彩圖骨髓干細(xì)胞體外組織工程軟骨形成實(shí)驗(yàn)探究

1、彩圖骨髓干細(xì)胞體外組織工程軟骨形成實(shí)驗(yàn)探究作者：宋世鋒，肖海濤，武偉，袁素，謝瑤云，吳多 能，白殿卿【摘要】目的探討骨髓干細(xì)胞(bmscs)在體外不同載體 中軟骨形成的能力和可行性。方法分離培養(yǎng)豬bmscs,將 第3代bmscs以載體內(nèi)多點(diǎn)注射和表面點(diǎn)滴法植于a組：ii 型纖維膠原蛋白海綿(fibrin collagen sponge), b組：生 物蛋白海綿(fibrin collagen sponge and bfgf) ；c 組：明 膠海綿(gelatin sponge) 3種載體上，于4周取材進(jìn)行組織 學(xué)分析。結(jié)果纖維膠原蛋白海綿和生物蛋白海綿組均有軟 骨細(xì)胞形成，明膠海綿無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)。

2、利用spss 10.0軟件統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理，顯示b組軟骨細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量(92. 75±10. 57)多于 a組(36. 45±&34),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p&lt；0. 01),兩組都明 顯多于c組(0),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p&lt；0. 01)o 結(jié)論mscs經(jīng) 分離擴(kuò)增后種植于三維立體結(jié)構(gòu)的纖維蛋白海綿載體上，在 含有tgf b 1培養(yǎng)液中形成軟骨；在tgf b 1和fgf的雙 重因子培養(yǎng)中，其軟骨的形成能力明顯增加。【關(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)細(xì)胞；載體；軟骨形成；組織工程abstract : objectiveto investigate the chondroge

3、nic ability and feasibility of bone mesenchymal stem cells (bmscs) in three kinds of cellular carriermethodbmscs were separated and cultured into the third generation,which were cultivated in three knids of carriers by multi point injection into and dropping on the surface of carriers(fibrin collage

4、n sponge, group a； fibrin collagen sponge and fgf,group b and gelatin sponge, group c )all samples were analyzed after four weeksresuitthere were a few chondrogenic cells in group a,much more chondrogenic cells in group b,and no cells in group c according to analysis with spss 10. 0 software,there w

5、ere more cartilage cells (92. 75+ 10. 57) in group b than in group a(36.45±8.34). it was statistical different (p&lt；0.01). conclusionbmsc can be formed to chondrogenesis after augmented and cultivated in the three dimensional fibrin collagen sponge with the medium of contained transforming

6、 grow th factor b 1 its ability of chondrogenesis is increased evidently in cultured by diplex growth factors (tgf and fgf).key words： bone mesenchymal stem cells； cellular carrier； chondrogenesis； tissue engineering骨髓干系胞（bone marrow stromal cells, bmscs）也 稱(chēng)骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells, bms

7、cs）, bmscs的提取分離及傳代培養(yǎng)技術(shù)已逐漸成熟。如 何將bmscs種植于載體上進(jìn)行體外人工培養(yǎng)形成軟骨樣組織 還是在探討中的問(wèn)題。本研究旨在探討bmscs能否在體外幾 種載體中提供軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境，促進(jìn)bmscs向軟骨分化并形 成組織工程軟骨。1材料與方法1. 1細(xì)胞培養(yǎng)bmscs培養(yǎng)：抽取8周齡幼豬骼骨骨髓5 ml,用密度 梯度離心法分離出有核細(xì)胞，再以pbs緩沖液（gibco公司， 美國(guó)）和無(wú)血清dmem（gibco公司，美國(guó)）各離心洗滌1次。 制備含有0.05 u/ml青霉素、0. 05 u g/ml鏈霉素（gibco公 司，美國(guó)）、tgf 3 1 （sigma公司，美國(guó)）的濃度為

8、5 ng/ml. 10%胎牛血清（hyclone公司，美國(guó)）的dmem培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)有 核細(xì)胞，以6x105個(gè)/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿（gibco公司， 美國(guó)），置于37°c. 5%c02、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，貼壁法 分離bmscs接種3 d后首次換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%90% 融合后，用0.25%胰蛋白酶+0. 02%edta消化，以1. 5x104 個(gè)/cni2的密度接種，常規(guī)傳代擴(kuò)增，第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2載體制作、細(xì)胞種植及分析方法將無(wú)菌膠原蛋白海綿（fibrin collagen sponge , sigma公司，美國(guó)）、生物蛋白海綿（fibrin collagen

9、 sponge +bfgf,遼寧綠谷制藥）、明膠海綿（gelatin sponge南京金 陵制藥）在無(wú)菌條件下裁剪成5 mmx5 mmx5 mm方塊狀。a 組：膠原蛋白海綿;b組：生物蛋白海綿;c組：明膠海綿。 三組分別取16個(gè)標(biāo)本，將第3代細(xì)胞按5x107個(gè)/cm2的密 度分別以載體內(nèi)多點(diǎn)注射和表面點(diǎn)滴法接種到材料上，每塊 材料接種細(xì)胞懸液300卩1。在371、5%c02、100%飽和濕 度下加含tgf p 1 （5 ng/ml,）的dmem培養(yǎng)液，每隔2d換 液1次，觀察細(xì)胞增殖、細(xì)胞在支架材料上的黏附及細(xì)胞外 基質(zhì)的分泌情況。培養(yǎng)4周取材進(jìn)行組織學(xué)分析。利用細(xì)胞 直接技術(shù)法測(cè)定不同載體細(xì)

10、胞生長(zhǎng)情況，即取免疫組化染色 的組織切片，選取三種不同載體構(gòu)建的組織染色切片4張, 每張切片隨機(jī)選取20個(gè)高倍視野進(jìn)行直接陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù), 然后組間比較mean±s. d. （n=4）應(yīng)用spss 10.0軟件進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)學(xué)分。2. 1細(xì)胞生長(zhǎng)情況原代細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，培養(yǎng)57 d后可見(jiàn)均勻的 集落形成紡纟垂形或長(zhǎng)梭形，類(lèi)似成纖維細(xì)胞，但體積較小， 核仁12個(gè)，類(lèi)似于既往文獻(xiàn)報(bào)道的bmscs形態(tài)。傳代后 細(xì)胞體積有所增大，有角狀突起，增殖迅速，細(xì)胞接近融合 后呈“旋渦”樣生長(zhǎng)。接種到材料上后，細(xì)胞與膠原蛋白纖 維緊密黏附，分泌細(xì)胞外基質(zhì)包埋纖維，基質(zhì)逐漸增多填滿(mǎn) 纖維間的空隙（圖1、2）

11、o2.2大體觀察b組標(biāo)本體外培養(yǎng)2周后體積收縮，直徑約為3 mm, 至4周直徑為2 mm；而其他各組均維持直徑在34 mm的范 圍內(nèi)。培養(yǎng)4周后，a、b組表面均光滑，細(xì)膩有光澤，形狀 近似圓球形;c組表面粗糟，呈碎片狀;b組標(biāo)本呈灰白色， 同時(shí)有很好的硬度和彈性，而a組標(biāo)本呈灰黃顏色，色較暗, 彈性和硬度不及b組。2. 3組織學(xué)、電鏡觀察2. 3. 1光鏡檢查 標(biāo)本制備 標(biāo)本經(jīng)10%的福爾馬林固 定，石蠟包埋切片，he染色，光鏡觀察，并采用免疫組化 sp法進(jìn)行標(biāo)記，所用ii型膠原試劑盒來(lái)自北京中杉金橋生物 技術(shù)有限公司。光鏡結(jié)果：a組標(biāo)本顯示：淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì)中見(jiàn)有 稀疏的軟骨細(xì)胞組；可見(jiàn)軟骨

12、陷窩樣結(jié)構(gòu)，陷窩周?chē)梢?jiàn)藍(lán) 染的細(xì)胞外基質(zhì)成分;b組：淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì)中見(jiàn)有軟骨細(xì) 胞，多為單個(gè)散在，局灶幾個(gè)細(xì)胞簇聚，細(xì)胞數(shù)量明顯多于 a組，而且組織緊密，基質(zhì)藍(lán)染程度偏高。a組的組織學(xué)與b 組類(lèi)似，其陷窩和細(xì)胞間的基質(zhì)沉積較b組少。c組：見(jiàn)散 片狀較細(xì)的膠原基質(zhì)，未見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)。利用spss 10.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，顯示b組軟骨細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量(92. 75±10. 57)多 于a組(36. 45±& 34),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p&lt；0.01)o兩組都 明顯多于c組(0),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p&lt；0.01)(圖36)。2. 3.2電鏡檢查 透射電鏡樣品

13、制備：取培養(yǎng)組織1 mmx 1 mmx 1 mm大小，經(jīng)2. 5%戊二醛前固定，1%餓酸后固 定，丙酮系列脫水，環(huán)氧樹(shù)脂epon 812包埋，leiac超薄切 片機(jī)半薄切片定位后，再行超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙 重染色，jem-1010型透射電鏡觀察，攝片。圖1、2第1代細(xì)胞呈集落形成紡纏形或長(zhǎng)梭形，類(lèi) 似成纖維細(xì)胞;2代后細(xì)胞體積有所增大，有角狀突起，增殖 迅速，細(xì)胞接近融合后呈“旋渦”樣生長(zhǎng)圖3、4 (a組)低 倍鏡顯示淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì)中見(jiàn)稀疏散在的軟骨細(xì)胞，高倍 鏡見(jiàn)圓形透亮的軟骨細(xì)胞(hex 100) (hex400)圖5、6 (b 組)顯示淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì)中見(jiàn)成簇的的軟骨細(xì)胞，軟骨

14、基 質(zhì)豐富(hex 100)；高倍鏡顯示細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核深染(hex400)電鏡結(jié)果：b組：軟骨基質(zhì)中見(jiàn)大量的膠原纖維，排列不規(guī)則。軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞單個(gè)、4個(gè)、4個(gè)或多個(gè)存在，呈不規(guī)則形，表面有許多微小突起。細(xì)胞周邊部可見(jiàn) 基質(zhì)顆粒。細(xì)胞質(zhì)較豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體明顯擴(kuò)張，線粒體多見(jiàn)，少量脂滴。細(xì)胞核呈形或橢圓形(圖7)。a組：軟骨基質(zhì)同一組，無(wú)明顯改變，軟骨 細(xì)胞多呈單個(gè)存在，少數(shù)為兩個(gè)，細(xì)胞極不規(guī)則，突起增大， 突起表面有較大空白裂隙，細(xì)胞器沒(méi)有b組發(fā)達(dá)，粗面內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)、高爾基復(fù)合體沒(méi)有明顯擴(kuò)張，細(xì)胞核異染色質(zhì)增多（圖 8）o2. 3.3免疫組化 標(biāo)本經(jīng)10%的福爾

15、馬林固定，石蠟包 埋切片,he染色，光鏡觀察，并采用免疫組化sp法進(jìn)行標(biāo)記, 所用ii型膠原試劑盒來(lái)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 a組：（圖9）淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì)中見(jiàn)有軟骨細(xì)胞，多為單個(gè) 散在，局灶幾個(gè)細(xì)胞簇聚（hex400）,軟骨細(xì)胞較模糊，可 見(jiàn)單個(gè)肥大，胞膜不清，軟骨基質(zhì)ii型膠原（+）;b組：（圖 10）淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì)中見(jiàn)稀疏的軟骨細(xì)胞（hex400）,軟 骨細(xì)胞清晰，軟骨基質(zhì)ii型膠原（+）。圖7 （a組-5000倍）軟骨基質(zhì)中見(jiàn)較多的膠原纖維， 軟骨細(xì)胞多呈單個(gè)存在，少數(shù)為兩個(gè)，細(xì)胞極不規(guī)則，突起 增大，突起表面有較大空白裂隙，細(xì)胞器沒(méi)有e組發(fā)達(dá)，粗 面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體沒(méi)有

16、明顯擴(kuò)張，細(xì)胞核異染色質(zhì)增 多圖8 （b組-5000倍）軟骨基質(zhì)中見(jiàn)大量較細(xì)的膠原纖維， 有64 nm周期橫紋，直徑在1750 nm之間，排列不規(guī)則。 軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞12個(gè)，呈不規(guī)則形，表面有許多微 小突起。細(xì)胞周邊部可見(jiàn)基質(zhì)顆粒。細(xì)胞質(zhì)較豐富，胞質(zhì)內(nèi) 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體明顯擴(kuò)張，線粒體多見(jiàn)。細(xì)胞核 呈圓形或橢圓形（圖12）。圖9 （a組）淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì) 中見(jiàn)稀疏的軟骨細(xì)胞（hex400）,軟骨細(xì)胞較模糊，軟骨基 質(zhì)ii型膠原(+)。圖10 (b組)淡紫藍(lán)色軟骨基質(zhì)中見(jiàn)有 多個(gè)軟骨細(xì)胞，多為單個(gè)散在，局灶幾個(gè)細(xì)胞簇聚 (hex400),軟骨細(xì)胞較清晰，可見(jiàn)單個(gè)肥大，胞膜不清， 軟骨

17、基質(zhì)ii型膠原(+)3討論3.1骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)與分化骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)又稱(chēng) 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells, mscs)屬于成體干細(xì) 胞。因培養(yǎng)液、機(jī)械因素、生長(zhǎng)因子等的不同，mscs可分化 為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。 bmscs定向分化為軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)因子是bmscs定向分化軟 骨細(xì)胞的必要條件1。作者在分化mscs時(shí)，一部分采取抽 骨髓去除血細(xì)胞后加入細(xì)胞液培養(yǎng)，通過(guò)換液法去除其他細(xì) 胞，再以貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞而收取mscs。此法雖然古老，但操 作簡(jiǎn)便，可以用較多的骨髓血獲得足夠的ms

18、cs。為了獲取 mscs的高純度，本組應(yīng)用了密度梯度離心法分離出有核細(xì) 胞，經(jīng)貼壁培養(yǎng)獲得mscso應(yīng)用已成熟和公認(rèn)的成軟骨培養(yǎng) 液，即dmem液，在tgf-b 1誘導(dǎo)下，培養(yǎng)兩周分離轉(zhuǎn)換至3 代，傳代培養(yǎng)見(jiàn)細(xì)胞有角狀突起，增殖迅速，細(xì)胞接近融合 后呈“旋渦”樣生長(zhǎng)，此時(shí)的細(xì)胞形態(tài)更接近于軟骨細(xì)胞形 態(tài)。本組的實(shí)驗(yàn)證明，3代轉(zhuǎn)換培養(yǎng)bmscs移植于細(xì)胞載體, 具有良好的分化軟骨細(xì)胞能力。3.2軟骨形成與細(xì)胞誘導(dǎo)劑的組合作用tgf-b 1作為誘導(dǎo)劑，它是一種生物活性極為廣泛且 具有相對(duì)特異性的誘導(dǎo)因子。其可以促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成，能 夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和合成ii型膠原及蛋白多糖，還能使蛋 白多糖硫酸

19、化程度更高，更加符合軟骨的生理特點(diǎn)；也能夠 誘導(dǎo)多種間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，維持b軟 骨細(xì)胞的表型穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)各組從細(xì)胞分離培養(yǎng)到載體移植 均在tgf-b 1誘導(dǎo)因子下進(jìn)行。a、b組結(jié)果顯示有軟骨細(xì)胞 形成oworster將不同濃度的tgf b 1 (010 ng/ml)與mscs 作單層培養(yǎng)后，細(xì)胞的層數(shù)和密度都增加，i、ii型膠原的 mrna含量在tgf-b1濃度為5 ng/ml時(shí)含量最高，說(shuō)明 tgf-b 1能促進(jìn)mscs成軟骨分化，并有量效關(guān)系，最適濃度 為5 ng/ml 2。本實(shí)驗(yàn)的tgf- b 1濃度為5 ng/ml與以上相 同。tsutsumi等的研究顯示，培養(yǎng)液中加入

20、fgf培養(yǎng)很多 代，mscs仍保持多分化的潛能。在10%fbs的單層培養(yǎng)中， fgf大大增加了兔和人mscs的生長(zhǎng)率和生存時(shí)間。在體外擴(kuò) 增mscs時(shí)，加入fgf(pgf+mscs)與未加fgf組相比較，擴(kuò)增 后在成軟骨培養(yǎng)液中行微球培養(yǎng)，其結(jié)果顯示：fgf+組在微 球的表面出現(xiàn)球形軟骨細(xì)胞，并被軟骨特征性的蛋白多糖圍 繞。說(shuō)明了 mscs在體外擴(kuò)增時(shí)加入fgf,維持了 mscs的成 軟骨分化能力3 o mastrogiacomo等在分析各種生長(zhǎng)因子促 mscs成軟骨分化的研究顯示，fgf是促進(jìn)mscs增殖最有效 的生長(zhǎng)因子4,可增加干細(xì)胞的軟骨分化增殖和軟骨基質(zhì) 的形成，在維持軟骨形態(tài)和防止

21、軟骨細(xì)胞衰老退變方面起著 重要的作用，實(shí)驗(yàn)證明了 fgf單獨(dú)或與其他生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng) 用均可提高人mscs的成軟骨能力57。本實(shí)驗(yàn)生物蛋白 海綿b組，其膠原蛋白吸附有b-fgf成分，并在細(xì)胞培養(yǎng)液 中具有tgf-b 1因子的雙重作用下，其形成軟骨的能力比a 組明顯提高，組織切片中軟骨細(xì)胞顯示較多。電鏡顯示：軟 骨陷窩內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)軟骨細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)較豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)粗 面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體明顯擴(kuò)張，線粒體多見(jiàn)，結(jié)果說(shuō)明: fgf可激發(fā)mscs的成軟骨分化能力。fgf與tgf-b 1組合應(yīng) 用對(duì)mscs的成軟骨分化能力明顯增強(qiáng)。3.3纖維膠原蛋白海綿的細(xì)胞載體作用細(xì)胞在三維立體結(jié)構(gòu)的載體中，才具有組織

22、形成的能 力。纖維蛋白凝膠作為細(xì)胞載體的組織工程形成，已有較到 多的文獻(xiàn)報(bào)道，并證明了其是一種良好的細(xì)胞載體8,9 o 盡管將蛋白凝膠用注射法包埋或匯合細(xì)胞培養(yǎng)，但其凝膠性 易降解，不及細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，而將蛋白膠調(diào)和至理想的濃 度，才能促成細(xì)胞的生長(zhǎng)和組織形成，但有一定的技術(shù)難度10。在細(xì)胞培養(yǎng)中，凝膠的阻隔作用，能否使細(xì)胞液很好 的滲透和足夠的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，有待于質(zhì)疑，而且，纖維凝膠的 支架力學(xué)作用不強(qiáng)，故不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存11 o mukai da等12用ii型膠原海綿培養(yǎng)兔肋軟骨細(xì)胞可以很好 地維持軟骨細(xì)胞的表型，得出原代軟骨細(xì)胞在膠原海綿上培 養(yǎng)時(shí)更適合臨床和實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)

23、應(yīng)用纖維膠 原蛋白海綿作為細(xì)胞載體，可提供細(xì)胞培養(yǎng)的三維立體結(jié) 構(gòu)，相當(dāng)于細(xì)胞的臨時(shí)基質(zhì)，有利于軟骨細(xì)胞向軟骨的有形 方向發(fā)展。纖維膠原蛋白海綿，具有良好的孔隙和吸附性， 便于細(xì)胞附著和細(xì)胞基質(zhì)的黏附，是良好的細(xì)胞載體。本實(shí) 驗(yàn)將mscs細(xì)胞懸液多點(diǎn)注入纖維膠原蛋白海綿載體中，使 細(xì)胞分散均勻，加上海綿的多孔性和吸附性，細(xì)胞的附著和 營(yíng)養(yǎng)液均勻滲透，利于細(xì)胞良好的生長(zhǎng)和基質(zhì)的合成。明膠 海綿孔隙較大，不利于細(xì)胞黏附，其降解速度較快，為了克 服其不足，有作者將明膠海綿透明質(zhì)酸結(jié)合，增加了支架的 機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞的黏附性，體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)良好并分 泌了大量的ii型膠原基質(zhì)13。本實(shí)驗(yàn)證明：明膠海

24、綿的吸 附力雖較強(qiáng)，但易崩解，在培養(yǎng)1周后出現(xiàn)散片狀，對(duì)細(xì)胞 的生長(zhǎng)不利。本實(shí)驗(yàn)證明：纖維蛋白膠原海綿作為mscs載體在 tgf-3 1和bfgf的雙重作用下，其成軟骨的能力明顯增加。 tgf-b1在軟骨細(xì)胞中的主要作用是合成代謝，刺激蛋白多 糖和dna合成，也有對(duì)軟骨細(xì)胞分化的雙向調(diào)節(jié)作用，而fgf 對(duì)軟骨細(xì)胞分化有協(xié)同作用，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖14 olazarus等人測(cè)量小鼠脛骨近端軟骨肪板的不同區(qū)域的fgf 各型的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)fgf在不同的區(qū)域各型的表達(dá)不同，fgf 可作用于靶器官，調(diào)節(jié)mrnas而影響軟骨板的發(fā)育；在胚胎 早期，fgfrs 2 and 4表達(dá)較多，表示軟骨化的成分較高1

25、5。 本實(shí)驗(yàn)利用tgf-b 1和fgf的雙重作用于軟骨形成，將mscs 種植于膠原蛋白海綿并在以上雙重因子的培養(yǎng)形成了軟骨。 鑒于膠原蛋白海綿已大量的應(yīng)用于臨床，可直接作為mscs 載體用于臨床軟骨損傷的修復(fù)。4結(jié)論mscs在體外可分離后在tgf-b 1培養(yǎng)液中可擴(kuò)增，種 植于三維立體結(jié)構(gòu)的纖維膠原蛋白海綿載體上，在含有 tgf2b 1培養(yǎng)液中形成軟骨。mscs種植于纖維膠原蛋白海綿 載體后，在tgf-b1和fgf的雙重培養(yǎng)中，其軟骨的形成能 力明顯增加。如將體外形成軟骨植入體內(nèi)可修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨， 可使mscs在軟骨組織的修復(fù)中具有臨床應(yīng)用價(jià)值?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 mello ma, tuan rs

26、. effects of tgf betal and triiodothyronine on artilage maturation : in vitro analysis using long term high density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cellsj. j orthop res,2006,11： 2095-2105.2 worster aa, nixon aj, toland bd, et al. effect of transforibing growth factor b 1 on ch

27、ondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cellj. ajvr, 2000, 9： 1003-1010._3 tsutsumi s,shimazu a,miyazaki k,et al. retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to fgfj. biochem and biophys res commun,2001,2：413-419._4

28、 mastrogiacomo m,cancedda r,quarto r, et al. effect of different growth factors on the chondrogenic potential of human bone marrow stromal cellsj osteoarthritis cartilage,2001,9： 36-40.5 davidson d, blanc a, filion d, et al. fibroblast growth factor (fgf) 18 signals through fgf receptor 3 to promote

29、 chondrogenesis jj biol chem,2005,21：509-515.6 lazams je,hegde a,andrade ac. fibroblast growth factor expression in the postnatal growth platej. bone,2007,3： 577-860.7 veilleux n,spector m. effects of fgf-2 and igft on aduit canine articular chondrocytes in type ii collagen glycosaminoglycan scaffolds in vitroj. osteoarthritis cartilage,2005,4： 278-286.8 蔣挺大，主編膠原與膠原蛋白m.北京：化學(xué) 工業(yè)出版社，2006, 1-250.9 武 漢，張春秋，尹飛，等纖維蛋白膠和異種 無(wú)機(jī)骨構(gòu)建復(fù)合支架材料與種子細(xì)胞的復(fù)合j.中國(guó)組織 工程研究與臨床康復(fù)，2007,1： 52-54.10 catelas i,sese n,helgerson s,et al. effects of fibrin gel formulation on mesenchymal stem cell proliferati