杜仲總多糖對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的影響

1、杜仲總多糖對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的影響 作者：辛?xí)悦?王浩,馮蕾,朱玉云,高允生【摘要】 目的 研究杜仲總多糖對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的影響。方法 應(yīng)用環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,給予不同劑量杜仲總多糖后,測定小鼠體重、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)等指標(biāo)。結(jié)果 300 g杜仲原藥材經(jīng)提取分離得9.3 g多糖干品。應(yīng)用環(huán)磷酰胺后,小鼠體重、胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)均降低。杜仲總多糖能減輕環(huán)磷酰胺致小鼠體重的下降,升高免疫低下小鼠胸腺指數(shù),明顯增加小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)(P<0.01)。與空白組比較,杜仲總多糖還能提高正常小鼠的脾指數(shù)(P

2、<0.05)。結(jié)論 杜仲總多糖能夠較好地增強小鼠免疫功能。 【關(guān)鍵詞】 杜仲總多糖；環(huán)磷酰胺；免疫調(diào)節(jié)；小鼠Abstract：Objective To study the immunoregulatory activity of eucommia ulmoides oliv polysaccharides (EOP) on immunodepressive mice. Method The immunodepressive mice model was established with cyclophosphamide (CY) treated. EOP was given wi

3、th different doses, and mouse weight, thymus index, spleen index, abdominal cavity macrophage engulfing rates, engulfing index were measured. Result 300 grams Eucommia ulmoides Oliv crude drugs after withdraw separate gained 9.3 grams polysaccharides. After CY injection, the mouse weight, chest glan

4、d index, abdominal cavity macrophage swallowing rate, phagocytic count reduced. EOP could resist the mouse body weight drop induced by CY, elevate the thymus index of immunity low mouse, obviously increase mouse abdominal cavity macrophage engulfing rates and engulfing index (P<0.01). And com

5、pared with the blank group, Eop could promote the spleen weight of immunity low mouse (P<0.05). Conclusion EOP could enhance immunofunction of immunodepressive mice.Key words：eucommia ulmoides oliv polysaccharides；cyclophasphamide；immunoregulotory activity；mice杜仲總多糖(Eucommia ulmoides Oliv Pol

6、ysaccharides,EOP)是從杜仲的干燥樹皮中提取出的水溶性成分,是近年來發(fā)現(xiàn)的杜仲又一活性成分。本實驗觀察杜仲總多糖對傳統(tǒng)化療藥物環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的影響,并初步探討其作用機制,為杜仲的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。1 實驗材料1.1 動物 昆明種清潔級8周齡小白鼠60只,體重(21±4)g,雌雄各半,泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,合格證號：魯動質(zhì)字20103；標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),實驗前飼養(yǎng)5 d。1.2 藥物與試劑 杜仲中藥飲片,由本院中藥學(xué)教研室高紅莉老師鑒定為正品；環(huán)磷酰胺粉針劑,上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn),批號041109(用時以生理鹽水配成2 mg/mL溶液)；香菇多糖凍

7、干粉,福建梅峰制藥廠生產(chǎn),批號041223(用時以生理鹽水配成0.5 mg/mL溶液)。雞血紅細胞混懸液,用時取新鮮雞血5 mL,離心去上清液,用生理鹽水洗滌2次,再以生理鹽水配成1%混懸液。1.3 儀器 中草藥粉碎機,FW/T型,天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠；SHB-1395A型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SPectrumLab54紫外可見分光光度計,上海棱光技術(shù)有限公司；電子分析天平,AR2140,奧豪斯(上海)公司；OlymPus cx21型顯微鏡,廣州市科迅實驗器材有限公司。2 實驗方法2.1 杜仲總多糖的提取、分離1 取杜仲皮

8、300 g,粉碎,用4倍體積的95%乙醇回流4 h,冷卻過濾,濾渣晾干即為提取多糖的預(yù)處理材料。在預(yù)處理材料中加入8倍體積的蒸餾水于80 水浴中提取2 h,過濾,濾渣繼續(xù)用8倍體積的蒸餾水于80 水浴中提取2 h,如此重復(fù)2次,合并3次濾液,濾液于70 濃縮至原體積的1/10,得粗提液。取粗提液加入1/5倍體積的氯仿和1/25倍體積的正丁醇,振蕩10 min,在4 000 r/min下離心10 min,分離,水相再如此重復(fù)3次,得最終水相溶液。水相溶液用4倍體積的95%乙醇醇沉,靜置過夜,依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀,烘干稱重,即得提取物結(jié)晶品。 采用硫酸-苯酚法鑒定2-3,即取提取粗品

9、4.2 mg,加溫?zé)崴涑?00 mL,即相當(dāng)42 g/mL,取2 mL,然后加入5 mL 5%的苯酚溶液,再加入7.5 mL濃硫酸,以蒸餾水代杜仲提取粗品做空白對照,觀察顏色變化。2.2 分組及給藥取健康小白鼠60只,體重(22±3)g,雌雄各半,隨機分為6組(每組10只)：空白對照組、環(huán)磷酰胺組、陽性藥香菇多糖組(10 mg/kg)及杜仲總多糖高、中、低劑量組(200、100、50 mg/kg)。除空白對照組外,余動物第1、3、5、7天均腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg4,第9天時腹腔注射6%可溶性淀粉溶液1 mL/只；第11天時腹腔注射1%雞血紅細胞混懸液1 mL/只。杜仲總多

10、糖高、中、低劑量組及香菇多糖組按指定劑量灌胃給藥,空白對照組和模型組給予等量生理鹽水。2.3 觀察指標(biāo)2.3.1 體重自給藥第1天起隔日測量小鼠體重1次,并記錄數(shù)據(jù)。2.3.2 胸腺指數(shù)、脾指數(shù)解剖取胸腺、脾臟,用電子分析天平精密稱量胸腺、脾臟的質(zhì)量。按下式計算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)。 胸腺指數(shù)胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g) 脾指數(shù)脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)2.3.3 吞噬率和吞噬指數(shù) 給予雞血紅細胞混懸液半小時后,取腹腔液涂片,經(jīng)瑞士染色、沖洗、晾干后,在高倍油鏡下觀察,計算100個巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù),公式如下。 吞噬率吞噬雞血紅細胞的巨噬細胞數(shù)/100個巨噬細胞×100

11、% 吞噬指數(shù)被吞噬雞血紅細胞總數(shù)/吞噬雞血紅細胞的巨噬細胞數(shù)×100%2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件中相應(yīng)程序?qū)?shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,2組間均數(shù)采用t檢驗。3 結(jié)果3.1 多糖的提取與鑒定結(jié)果 杜仲原藥材300 g經(jīng)提取烘干后得杜仲提取物9.3 g。杜仲提取物呈咖啡色結(jié)晶,不易吸濕,易溶于熱水。經(jīng)硫酸-苯酚反應(yīng)后提取物水溶液呈淺橙色,顏色比反應(yīng)前加深；空白對照液呈淡黃色。由此實驗說明提取物可定性為杜仲總多糖。3.2 各項指標(biāo)檢測結(jié)果(見表1表3)表1 對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠體重的影響(略)注：與空白對照組比較,*P<0.05,*P<0.01；

12、與環(huán)磷酰胺組比較,#P<0.05,#P<0.01(下同)。表2 對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(略)表3 對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(略)4 討論杜仲是常用滋補藥材之一,其入藥已有兩千多年的歷史。國內(nèi)外學(xué)者對杜仲化學(xué)成分進行了大量研究,目前認為其主要活性成分有木質(zhì)素類、環(huán)烯醚萜類、有機酸、萜類、多糖、氨基酸和杜仲膠等。本次實驗以環(huán)磷酰胺40 mg/kg復(fù)制出免疫抑制模型。實驗結(jié)果表明,杜仲總多糖能減輕環(huán)磷酰胺所致小鼠體重的下降,升高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù),明顯增加小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)(P<0.01)。與空白對照組比較,杜仲總多糖還能提高正常小鼠的脾指數(shù)(P<0.05)。由此說明,杜仲總多糖具有一定的非特異性免疫增強功能。【參考文獻】 1 Suzuki I.Immunomodulation by Microbial.Products and related Synthetic CompoundsM.Amsterdam：Excepta Me