）肽鏈中的AA殘基的R基團分布在片層的上下。第16頁/共94頁Your site hereCompany Logo 折疊第17頁/共94頁Your site hereCompany Logo平行的平行的-折疊折疊反平行的反平行的-折疊折疊第18頁/共94頁Your site hereCompany Logo第19頁/共94頁Your site hereCompany Logo-螺旋螺旋-折疊折疊棒狀棒狀片狀

7、片狀多肽鏈緊緊盤繞多肽鏈緊緊盤繞多肽鏈幾乎完全伸展多肽鏈幾乎完全伸展形成鏈內(nèi)氫鍵形成鏈內(nèi)氫鍵多鏈間氫鍵多鏈間氫鍵如角蛋白如角蛋白如絲心蛋白如絲心蛋白q -螺旋與-折疊比較第20頁/共94頁v-轉(zhuǎn)角：蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的回折，在這種肽鏈轉(zhuǎn)角：蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的回折，在這種肽鏈的回折角上就是的回折角上就是-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。q-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角第21頁/共94頁Your site hereCompany Logo（四）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)整條肽鏈整條肽鏈中全中全部氨基酸殘基的相部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽對空間位置。即肽鏈中鏈中所有原子所有原子的空的空間排布。間排布。1. 定義定義 N端C端第22頁/共9

8、4頁第23頁/共94頁Your site hereCompany Logo2.球狀球狀蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的特點蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的特點同時含有幾種類型二級結(jié)構(gòu)元件具有明顯的折疊層次整個分子緊密結(jié)實，分子表面有一個空穴或裂溝幾乎所有的親水側(cè)鏈都分布在分子的表面上，大部分的疏水性基團都埋在分子內(nèi)部。第24頁/共94頁Your site hereCompany Logo（五）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)（五）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu): :由兩個或兩個以由兩個或兩個以上具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價鍵上具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價鍵彼此締合在一起形成的聚集體。彼此締合在一起形成的聚集體。寡聚蛋寡

9、聚蛋白：白：由兩個或兩個以上多肽鏈通過由兩個或兩個以上多肽鏈通過非共非共價鍵價鍵構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子。構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子。亞基（亞基（subunitsubunit）：）：寡聚蛋白中獨立具寡聚蛋白中獨立具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈。亞基單獨存在無有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈。亞基單獨存在無活性?；钚浴喕g主要作用力是疏水作用，氫鍵、亞基間主要作用力是疏水作用，氫鍵、鹽鍵也參與。鹽鍵也參與。第25頁/共94頁Your site hereCompany Logo第26頁/共94頁Your site hereCompany Logo1.1.血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)第27頁/共94頁Your site hereC

10、ompany Logo成人血紅蛋白組成： HbA： 22 98% ， HbA2： 22 2% 新生兒和3個月以上胎兒：HbF 22早期胚胎： 22接近于球體，4個亞基分別在四面體的四個角上，每個亞基上有一個血紅素輔基。、鏈的三級結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似。第28頁/共94頁Your site hereCompany Logo肌紅蛋白解離平衡常數(shù)：22MbOOMbK 氧飽和度：氧飽和度： 22MbMbOMbOY2.2.血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線Henry定律：溶于液體的任一氣體的濃度與液體上面的該氣體分壓成定律：溶于液體的任一氣體的濃度與液體上面的該氣體分壓成正比。正比

11、。P50：Mb的半飽和氧分壓第29頁/共94頁Your site hereCompany Logov 血紅蛋白和肌紅蛋白都能結(jié)血紅蛋白和肌紅蛋白都能結(jié)合氧，而且氧都是結(jié)合在分合氧，而且氧都是結(jié)合在分子中的血紅素輔基上。子中的血紅素輔基上。v 肌紅蛋白是個單體，可以貯肌紅蛋白是個單體，可以貯存氧，并且可以使氧在肌肉存氧，并且可以使氧在肌肉內(nèi)很容易地擴散；然而血紅內(nèi)很容易地擴散；然而血紅蛋白是個四聚體分子，可以蛋白是個四聚體分子，可以轉(zhuǎn)運氧。轉(zhuǎn)運氧。v MbMb的氧結(jié)合曲線為的氧結(jié)合曲線為雙曲線雙曲線形，形，說明說明MbMb易結(jié)合氧；易結(jié)合氧；HbHb的的氧的的氧合曲線是合曲線是S S型曲線型曲線

12、。說明四。說明四個亞基之間具有正協(xié)同效應(yīng)。個亞基之間具有正協(xié)同效應(yīng)。第30頁/共94頁Your site hereCompany Logo一個配體與蛋白質(zhì)上的一個結(jié)合部位的結(jié)合一個配體與蛋白質(zhì)上的一個結(jié)合部位的結(jié)合影響同一蛋白質(zhì)上其他結(jié)合部位的親和力稱影響同一蛋白質(zhì)上其他結(jié)合部位的親和力稱為為別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)效應(yīng)?？煞譃橥傩?yīng)和異促效應(yīng)兩類。相同配體可分為同促效應(yīng)和異促效應(yīng)兩類。相同配體（同種的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為同促效應(yīng)，（同種的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為同促效應(yīng)，不同配體（不同的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為不同配體（不同的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為異促效應(yīng)異促效應(yīng) 3.變構(gòu)效應(yīng)變構(gòu)效應(yīng)第31頁/

13、共94頁Your site hereCompany Logo第32頁/共94頁Your site hereCompany Logo血紅蛋白上有CO2和BPG結(jié)合部位，因此，血紅蛋白還能運輸CO2 。波耳效應(yīng)：CO2濃度的增加以及相應(yīng)的pH降低使得血紅蛋白氧分數(shù)飽和度曲線向右移動。4.波耳效應(yīng)及其生理意義波耳效應(yīng)及其生理意義在紅細胞內(nèi)：在紅細胞內(nèi)： 碳酸酐酶碳酸酐酶 CO2H2O HHCO3第33頁/共94頁Your site hereCompany Logo四維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力四維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力 氫鍵（二級結(jié)構(gòu)） 疏水基相互作用 疏水作用對維持蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu)起主要作用 范德華力

14、 離子鍵（鹽鍵） 二硫鍵 配位鍵第34頁/共94頁Your site hereCompany Logo第35頁/共94頁Your site hereCompany Logo氫鍵：多發(fā)生于多肽鏈中負電性很強的N原子或O原子的孤對電子與NH或O-H的H原子間的相互吸引力。對維持蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)起主要作用，三、四級結(jié)構(gòu)起一定作用。疏水相互作用：又稱疏水鍵，指疏水基團或側(cè)鏈為避開水分子而相互靠近聚集形成的力，對維持蛋白質(zhì)分子的三、四級結(jié)構(gòu)起主要作用。范德華力：實質(zhì)是靜電引力，產(chǎn)生于極性基團之間和極性基團與非極性基團之間。第36頁/共94頁Your site hereCompany Logo離子鍵：

15、又稱鹽鍵，是正負電荷之間的一種靜離子鍵：又稱鹽鍵，是正負電荷之間的一種靜電相互作用力，主要在側(cè)鏈上發(fā)揮作用。電相互作用力，主要在側(cè)鏈上發(fā)揮作用。二硫鍵：形成于半胱氨酸殘基之間，在穩(wěn)定蛋二硫鍵：形成于半胱氨酸殘基之間，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用。白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用。配位鍵：指在兩個原子之間由其中一個原子單配位鍵：指在兩個原子之間由其中一個原子單獨提供電子對而形成的一種特殊的共價鍵。獨提供電子對而形成的一種特殊的共價鍵。第37頁/共94頁第四節(jié)第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第38頁/共94頁Your site hereCompany Logo1. 蛋白質(zhì)的激活一、蛋

16、白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系無活性的蛋白質(zhì)前體經(jīng)特定的方式斷裂后才轉(zhuǎn)變無活性的蛋白質(zhì)前體經(jīng)特定的方式斷裂后才轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)，這一過程叫為有活性的蛋白質(zhì)，這一過程叫蛋白質(zhì)的激活蛋白質(zhì)的激活（activation）。）。蛋白質(zhì)的激活是蛋白質(zhì)活性的一種調(diào)節(jié)方式。蛋白質(zhì)的激活是蛋白質(zhì)活性的一種調(diào)節(jié)方式。第39頁/共94頁Your site hereCompany Logo第40頁/共94頁Your site hereCompany Logo鐮刀形血紅蛋白（鐮刀形血紅蛋白（sickle-cell hemoglobin, Hb S）2 2、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與分子病蛋白質(zhì)

17、的一級結(jié)構(gòu)與分子病 -鏈鏈N端氨基酸排列順序端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患患 者）者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys第41頁/共94頁Your site hereCompany Logo二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的功能通常取決于它的特定構(gòu)象第42頁/共94頁Your site hereCompany Logo一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的可解離基團：末端-COO-、-NH3+，

18、酸性氨基酸側(cè)鏈-COO- ，Lys的-NH3+，Arg的胍基，His的咪唑基。蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點(pI) 在某一在某一pH值時，蛋白質(zhì)分子中所帶的正值時，蛋白質(zhì)分子中所帶的正電荷數(shù)與負電荷數(shù)相等，凈電荷為零，在電電荷數(shù)與負電荷數(shù)相等，凈電荷為零，在電場中不移動，此時溶液的場中不移動，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等稱為蛋白質(zhì)的等電點。電點。第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離鑒定1.蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)的兩性電離 第43頁/共94頁Your site hereCompany Logo NH3+ NH3+ NH2P P P COOH COO- COO- 正離子正離子 兼性離子兼性離子 負離子負離子

19、 pHpI pH=pI pHpI 各種蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，解離情況不同，等電點不同。+OH-+OH-+H+H+第44頁/共94頁Your site hereCompany Logo在下面所指的pH條件下，下述蛋白質(zhì)在電場中向正極還是向負極移動，還是不動？(a)卵清蛋白，在pH5.0；(pI4.6)(b)乳球蛋白，在pH5.0和7.0；(pI5.2)(c)胰凝乳蛋白酶原，在 pH5.0、9.1和11。(pI9.1) (a)正極 (b)負極，正極 (c)負極，不動，正極第45頁/共94頁Your site hereCompany Logo蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某

20、些物理和化學(xué)因素作用下，其特在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的定的空間構(gòu)象被破壞空間構(gòu)象被破壞，即有序的空間結(jié)，即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理理化性質(zhì)改變化性質(zhì)改變和和生物活性喪失的現(xiàn)象生物活性喪失的現(xiàn)象。2.蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性第46頁/共94頁Your site hereCompany Logo造成變性的因素造成變性的因素 物理因素：紫外線照射、超聲波、物理因素：紫外線照射、超聲波、高溫、高壓。高溫、高壓。 化學(xué)因素：強酸、強堿、重金屬鹽、乙醇等有機化學(xué)因素：強酸、強堿、重金屬鹽、乙醇等有機 溶劑及變性劑等溶劑及變性劑等。

21、 變性的本質(zhì)變性的本質(zhì) 破壞非共價鍵和二硫鍵，不破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。第47頁/共94頁Your site hereCompany Logo蛋白質(zhì)變性，表現(xiàn)為：蛋白質(zhì)變性，表現(xiàn)為：1.1.物理性質(zhì)改變疏水基團外露，溶解度降低，粘物理性質(zhì)改變疏水基團外露，溶解度降低，粘度增加，擴散系數(shù)降低，常伴隨蛋白質(zhì)的沉淀。度增加，擴散系數(shù)降低，常伴隨蛋白質(zhì)的沉淀。2.2.生物活性喪失變性的主要標志。生物活性喪失變性的主要標志。3.3.生化性質(zhì)改變分子結(jié)構(gòu)松散，易被蛋白質(zhì)水解生化性質(zhì)改變分子結(jié)構(gòu)松散，易被蛋白質(zhì)水解酶水解。酶水解。 應(yīng)用：應(yīng)用：臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素

22、常被應(yīng)用來消臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。毒及滅菌。第48頁/共94頁Your site hereCompany Logo蛋白質(zhì)的復(fù)性：變性的蛋白質(zhì)當去除變性因素后，蛋白質(zhì)可重新恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation) 。蛋白質(zhì)的復(fù)性與導(dǎo)致變性的因素、蛋白質(zhì)的種類以及分子結(jié)構(gòu)改變的程度有關(guān)。第49頁/共94頁Your site hereCompany Logo一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二二硫硫鍵鍵第50頁/共94頁Your site hereC

23、ompany Logo 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 -巰基乙醇 去除尿素、-巰基乙醇肽鏈伸展，失去活性第51頁/共94頁Your site hereCompany Logo3.3.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) v 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素水化膜水化膜顆粒表面電荷顆粒表面電荷1.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：蛋白質(zhì)分子：生物大分子，分子量蛋白質(zhì)分子：生物大分子，分子量 1100萬，分子的直徑可達萬，分子的直徑可達1100nm，膠體范圍。膠體范圍。第52頁/共94頁Your site hereCompany Logo+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負

24、電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉溶液中蛋白質(zhì)的聚沉第53頁/共94頁Your site hereCompany Logo蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀：由于受到某些因素的影：由于受到某些因素的影響，蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象。響，蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象。沉淀和變性的區(qū)別：沉淀時空間結(jié)構(gòu)不一定被破壞，蛋白質(zhì)仍有生物活性，若恢復(fù)原來的條件，蛋白質(zhì)可重新溶解。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，沉淀不一定變

25、性。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，沉淀不一定變性。4.蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀第54頁/共94頁Your site hereCompany Logo（1 1）鹽析）鹽析 不導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性不導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的鹽溶：在鹽濃度很低時，向蛋白質(zhì)溶液中加入少量的中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度增加的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的鹽析：當加入大量的中性鹽后，蛋白質(zhì)的溶解度下降，沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析。 硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀 使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性的影響因素第55頁/共94頁Your site hereCompany Logo（2）有機溶劑 乙醇、丙酮非極性有機溶劑可降低介質(zhì)的介電常數(shù)，破壞蛋白

26、質(zhì)水化膜，使其沉淀。（3）重金屬鹽類 pHpI時帶負電荷，與重金屬離子（Hg2+，Pb2+， Cu2+等）結(jié)成不溶性沉淀。（4）生物堿試劑和酸類 單寧酸、三氯乙酸、硝酸、硝基水楊酸 pH pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負離子生成不溶性沉淀。第56頁/共94頁Your site hereCompany Logo（5）加熱變性（6）等電點沉淀法5.蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)、酚試劑反應(yīng)、米倫反應(yīng)等6.蛋白質(zhì)的含量測定考馬斯亮藍染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等考馬斯亮藍染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等第57頁/共94頁 電泳電泳 前處前處理理粗粗分分離離細細分分離離生物細胞

27、或組織生物細胞或組織 無細胞提取液無細胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速離心解、差速離心選擇性沉淀法選擇性沉淀法親和親和層析層析離子交離子交換層析換層析精制后的蛋白質(zhì)精制后的蛋白質(zhì)凝膠凝膠過濾過濾疏水疏水層析層析吸附吸附層析層析鹽析、等電點沉淀、鹽析、等電點沉淀、有機溶劑有機溶劑二、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)溶解度不同分離第58頁/共94頁Your site hereCompany Logo1.透析和超過濾透析和超過濾初步分離純化常利用不同蛋白質(zhì)在溶液和鹽中溶解度的差別，硫酸銨常用于分級分離。再通過透析將硫酸銨除去。半透性膜第59頁/共94頁超過濾是利用壓力或離心力，使水

28、和其它小分子溶質(zhì)通過半透膜，蛋白質(zhì)被截留在膜上。第60頁/共94頁Your site hereCompany Logo2.層析（色譜）層析（色譜）1. 1.層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原分離蛋白質(zhì)的原理理待分離樣品（流動相）流過固定相時，待分離樣品（流動相）流過固定相時，樣品中的各個成分與固定相進行不同程度樣品中的各個成分與固定相進行不同程度的相互作用，并以不同速度流經(jīng)固定相而的相互作用，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。達到分離蛋白質(zhì)的目的。第61頁/共94頁Your site hereCompany Logo2 2、蛋白質(zhì)分離常用的層析方法、蛋白質(zhì)分離常

29、用的層析方法v離子交換層析：利用各種蛋白質(zhì)的電離子交換層析：利用各種蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。荷量及性質(zhì)不同進行分離。v凝膠過濾凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層又稱分子篩層析或排阻層析，利用析或排阻層析，利用各各蛋白質(zhì)相對分子蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進行分離。質(zhì)量大小進行分離。第62頁/共94頁第63頁/共94頁Your site hereCompany Logo將含有天冬氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、蘇氨酸(pI=6.53)、亮氨酸(pI=5.98)和賴氨酸(pI=9.74)的pH3.0檸檬酸緩沖液，加到預(yù)先同樣緩沖液平衡過的強陽離子交換樹脂中，

30、隨后用該緩沖液洗脫此柱，并分別收集洗出液，這5種氨基酸將按什么次序洗脫下來？Asp, Thr, Gly, Leu, Lys第64頁/共94頁Your site hereCompany Logo交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺瓊脂糖瓊脂糖第65頁/共94頁Your site hereCompany Logo第66頁/共94頁Your site hereCompany Logo1.將稱為配體的分子共價結(jié)合在層析柱的固體材料上，當含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配體發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。2.被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當?shù)呐潴w洗

31、脫液洗脫。親和層析親和層析第67頁/共94頁Your site hereCompany Logo第68頁/共94頁Your site hereCompany Logo3.3.電泳電泳帶電的蛋白質(zhì)在電場中能向與其所帶電的蛋白質(zhì)在電場中能向與其所帶電荷相反的方向移動。通過蛋白質(zhì)在帶電荷相反的方向移動。通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù)術(shù), , 稱為稱為電泳電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支持物的不同，可分為薄膜電根據(jù)支持物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。泳、凝膠電泳等。 第69頁/共94頁Your site hereCompany L

32、ogo第70頁/共94頁Your site hereCompany Logo幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。重要技術(shù)。第71頁/共94頁Your site hereCompany Logo電泳遷移率與多肽鏈的分子量的關(guān)系：前沿染料遷移距離樣品遷移距離r=lgMr= a - brSDS-聚丙烯

33、酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳第72頁/共94頁Your site hereCompany LogoSDS ： amino acids1：2十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDS ）HS-CH2CH2OH巰基乙醇巰基乙醇SDS和巰基乙醇和巰基乙醇第73頁/共94頁Your site hereCompany Logo十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基磺酸基 極性親水極性親水烷基烷基 親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）第74頁/共94頁Your site hereCompany Logo第75頁/共94頁Your site hereCompany Logo等電聚焦電

34、泳等電聚焦電泳第76頁/共94頁Your site hereCompany Logo雙向電泳雙向電泳第77頁/共94頁Your site hereCompany Logo第78頁/共94頁Your site hereCompany Logo蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定1953年年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟。1.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目

35、。2.多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基亞基).第79頁/共94頁Your site hereCompany Logo 3.二硫鍵的斷裂 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。二硫蘇糖醇

36、 過甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵第80頁/共94頁Your site hereCompany Logo4.測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比。第81頁/共94頁Your site hereCompany Logo5.分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-末端和末端和C-末端。末端。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。 N-端氨基酸：端氨基酸： Sanger法。法。2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐端逐 個的向里水解。個的向里水解。 最常用

37、的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端末端 的肽鍵速度最大。的肽鍵速度最大。第82頁/共94頁Your site hereCompany LogoC-端氨基酸： 羧肽酶法：肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。 肼解法：多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端

38、氨基酸第83頁/共94頁Your site hereCompany Logo6.多肽鏈斷裂成多個小片段。 可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離、純化。 （1）酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，葡萄球菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶第84頁/共94頁Your site hereCompany LogoTrypsin：R1為賴氨酸Lys和精氨酸Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點水解位點胰蛋白酶胰蛋白酶第85頁/共94頁Your site hereCompany Logo 或胰凝乳蛋

39、白酶（Chymotrypsin）R1為苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr側(cè)鏈。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點水解位點糜蛋白酶糜蛋白酶第86頁/共94頁Your site hereCompany Logo Pepsin：R2為苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr和亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸側(cè)鏈水解速度較快。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點水解位點胃蛋白酶胃蛋白酶第87頁/共94頁Your site hereCompany Logo（2）化學(xué)法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，

40、它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內(nèi)酯第88頁/共94頁Your site hereCompany Logo7.測定測定各各肽段的氨基酸順序。肽段的氨基酸順序。Edman （苯異硫氰酸酯法）苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實氨基酸順序分析法實際上也是一種際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷端分析法。此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈重復(fù)循環(huán)，

41、將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。解離。第89頁/共94頁Your site hereCompany Logo利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。一種從流感病毒中提取的對其入侵細胞有重要作用的蛋白質(zhì)的肽鏈，一種從流感病毒中提取的對其入侵細胞有重要作用的蛋白質(zhì)的肽鏈，可以用可以用CNBr(溴化氰）和溴化氰）和Pepsin（胃蛋白酶）（胃蛋白酶） 降解成小的片斷。降解成小的片斷。CNBr 降解而成的片斷為降解而成的片斷為:Arg-Thr，Phe-

42、Ser-Met， Arg-Thr-Phe-Arg-Thr-Met.Pepsin （胃蛋白酶）降解而成的片斷為：（胃蛋白酶）降解而成的片斷為：Arg-Thr，Phe-Ser-Met-Arg-Thr，Phe-Arg-Thr-Met.求正確的氨基酸殘基排列順序。求正確的氨基酸殘基排列順序。8.確定肽段在多肽鏈中的次序。確定肽段在多肽鏈中的次序。Arg-Thr-Phe-Arg-Thr-Met-Phe-Ser-Met-Arg-Thr第90頁/共94頁Your site hereCompany Logo9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用