環(huán)境生物監(jiān)測與安全性評價PPT課件

1、二、環(huán)境監(jiān)測的目的和分類二、環(huán)境監(jiān)測的目的和分類（一）環(huán)境監(jiān)測的目的（一）環(huán)境監(jiān)測的目的 環(huán)境監(jiān)測的目的是準確、及時、全面地環(huán)境監(jiān)測的目的是準確、及時、全面地反映環(huán)境質量現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢，為環(huán)境管理、反映環(huán)境質量現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢，為環(huán)境管理、污染源控制、環(huán)境規(guī)劃等提供科學依據(jù)。污染源控制、環(huán)境規(guī)劃等提供科學依據(jù)。第第1頁頁/共共84頁頁（二）環(huán)境監(jiān)測的分類（二）環(huán)境監(jiān)測的分類 1. 1.按監(jiān)測目的分類按監(jiān)測目的分類（1 1）監(jiān)視性監(jiān)測（又稱為例行監(jiān)測或常規(guī)監(jiān)測）監(jiān)視性監(jiān)測（又稱為例行監(jiān)測或常規(guī)監(jiān)測） 對指定的有關項目進行定期的、長時間的監(jiān)對指定的有關項目進行定期的、長時間的監(jiān)測，以確定環(huán)境質量及污

2、染源狀況、評價控制措測，以確定環(huán)境質量及污染源狀況、評價控制措施的效果，衡量環(huán)境標準實施情況和環(huán)境保護工施的效果，衡量環(huán)境標準實施情況和環(huán)境保護工作的進展。作的進展。包括對污染源的監(jiān)督監(jiān)測和環(huán)境質量監(jiān)測。包括對污染源的監(jiān)督監(jiān)測和環(huán)境質量監(jiān)測。第第2頁頁/共共84頁頁（2 2）特定目的監(jiān)測（又稱為特例監(jiān)測）特定目的監(jiān)測（又稱為特例監(jiān)測和應急監(jiān)測）和應急監(jiān)測）根據(jù)特定的目的可分為以下四種：根據(jù)特定的目的可分為以下四種： A A 污染事故監(jiān)測污染事故監(jiān)測 B B 仲裁監(jiān)測仲裁監(jiān)測 C C 考核驗證監(jiān)測考核驗證監(jiān)測 D D 咨詢服務監(jiān)測咨詢服務監(jiān)測第第3頁頁/共共84頁頁（3 3）研究性監(jiān)測（又稱科研

3、監(jiān)測）研究性監(jiān)測（又稱科研監(jiān)測） 研究性監(jiān)測是針對特定目的科學研究而進研究性監(jiān)測是針對特定目的科學研究而進行的高層次的監(jiān)測。例如環(huán)境本底底監(jiān)測及研究；行的高層次的監(jiān)測。例如環(huán)境本底底監(jiān)測及研究；有毒有害物質對從業(yè)人員底影響研究；為監(jiān)測工有毒有害物質對從業(yè)人員底影響研究；為監(jiān)測工作本身服務的科研工作的監(jiān)測，如統(tǒng)一方法、標作本身服務的科研工作的監(jiān)測，如統(tǒng)一方法、標準分析方法的研究、標準物質的研制等。這類研準分析方法的研究、標準物質的研制等。這類研究往往要求多學科合作進行。究往往要求多學科合作進行。第第4頁頁/共共84頁頁2.2.按監(jiān)測介質對象分類按監(jiān)測介質對象分類 可分為水質監(jiān)測、空氣監(jiān)測、土壤監(jiān)

4、測、可分為水質監(jiān)測、空氣監(jiān)測、土壤監(jiān)測、固體廢物監(jiān)測、生物監(jiān)測、噪聲和振動監(jiān)測、固體廢物監(jiān)測、生物監(jiān)測、噪聲和振動監(jiān)測、電磁輻射監(jiān)測、放射性監(jiān)測、熱監(jiān)測、光監(jiān)電磁輻射監(jiān)測、放射性監(jiān)測、熱監(jiān)測、光監(jiān)測、衛(wèi)生（病源體、病毒、寄生蟲等）監(jiān)測測、衛(wèi)生（病源體、病毒、寄生蟲等）監(jiān)測等。等。第第5頁頁/共共84頁頁三、環(huán)境監(jiān)測特點三、環(huán)境監(jiān)測特點（一）環(huán)境監(jiān)測的發(fā)展（一）環(huán)境監(jiān)測的發(fā)展 污染監(jiān)測階段或被動監(jiān)測階段污染監(jiān)測階段或被動監(jiān)測階段 環(huán)境監(jiān)測階段或主動監(jiān)測階段環(huán)境監(jiān)測階段或主動監(jiān)測階段 污染防治監(jiān)測階段或自動監(jiān)測階段污染防治監(jiān)測階段或自動監(jiān)測階段第第6頁頁/共共84頁頁（二）（二） 環(huán)境監(jiān)測的特點環(huán)

5、境監(jiān)測的特點1.1.環(huán)境監(jiān)測的綜合性環(huán)境監(jiān)測的綜合性環(huán)境監(jiān)測的綜合主要表現(xiàn)在監(jiān)測手段、環(huán)境監(jiān)測的綜合主要表現(xiàn)在監(jiān)測手段、監(jiān)測對象的多樣性以及監(jiān)測數(shù)據(jù)處理監(jiān)測對象的多樣性以及監(jiān)測數(shù)據(jù)處理 的復雜性。的復雜性。2.2.環(huán)境監(jiān)測的連續(xù)性環(huán)境監(jiān)測的連續(xù)性3.3.環(huán)境監(jiān)測的追蹤性環(huán)境監(jiān)測的追蹤性第第7頁頁/共共84頁頁四、監(jiān)測技術概述四、監(jiān)測技術概述 監(jiān)測技術包括采樣技術、測試技術和數(shù)據(jù)處理技術，監(jiān)測技術包括采樣技術、測試技術和數(shù)據(jù)處理技術，這里以污染物的測試技術為重點作以概述。這里以污染物的測試技術為重點作以概述。（一）化學、物理技術（一）化學、物理技術 重量法常用作殘渣、降塵、硫酸鹽、油類等的測定；

6、重量法常用作殘渣、降塵、硫酸鹽、油類等的測定； 容量分析被廣泛用于水中酸度、堿度、化學需氧量、容量分析被廣泛用于水中酸度、堿度、化學需氧量、溶解氧、硫化物、氰化物的測定；溶解氧、硫化物、氰化物的測定； 儀器分析方法被廣泛用于對環(huán)境中污染物進行定性儀器分析方法被廣泛用于對環(huán)境中污染物進行定性和定量的測定。和定量的測定。第第8頁頁/共共84頁頁（二）生物技術（二）生物技術 這是利用生物在污染環(huán)境中所產(chǎn)生的各種反映信這是利用生物在污染環(huán)境中所產(chǎn)生的各種反映信息來判斷環(huán)境質量的方法，是一種最直接也是一種綜息來判斷環(huán)境質量的方法，是一種最直接也是一種綜合的方法。合的方法。生物監(jiān)測包括生物體內(nèi)污染物含量的

7、測定；觀察生物生物監(jiān)測包括生物體內(nèi)污染物含量的測定；觀察生物在環(huán)境中受傷害癥狀；生物的生理生化反應；生物群在環(huán)境中受傷害癥狀；生物的生理生化反應；生物群落結構和種類變化等手段來判斷環(huán)境質量。落結構和種類變化等手段來判斷環(huán)境質量。第第9頁頁/共共84頁頁第二節(jié)第二節(jié) 生物傳感器生物傳感器一、概述一、概述 傳統(tǒng)的環(huán)境監(jiān)測方法通常采用離線分析方法，其傳統(tǒng)的環(huán)境監(jiān)測方法通常采用離線分析方法，其缺缺點點是：分析速度慢，操作復雜，且需要昂貴儀器，不適是：分析速度慢，操作復雜，且需要昂貴儀器，不適宜進行現(xiàn)場快速監(jiān)測和連續(xù)在線分析。建立和發(fā)展連續(xù)、宜進行現(xiàn)場快速監(jiān)測和連續(xù)在線分析。建立和發(fā)展連續(xù)、在線、快速的

8、現(xiàn)場監(jiān)測體系尤其重要。在線、快速的現(xiàn)場監(jiān)測體系尤其重要。 生物傳感器實際上是一類特殊的化學傳感器生物傳感器實際上是一類特殊的化學傳感器。國際。國際純粹和應用化學聯(lián)合會對純粹和應用化學聯(lián)合會對化學傳感器化學傳感器的定義為：一種小的定義為：一種小型化的、能專一和可逆地對某種化合物或某種離子具有型化的、能專一和可逆地對某種化合物或某種離子具有應答反應，并能產(chǎn)生一個與此化合物或此離子濃度成比應答反應，并能產(chǎn)生一個與此化合物或此離子濃度成比例地分析信號的傳感器。例地分析信號的傳感器。第第10頁頁/共共84頁頁 生物傳感器是一種將生物感應元件的專一生物傳感器是一種將生物感應元件的專一性與一個能夠產(chǎn)生與待測

9、物濃度成比例的信號性與一個能夠產(chǎn)生與待測物濃度成比例的信號傳導器結合起來的一種分析裝置。傳導器結合起來的一種分析裝置。 最先問世的生物傳感器是酶電極。最先問世的生物傳感器是酶電極。2020世紀世紀7070年代后，人們開始研究微生物電極、細胞器年代后，人們開始研究微生物電極、細胞器電極、動植物組織電極以及免疫電極等新型生電極、動植物組織電極以及免疫電極等新型生物傳感器，使生物傳感器的類型大大增多。物傳感器，使生物傳感器的類型大大增多。第第11頁頁/共共84頁頁二、生物傳感器的基本組成和工作原理二、生物傳感器的基本組成和工作原理生物傳感器由生物傳感器由敏感元件敏感元件，即，即生物元件和信號傳導器生

10、物元件和信號傳導器組成。組成。生物元件：生物元件：是具有分子識別能力的生物活性物質(如組織切片、細胞、細胞器、細胞膜、酶、抗體、核酸、有機物分子等。傳導器：傳導器：主要有電化學電極(如電位、電流的測量)、光學檢測元件、熱敏電阻、場效應晶體管、壓電石英晶體及表面等離子共振器件等，當待測物與分子識別元件特異性結合后,所產(chǎn)生的復合物(或光、熱等)通過信號轉換器變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?、光信號?從而達到分析檢測的目的。第第12頁頁/共共84頁頁生物傳感器的基本原理如下圖所示：生物傳感器的基本原理如下圖所示：第第13頁頁/共共84頁頁 生物傳感器的工作原理主要決定于敏感生物傳感器的工作原理主要決定于敏感元

11、件（分子識別單元）和待測物質之間的相互元件（分子識別單元）和待測物質之間的相互作用，有以下幾種類型：作用，有以下幾種類型：（1 1）將化學信號轉化為電信號）將化學信號轉化為電信號 已研究的大部分生物傳感器的工作原理均屬于這種已研究的大部分生物傳感器的工作原理均屬于這種類型。類型。（2 2）將熱變化轉化為電信號）將熱變化轉化為電信號（3 3）將光效應轉化為電信號）將光效應轉化為電信號（4 4）直接產(chǎn)生電信號方式）直接產(chǎn)生電信號方式第第14頁頁/共共84頁頁三、生物傳感器的分類三、生物傳感器的分類一般可從以下三個角度進行分類：一般可從以下三個角度進行分類：1.根據(jù)傳感器輸出信號的產(chǎn)生方式根據(jù)傳感器

12、輸出信號的產(chǎn)生方式（1）生物親和型生物傳感器）生物親和型生物傳感器 S + R SR 底物底物 受體受體（2）代謝型或催化型生物傳感器）代謝型或催化型生物傳感器 S + R SR P 底物底物 受體受體 生成物生成物 第第15頁頁/共共84頁頁2.2.根據(jù)生物傳感器中分子識別元件上的敏感物質根據(jù)生物傳感器中分子識別元件上的敏感物質可分為：酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感可分為：酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細胞傳感器、免疫傳感器等。器、細胞傳感器、免疫傳感器等。 3. 3.根據(jù)生物傳感器的信號轉化器根據(jù)生物傳感器的信號轉化器可分為：電化學生物傳感器、半導體生物傳感器、可分為：電化學生物傳

13、感器、半導體生物傳感器、測熱型生物傳感器、測光型生物傳感器、測聲型測熱型生物傳感器、測光型生物傳感器、測聲型生物傳感器等生物傳感器等第第16頁頁/共共84頁頁第第17頁頁/共共84頁頁四、生物傳感器的特點四、生物傳感器的特點1.根據(jù)生物反應的特異性和多樣性,理論上可以制成測定所有生物物質的傳感器,因而測定范圍廣泛測定范圍廣泛。2.測定時一般不需要樣品預處理，也不需加入其他試劑不需要樣品預處理，也不需加入其他試劑。3.由于它的體積小，可以實現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測連續(xù)在線監(jiān)測。4.響應快，樣品用量少樣品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反復多次使用反復多次使用。5.傳感器連同測定儀的成本遠低于大型的分

14、析儀器，因而便于推廣普及便于推廣普及。第第18頁頁/共共84頁頁1.酶傳感器酶傳感器它將活性物質酶覆蓋在電極表面它將活性物質酶覆蓋在電極表面,酶與被測的有機物或無酶與被測的有機物或無機物反應機物反應,形成一種能被電極響應的物質。形成一種能被電極響應的物質。例如例如,脲在尿素酶催化下發(fā)生反應脲在尿素酶催化下發(fā)生反應1967年年Updick和和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結合將固定化的葡萄糖氧化酶膜結合在氧電極上在氧電極上,做成了第一支葡萄糖電極；此后做成了第一支葡萄糖電極；此后,這類酶傳這類酶傳感器通常是通過檢測產(chǎn)物感器通常是通過檢測產(chǎn)物H2O2的濃度變化或氧的消耗的濃度變化或氧的消耗量來

15、檢測底物。量來檢測底物。五、生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測中的應用五、生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測中的應用第第19頁頁/共共84頁頁第第20頁頁/共共84頁頁葡萄糖電極葡萄糖電極缺點缺點: :(1)(1)溶解氧的變化可能引起電極響應的波動溶解氧的變化可能引起電極響應的波動; ;(2)(2)由于氧的溶解度有限由于氧的溶解度有限, ,當溶解氧貧乏時當溶解氧貧乏時, ,響應電流明顯響應電流明顯下降而影響檢測限下降而影響檢測限; ;(3)(3)傳感器響應性能受溶液傳感器響應性能受溶液pHpH值和溫度影響較大值和溫度影響較大第第21頁頁/共共84頁頁第第22頁頁/共共84頁頁2.2.微生物傳感器微生物傳感器 微生物傳感器

16、分為兩類：微生物傳感器分為兩類：一類是利用微生物在同化底物時消耗氧的呼吸作用；一類是利用微生物在同化底物時消耗氧的呼吸作用；另一類是利用不同的微生物含有不同的酶。另一類是利用不同的微生物含有不同的酶。 好氧微生物在繁殖時需消耗大量的氧好氧微生物在繁殖時需消耗大量的氧, ,可以氧濃度的變可以氧濃度的變化來觀察微生物與底物的反應情況。化來觀察微生物與底物的反應情況。 裝置裝置是：由適合的微生物電極與氧電極組成。是：由適合的微生物電極與氧電極組成。 原理原理是：利用微生物的同化作用耗氧是：利用微生物的同化作用耗氧, ,通過測量氧電極通過測量氧電極電流的變化量來測量氧氣的減少量電流的變化量來測量氧氣的

17、減少量, ,從而達到測量底物從而達到測量底物濃度的目的濃度的目的. .第第23頁頁/共共84頁頁 例如例如,熒光假單胞菌熒光假單胞菌,能同化葡萄糖；蕓苔絲孢能同化葡萄糖；蕓苔絲孢酵母可同化乙醇酵母可同化乙醇,因此可分別用來制備葡萄糖和因此可分別用來制備葡萄糖和乙醇傳感器，這兩種細菌在同化底物時乙醇傳感器，這兩種細菌在同化底物時,均消耗均消耗溶液中的氧溶液中的氧,因此可用氧電極來測定因此可用氧電極來測定 基于不同類型的信號轉換器基于不同類型的信號轉換器,常見的微生物傳感常見的微生物傳感器有電化學型、光學型、熱敏電阻型、壓電高器有電化學型、光學型、熱敏電阻型、壓電高頻阻抗型和燃料電池型，頻阻抗型和

18、燃料電池型，第第24頁頁/共共84頁頁第第25頁頁/共共84頁頁3. BOD生物傳感器生物傳感器 利用利用生物傳感器的原理生物傳感器的原理，以微生物的單一菌種或混，以微生物的單一菌種或混合種群作為合種群作為BOD微生物電極，由于水體中微生物電極，由于水體中BOD物質的加物質的加人或降解代謝的發(fā)生，導致水中的微生物內(nèi)外源呼吸方人或降解代謝的發(fā)生，導致水中的微生物內(nèi)外源呼吸方式的變化或轉化，藕聯(lián)著電流強弱信號的改變，一定條式的變化或轉化，藕聯(lián)著電流強弱信號的改變，一定條件下傳感器輸出的電流值與件下傳感器輸出的電流值與BOD的濃度呈線性關系。用的濃度呈線性關系。用于制作于制作BOD生物傳感器的微生物

19、主要有用生物傳感器的微生物主要有用單一菌種如單一菌種如絲絲孢酵母、梭菌、芽孢桿菌及孢酵母、梭菌、芽孢桿菌及混合微生物種群如活性污泥混合微生物種群如活性污泥制成的制成的BOD傳感器，還有用生物發(fā)光菌和嗜熱菌的。傳感器，還有用生物發(fā)光菌和嗜熱菌的。第第26頁頁/共共84頁頁基本組成：基本組成：第第27頁頁/共共84頁頁存在問題：存在問題：由于微生物培養(yǎng)不穩(wěn)定，使傳感器不能保持良好、穩(wěn)定由于微生物培養(yǎng)不穩(wěn)定，使傳感器不能保持良好、穩(wěn)定的運行；的運行；一種微生物不可能對各種廢水中所有的有機物都產(chǎn)生響一種微生物不可能對各種廢水中所有的有機物都產(chǎn)生響應，因此，用單一菌種制備的應，因此，用單一菌種制備的BO

20、D傳感器只適用于部分傳感器只適用于部分類型的廢水；類型的廢水；微生物細胞在測定廢水中有毒物質時由于缺乏抗性，會微生物細胞在測定廢水中有毒物質時由于缺乏抗性，會出現(xiàn)出現(xiàn)“中毒中毒”現(xiàn)象；現(xiàn)象；用常溫微生物組成的用常溫微生物組成的BOD微生物電極的使用壽命不長。微生物電極的使用壽命不長。第第28頁頁/共共84頁頁4. 4. 免疫傳感器免疫傳感器 抗體對相應的抗原具有抗體對相應的抗原具有識別和結合識別和結合的雙重功能的雙重功能,在與在與抗原結合時抗原結合時,選擇性強選擇性強,靈敏度高，免疫傳感器就是利用靈敏度高，免疫傳感器就是利用其雙重功能將抗體或抗原和換能器組合而成的裝置。其雙重功能將抗體或抗原和

21、換能器組合而成的裝置。 由于蛋白質分子由于蛋白質分子(抗體或抗原抗體或抗原)攜帶有大量電荷、發(fā)色基攜帶有大量電荷、發(fā)色基團等團等,當抗原抗體結合時當抗原抗體結合時,會產(chǎn)生電學、化學、光學等變會產(chǎn)生電學、化學、光學等變化化,通過適當?shù)膫鞲衅骺蓹z測這些參數(shù)通過適當?shù)膫鞲衅骺蓹z測這些參數(shù),從而構成不同的從而構成不同的免疫傳感器，總的來說可分為兩類免疫傳感器，總的來說可分為兩類: (1)非標記型非標記型; (2)標記型標記型第第29頁頁/共共84頁頁圖圖10106 6免疫傳感器的原理免疫傳感器的原理如黃曲霉毒素傳感器如黃曲霉毒素傳感器,它它由氧電極和黃曲霉毒素由氧電極和黃曲霉毒素抗體膜組成抗體膜組成,

22、加到待測樣加到待測樣品中品中,酶標記的及未標記酶標記的及未標記的黃曲霉毒素便會與膜的黃曲霉毒素便會與膜上的黃曲霉毒素抗體發(fā)上的黃曲霉毒素抗體發(fā)生競爭反應生競爭反應,測定酶標黃測定酶標黃曲霉毒素與抗體的結合曲霉毒素與抗體的結合率率,便可知樣品中的含量便可知樣品中的含量。根據(jù)使用的信號轉換器,有電化學免疫傳感器、光學免疫傳感器、壓電免疫傳感器等。第第30頁頁/共共84頁頁免疫傳感器在環(huán)境檢測中的應用：免疫傳感器在環(huán)境檢測中的應用： 檢測農(nóng)藥：對于有機農(nóng)藥傳感器檢測不僅比色譜法檢測更方便，而且檢測精度也是分光光度法很難達到的。Li等 制備出五氯酚(PCP)的兩種抗原，獲得PCP-BSA耦聯(lián)物并免疫接

23、種得到相應抗體，設計出一種快速經(jīng)濟的免疫檢測法，能夠在5mln之內(nèi)檢測出土壤樣品中的PCP含量，檢測限為1mgL。還有除草劑草甘磷、谷連松等。 檢測有機物：Gauger等 開發(fā)出一種可攜帶式的現(xiàn)場檢測連續(xù)流動免疫傳感器，預處理簡單，能在5min之內(nèi)測定土壤中的三硝基甲苯和環(huán)三亞甲基三硝胺，精確度可達到10gL。 檢測金屬類物質：主要是重金屬離子cr(VI)，Pb(II)，Cu(II)，Cd(II)，Cr(III)，Hg(II)，Ag(II)，Co(II)，Sn(II)和Ni(II)等。Blake等 將乙二胺四乙酸、二亞乙醛三胺五乙酸(DTPA) 等與重金屬離子Cd(II)，Co(II)，Pb(

24、II)和U(VI)螯合后作半抗原制成單克隆抗體，利用競爭機制，制成免疫傳感器熒光檢測。 檢測微生物：Wong等 開發(fā)出一種基于石英晶體微量天平(QCM)技術的免疫傳感器檢測沙門氏菌。在細胞數(shù)量線性范圍10 510 8ml內(nèi)，該傳感器檢測沙門氏菌沒有明顯干擾，檢測下限為10 4ml。還可檢測金黃色葡萄球菌和其他一些病毒和細菌。第第31頁頁/共共84頁頁存在的問題：存在的問題： 目前存在的問題在于，已得到的有害物質對應的抗體有限，固定后的抗體的穩(wěn)定性也是免疫傳感器發(fā)展的制約因素之一；傳感器在測定后再生困難，需要重新固定分子識別膜等條件都給免疫傳感器技術從實驗室技術轉化為商業(yè)化產(chǎn)品帶來了困難。但是隨

25、著新的微型換能器的應用、具有良好穩(wěn)定性的新抗體的開發(fā)及固定抗體的穩(wěn)定劑的研制，免疫傳感器在檢測環(huán)境中痕量有害物質和堆肥化過程控制中的應用必將有更加廣闊的前景。第第32頁頁/共共84頁頁5. DNA生物傳感器生物傳感器 分子生物學與生物技術的進展為研究以核酸探針為敏感元件的DNA生物傳感器提供了可能。與酶和抗體不同，核酸識別層十分穩(wěn)定，并且易于合成或再生以供重復使用。 DNA生物傳感器是將核酸作為分子識別及檢測層并與各種物理的、化學的換能器相結合而產(chǎn)生的一種可以在物質分子水平上進行快速檢測、監(jiān)控的微量分析技術。DNA生物傳感器在穩(wěn)定性、可重復性、快速性、便捷性、靈敏度等方面所表現(xiàn)出的優(yōu)越性，使得

26、它成為當今生物分析測量領域的熱點。 第第33頁頁/共共84頁頁（1 1）核酸雜交生物傳感器的原理）核酸雜交生物傳感器的原理 DNA生物傳感器生物傳感器依據(jù)依據(jù)DNA分子之間或分子之間或DNA分子與其它物質分子與其它物質的相互作用的相互作用(也稱雜化也稱雜化作用作用)所引起的各種變所引起的各種變化，來記錄、分析發(fā)化，來記錄、分析發(fā)生在傳感器和探測目生在傳感器和探測目標之間的雜化反應，標之間的雜化反應，以完成對目標物的探以完成對目標物的探測和監(jiān)控。測和監(jiān)控。第第34頁頁/共共84頁頁用非螺旋的肽骨架替代用非螺旋的肽骨架替代DNA 分子中的磷酸骨分子中的磷酸骨架合成出架合成出肽核酸肽核酸(PNA)，

27、他們合成的他們合成的PNA 中，中，含有與胸腺嘧啶相連的含有與胸腺嘧啶相連的氨基單位，保留了氨基單位，保留了DNA分子的基本分子的基本雜化特征，同樣可以識雜化特征，同樣可以識別雙株別雙株DNA鏈中的互補鏈中的互補物。物。第第35頁頁/共共84頁頁（2 2）污染物的檢測）污染物的檢測 DNA傳感器除可用于受感染微生物的核酸序列分析； 檢測污染物和其它環(huán)境有害物質：Pandey 等人將雙鏈DNA固化在柱面波導的表面形成DNA 生物傳感器，并結合流式注射系統(tǒng)，以測量熒光信號的強度來檢測可與雙鏈DNA發(fā)生嵌入反應的化合物； 檢測DNA的物理損傷； 可用于研究污染物與DNA之間的相互作用，為解釋污染物毒

28、性作用機理提供了可能。第第36頁頁/共共84頁頁6. 6. 其他生物傳感器其他生物傳感器6.1 6.1 酚類微生物傳感器酚類微生物傳感器 屬于酶傳感器。用酶電極安培傳感器檢測酚類化合物時，電極表面的酶分子被氧和過氧化氫氧化，接著被酚類化合物重新還原，酚類主要轉化為苯醌或酚自由基，這些產(chǎn)物通常具有電化學活性，能在相對于飽和甘汞電極（SCE)0V以下的電位還原，還原電流與溶液中酚類化合物的濃度成正比。第第37頁頁/共共84頁頁6.2 陰離子表面活性劑傳感器陰離子表面活性劑傳感器 包括能降解烷基苯磺酸（LAS)的細菌和一個氧電極。當陰離子表面活性劑存在時，細菌的呼吸作用增加，導致溶解氧變化。6.3

29、水體富營養(yǎng)化監(jiān)測傳感器水體富營養(yǎng)化監(jiān)測傳感器 引起水體富營養(yǎng)化的藍細菌細胞體內(nèi)有藻青素，它顯示的熒光光譜不同于其他的微生物，從而用對熒光敏感的生物傳感器就能監(jiān)測藍細菌的濃度。第第38頁頁/共共84頁頁6.4 生物傳感器檢測硝酸鹽、亞硝酸鹽及氨氮生物傳感器檢測硝酸鹽、亞硝酸鹽及氨氮6.5 檢測有毒有害物質的生物傳感器檢測有毒有害物質的生物傳感器6.6 空氣和廢氣監(jiān)測傳感器空氣和廢氣監(jiān)測傳感器（1）CO2傳感器傳感器（2）亞硫酸鹽傳感器）亞硫酸鹽傳感器（3）甲烷傳感器）甲烷傳感器第第39頁頁/共共84頁頁第三節(jié)第三節(jié) PCR技術技術 PCR的概念的概念 PCR反應原理反應原理 PCR反應體系和方法

30、反應體系和方法 PCR反應特點反應特點 PCR類型類型 PCR技術在環(huán)境檢測中的應用技術在環(huán)境檢測中的應用第第40頁頁/共共84頁頁一、一、PCR的概念的概念 PCR概念的提出：概念的提出：1983，Kary Mullis 定義：定義： PCR技術又稱聚合酶鏈式反應（技術又稱聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction)，是通過模擬體內(nèi)，是通過模擬體內(nèi) DNA 復制的方式，復制的方式，在體外選擇性地將在體外選擇性地將 DNA 某個特殊區(qū)域擴增出來的某個特殊區(qū)域擴增出來的技術。技術。第第41頁頁/共共84頁頁引物引物引物引物第第42頁頁/共共84頁頁 Mullis最初使用的

31、最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合聚合酶酶 I 的的Klenow片段。不耐高溫。片段。不耐高溫。 1988年年Saiki 等從溫泉（等從溫泉（ Hot spring）中分離的一株）中分離的一株水生嗜熱桿菌水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNA聚合酶。聚合酶。thermus aquaticus第第43頁頁/共共84頁頁 此酶具有以下特點此酶具有以下特點： 耐高溫，耐高溫， 在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。加新酶。 大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加

32、了擴大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度增長度(2.0Kb)。 酶命名為酶命名為Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此。此酶的發(fā)現(xiàn)使被酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應用。廣泛應用。 在在 1989 年，年，Science 將將PCR中的中的Taq DNA多聚酶命多聚酶命 名為當年的風云分子名為當年的風云分子 (Molecule of the year) 第第44頁頁/共共84頁頁 在微量離心管中在微量離心管中,加入適量的加入適量的緩沖液緩沖液, 微量的微量的模板模板DNA,四種脫氧單核苷酸四種脫氧單核苷酸,耐熱性耐熱性多聚酶多聚酶, 一對合成一對合成DNA

33、的的引物引物,通過通過高溫變性、低溫退火高溫變性、低溫退火和和中溫延伸中溫延伸三個階段為一三個階段為一個循環(huán)的反應過程個循環(huán)的反應過程,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍放大一倍,一般樣品是經(jīng)過一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán)次循環(huán),最終最終使基因放大了使基因放大了數(shù)百萬倍數(shù)百萬倍; 擴增了特異區(qū)段的擴增了特異區(qū)段的DNA帶。帶。 二、二、PCR技術的基本原理技術的基本原理第第45頁頁/共共84頁頁 第第46頁頁/共共84頁頁復溫 第第47頁頁/共共84頁頁第第48頁頁/共共84頁頁三、三、PCR的反應體系和方法的反應體系和方法 PCR管加熱使模板變性管加熱使模板

34、變性, 退火使引物與模板退火使引物與模板DNA互補互補,延伸需將反應溫度升至中溫延伸需將反應溫度升至中溫( 72),在在Tap多聚多聚酶的作用下酶的作用下,以以dNTP為原料為原料,以引物為復制的起點以引物為復制的起點,合合成新鏈。成新鏈。 如此重復改變反應溫度如此重復改變反應溫度,即高溫變性、低溫退火即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán)和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過一般樣品是經(jīng)過30次循次循環(huán)環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴增產(chǎn)物進行電將擴增產(chǎn)物進行電泳泳,

35、經(jīng)溴化乙錠染色經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的特異區(qū)段的DNA帶。帶。第第49頁頁/共共84頁頁 總體積總體積 50-100 l Buffer 緩沖液緩沖液 dNTP 原料原料 Primer 引物引物 DNA分子分子 模板模板 Taq酶酶 DNA聚合酶聚合酶1 1 反應體系反應體系第第50頁頁/共共84頁頁第第51頁頁/共共84頁頁第第52頁頁/共共84頁頁第第53頁頁/共共84頁頁1 1）PCRPCR反應成分反應成分（1 1）模板）模板 單、雙鏈單、雙鏈DNADNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合

36、酶抑制劑、聚合酶抑制劑、DNADNA結合蛋白類。結合蛋白類。 一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 L L。 模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。3 PCR3 PCR反應條件反應條件（2 2）引物濃度）引物濃度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 濃度過高易導致模板與引物錯配濃度過高易導致模板與引物錯配, ,反應特異性下降。反應特異性下降。（3 3）TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反應特異性下降酶量增加使反應特異性下降; ;酶量

37、過少影響反應產(chǎn)量。酶量過少影響反應產(chǎn)量。第第54頁頁/共共84頁頁（4 4）dNTPdNTP dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度；濃度取決于擴增片段的長度； 四種四種dNTPdNTP濃度應相等；濃度應相等； 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入, ,濃度過低則降低反濃度過低則降低反 應產(chǎn)量；應產(chǎn)量； dNTPdNTP可與可與MgMg2+2+結合結合, ,使游離的使游離的MgMg2+2+濃度下降濃度下降, ,影響影響DNADNA 聚合酶的活性。聚合酶的活性。 （5 5） Mg2+Mg2+ Mg Mg2+2+是是DNADNA聚合酶的激活劑。聚合酶的激活劑。 0.5mmo

38、l/L-2.5mmol/L0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。反應體系。 MgMg2+2+濃度過低會使?jié)舛冗^低會使TaqTaq酶活性喪失、酶活性喪失、PCRPCR產(chǎn)量下降；產(chǎn)量下降； MgMg2+2+過高影響反應特異性。過高影響反應特異性。 MgMg2+2+可與負離子結合可與負離子結合, ,所以反應體系中所以反應體系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等等的濃度影響反應中游離的的濃度影響反應中游離的MgMg2+2+濃度。濃度。第第55頁頁/共共84頁頁2）循環(huán)參數(shù)）循環(huán)參數(shù)(1) 變性變性 使雙鏈使雙鏈DNA解鏈為單鏈，解鏈為單鏈， 94oC 20-30秒秒(2) 退火退火 溫度由

39、引物長度和溫度由引物長度和GC含量決定。含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫降低溫度可增加反應的靈敏性。度可增加反應的靈敏性。（3）延伸）延伸 70-75,一般為一般為72，延伸時間由擴增片段長度決定，延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版主要取決于模版DNA的濃度，的濃度， 一般為一般為25-35次，次數(shù)次，次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加第第56頁頁/共共84頁頁經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）30次第第57頁頁/共共84頁頁四、四、PCR反應的特點反應的特點1 1 ）

40、高度的靈敏性）高度的靈敏性第第58頁頁/共共84頁頁2 ）特異性第第59頁頁/共共84頁頁引物設計：引物設計：3端為關鍵堿基；第第60頁頁/共共84頁頁3 3）操作簡便易行）操作簡便易行 PCR擴增法擴增法,只需要數(shù)小時只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出就可以用電泳法檢出1g基因組基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。 通常的通常的DNA 擴增法是分子克隆法擴增法是分子克隆法, 首先要構建含有目首先要構建含有目的的基因的載體的的基因的載體, 然后將它導入細胞后進行擴增然后將它導入細胞后進行擴增,還要用還要用同位索探針進行篩選同位索探針進行篩選;這種方法這種方法,要經(jīng)過要

41、經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、內(nèi)切、連接、轉化和培養(yǎng)等相關的過程轉化和培養(yǎng)等相關的過程,操作復雜操作復雜,一般需要數(shù)周時間。一般需要數(shù)周時間。第第61頁頁/共共84頁頁目的基因目的基因載體載體復制子復制子宿主細胞宿主細胞擴增擴增擴增擴增第第62頁頁/共共84頁頁1）不對稱）不對稱PCR 目的：目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.01 0.5M,關鍵關鍵是限制性引物的絕對量。是限制性引物的絕對量。 用途：用途：制備核酸序

42、列測定的模板制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針制備雜交探針 五、五、PCR的類型的類型第第63頁頁/共共84頁頁 第第64頁頁/共共84頁頁2)反向反向PCR (reverse PCR) 未知序列未知序列第第65頁頁/共共84頁頁第第66頁頁/共共84頁頁123412343 3）多重）多重PCRPCR（復合（復合PCRPCR） 設計多對引物，在同一個設計多對引物，在同一個PCRPCR反應體系中，同時擴增一份反應體系中，同時擴增一份DNADNA樣本中幾個樣本中幾個不同靶區(qū)域的不同靶區(qū)域的DNADNA片斷，這一過程稱之為多重片斷，這一過程稱之為多重PCRPCR。用于檢測特定基因序列的用于檢測特定

43、基因序列的存在或缺失。存在或缺失。第第67頁頁/共共84頁頁4）標記）標記PCR （ LP-PCR Labelled primers ) 利用同位素、熒光素等對引物進行標記利用同位素、熒光素等對引物進行標記,用以直觀用以直觀地檢測目的基因。地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標本的基因診斷特別適合大量臨床標本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分可同時檢測多種基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4第第68頁頁/共共84頁頁第第69頁頁/共共84頁頁5 5）原位）原位 原位聚合酶鏈式反應（原位聚合酶鏈式反應（In Still PCR,IsIn Still PCR,Is

44、PCRPCR）是由是由HaaseHaase等于等于19901990年首創(chuàng)。它是利用年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為完整的細胞作為一個微小的反應體系一個微小的反應體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段來擴增細胞內(nèi)的目的片段, ,在不破在不破壞細胞的前提下壞細胞的前提下, ,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位。進行擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。第第70頁頁/共共84頁頁

45、6）逆轉錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCR擴增第第71頁頁/共共84頁頁六、六、PCR技術在環(huán)境檢測中的應用技術在環(huán)境檢測中的應用應用應用PCR技術研究特定環(huán)境中微生物區(qū)系的組成、技術研究特定環(huán)境中微生物區(qū)系的組成、結構，分析種群動態(tài)。結構，分析種群動態(tài)。應用應用PCR技術監(jiān)測環(huán)境中的特定微生物，如致病菌技術監(jiān)測環(huán)境中的特定微生物，如致病菌和工程菌。和工程菌。 從環(huán)境樣品中提取微生物遺傳物質DNA或RNA； 以從環(huán)境微生物中提取的DNA或RNA核酸作為模板，進行PCR擴增反應； PCR反應產(chǎn)物的檢測與分析 第第72頁頁/共共84頁頁第四節(jié)第四節(jié) DNA分子標記技術分子標記技術一、

46、分子標記的概念一、分子標記的概念 分子標記分子標記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測的是指可遺傳的并可檢測的DNA序列。序列。 能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組片段，它直接反映基因組DNA間的差異。間的差異。第第73頁頁/共共84頁頁二、分子標記的種類二、分子標記的種類分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類。類。 第一類是以第一類是以分子雜交為核心的分子標記技術分子雜交為核心的分子標記技術，包括：限，包括：限制性片段長度多態(tài)性標記

47、（制性片段長度多態(tài)性標記（RFLP標記）；標記）； DNA指紋技指紋技術；原位雜交等；術；原位雜交等；第二類是第二類是以以PCR技術為核心的分子標記技術技術為核心的分子標記技術，包括：隨，包括：隨機擴增多態(tài)性機擴增多態(tài)性DNA標記（標記（RAPD標記）；簡單序列重復標記）；簡單序列重復標記（標記（SSR標記）；擴增片段長度多態(tài)性標記（標記）；擴增片段長度多態(tài)性標記（AFLP標標記）等；記）等；第三類是第三類是一些新型的分子標記一些新型的分子標記，如：單核苷酸多態(tài)性（，如：單核苷酸多態(tài)性（SNP標記）；表達序列標簽（標記）；表達序列標簽（EST標記）等。標記）等。第第74頁頁/共共84頁頁三、分

48、子標記技術在環(huán)境監(jiān)測中的應用三、分子標記技術在環(huán)境監(jiān)測中的應用1. 分析環(huán)境污染物的遺傳毒性效應，為污染物分析環(huán)境污染物的遺傳毒性效應，為污染物早期診斷和評價提供依據(jù)；早期診斷和評價提供依據(jù)；2. 環(huán)境致病微生物的檢測。環(huán)境致病微生物的檢測。 利用利用RTPCR技術檢測禽流感病毒，技術檢測禽流感病毒，SARS病毒等。病毒等。第第75頁頁/共共84頁頁第五節(jié)第五節(jié) 分子生物學在環(huán)境微生物研分子生物學在環(huán)境微生物研究中的應用究中的應用 重組細菌用于環(huán)境污染防治重組細菌用于環(huán)境污染防治 分子生物學技術在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應用分子生物學技術在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應用 分子生物技術在環(huán)境基因工程菌的穩(wěn)定性

49、和分子生物技術在環(huán)境基因工程菌的穩(wěn)定性和安全性研究中的應用安全性研究中的應用第第76頁頁/共共84頁頁5.1 重組細菌用于環(huán)境污染防治重組細菌用于環(huán)境污染防治 微生物降解微生物降解 胞內(nèi)酶在細胞表面表達更好發(fā)揮生物降解功能胞內(nèi)酶在細胞表面表達更好發(fā)揮生物降解功能第第77頁頁/共共84頁頁5.2 分子生物學技術在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應用分子生物學技術在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應用 環(huán)境中存在的大量微生物中環(huán)境中存在的大量微生物中, 僅有僅有1% 可通過傳統(tǒng)的可通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法在培養(yǎng)皿上進行培養(yǎng)和進一步分離培養(yǎng)方法在培養(yǎng)皿上進行培養(yǎng)和進一步分離, 而絕大而絕大多數(shù)細菌要求非常嚴格的營養(yǎng)條件或是難以培養(yǎng)。

50、多數(shù)細菌要求非常嚴格的營養(yǎng)條件或是難以培養(yǎng)。PCR 技術技術及衍生出的一系列生物技術及衍生出的一系列生物技術,使得在復雜環(huán)使得在復雜環(huán)境中對那些混合物內(nèi)低含量的群體成員或生物群中某境中對那些混合物內(nèi)低含量的群體成員或生物群中某個特異基因的檢測與研究成為可能。個特異基因的檢測與研究成為可能。第第78頁頁/共共84頁頁5.3 分子生物技術在環(huán)境基因工程菌的穩(wěn)定性分子生物技術在環(huán)境基因工程菌的穩(wěn)定性和安全性研究中的應用和安全性研究中的應用 對轉基因生物的環(huán)境安全問題需進行長期的系統(tǒng)的研對轉基因生物的環(huán)境安全問題需進行長期的系統(tǒng)的研究究, 因風險的出現(xiàn)有長期滯后性。在關于被引入遺傳因風險的出現(xiàn)有長期滯后性。在關于被引入遺傳物質的穩(wěn)定性和新的遺傳物質是否轉移到其他微生物物質的穩(wěn)定性和新的遺傳物質是否轉移到其他微生物中中, 通過生物的表型可初步判斷通過生物的表型可初步判斷, 進一步的證實則可以進一步的證實則可以利用利用DNA 序列分析序列分析, 探針雜交等。探針雜交等。第第79頁頁/共共84頁頁一、生物安全的概念