微生物工程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、克雷伯氏桿菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化 成員：陳文竹、陳怡璋、郭智、趙詔、宋培換一菌株復(fù)活及擴(kuò)大培養(yǎng)：（陳怡璋）（一）菌株的活化及篩選1、將冷凍保存的菌種轉(zhuǎn)接到lb培養(yǎng)基，37培養(yǎng)24 h，備用。2、菌株活化后，點(diǎn)樣接種于cmc一剛果紅分離培養(yǎng)基平板并做好標(biāo)記，倒置培養(yǎng)48 h， 根據(jù)透明圈大小及透明圈菌落直徑比選擇產(chǎn)酶菌株。 lb培養(yǎng)基：蛋白胨 10g，nacl 10g，酵母粉5g，瓊脂 1520g，水 1000ml，調(diào)節(jié)ph 至7.0，121滅菌20mincmc一剛果紅分離培養(yǎng)基(gl)：cmcna 188 g，剛果紅02 g，硫酸銨3 g，瓊脂20 g，mgs04·7h20 05

2、 g，nacl 05 g，k2hp04 1g，ph為7.0，121滅菌20 min（二）菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選出產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。如有條件，可對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的條件進(jìn)行優(yōu)化。若條件不允許，可直接利用lb培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。1、最適生長(zhǎng)ph將菌株點(diǎn)種到ph值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的lb培養(yǎng)基上，37恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌株的生長(zhǎng)情況并測(cè)量各平板上菌落的直徑。2、最適生長(zhǎng)溫度將菌株轉(zhuǎn)移到ph值60的lb培養(yǎng)基上，分別于30、35、40、45、50、55、60條件下恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌株生長(zhǎng)情況并測(cè)量各平板上菌落的直徑。3、碳源種類確定分別以1葡萄糖、蔗糖、果糖、乳

3、糖、可溶性淀粉、甘油作為碳源，其他組分均相同進(jìn)行培養(yǎng)24h。觀察菌株生長(zhǎng)情況并測(cè)量各平板上菌落的直徑。確定最佳碳源后，再分別以不同濃度（05、1、2、3、4、5、6、7、8）的最佳碳源，其他組分均相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)，確定最佳碳源的含量。 4、氮源種類確定分別以1蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、(nh4)2hp04、玉米漿、尿素為氮源，其他組分均相同進(jìn)行培養(yǎng)24h。觀察菌株生長(zhǎng)情況并測(cè)量各平板上菌落的直徑。確定最佳氮源后，分別以不同濃度（05、2、4、6、8、10%）的最佳氮源，其他組分均相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)，確定最佳氮源的含量。5、最適生長(zhǎng)濕度將菌株接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，在

4、相對(duì)濕度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，37恒溫培養(yǎng)24h。觀察菌株生長(zhǎng)情況并測(cè)量各平板上菌落的直徑6、無(wú)機(jī)鹽在基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別加入02nacl、k2hp04、mgs04、cacl2、fes04、mns04進(jìn)行培養(yǎng)24，觀察菌株生長(zhǎng)情況并測(cè)量各平板上菌落的直徑。選取影響最為顯著的無(wú)機(jī)鹽，分別以不同濃度（05、2、4、6、8、10），其他組分均相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌株生長(zhǎng)情況并測(cè)量各平板上菌落的直徑。7、氧氣通過(guò)培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)觀察菌株對(duì)氧氣的需求注意：若直接觀察菌株生長(zhǎng)情況不可明顯分辨出最佳條件，可將固體培養(yǎng)更換為液體培養(yǎng)，通過(guò)稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)量培

5、養(yǎng)液中活菌含量來(lái)確定。二菌株發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化：（趙詔、宋培換、郭智）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分：（趙詔）牛肉浸膏35g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂2025g，蒸餾水1000ml。將上述三種成分置于三角瓶中使其溶解，趁熱調(diào)整ph到7.6，分裝后高壓滅菌121，15min。1.碳源的優(yōu)化：（趙詔） 試驗(yàn)以蛋白胨為氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入1%的不同種類的碳源，羧甲基纖維素鈉，葡萄糖，淀粉，蔗糖，麥芽糖，玉米漿，甘露醇，d-果糖，其他成分不變，28左右150r/min搖床培養(yǎng)5天后測(cè)定酶活，最終選擇酶活力最高的實(shí)驗(yàn)組所用的碳源最適產(chǎn)酶的碳源。2.氮源的優(yōu)化（趙詔） 確定最佳碳源后，試驗(yàn)以最佳碳源為碳源，向培

6、養(yǎng)基中分別加入0.3%的不同種類的氮源，它們?yōu)榕Ｈ飧?，蛋白胨，硫酸銨，氯化銨，硝酸鉀，硝酸鈉，尿素，其他成分不變，置于28左右150r/min搖床培養(yǎng)5天后測(cè)定酶活，根據(jù)測(cè)試結(jié)果判定最適產(chǎn)酶的氮源。3.培養(yǎng)基起始ph對(duì)產(chǎn)酶的影響（趙詔） 優(yōu)化好碳源氮源，以及合適的碳氮比，用hcl和nacl試劑來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始ph分別為5.5，6.0, 6.5, 7.0,7.5,8.0,8.5。其他條件不變，培養(yǎng)基滅菌，接種以活化的菌株培養(yǎng)發(fā)酵，測(cè)定培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響，酶活力最高的組別所對(duì)應(yīng)的ph，是最適產(chǎn)酶ph。4發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化（趙詔） 將菌株接種在已經(jīng)優(yōu)化好的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)好合適的ph，將其放于合適的溫

7、度和轉(zhuǎn)速的搖床上培養(yǎng)48h，72h，96h，116h，135h。分別測(cè)定其酶活力，從而選擇出最佳的發(fā)酵時(shí)間。5.不同金屬離子的影響 （宋培換） （1）向培養(yǎng)基中加入不同的金屬離子，鎂離子，鐵離子，錳離子，鈷離子，鋅離子，銅離子，鈣離子，以探究不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響。（2）微量元素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在培養(yǎng)基中加入濃度為05mmoll的不同微量元素(試劑：mgs04·7h20、fes04·7h20、mns04·5h20、cocl2、zns04·7h20、cus04、cacl2、kh2p04)接種后發(fā)酵培養(yǎng)，分別于48h取樣測(cè)定酶活力，以不加微量元素作空白對(duì)照

8、，離子添加量都為2mg/l。（參考文獻(xiàn)：胡爽.青貯飼料中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選、發(fā)酵和產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶）6.攪拌速度。（宋培換）200rpm（200 rmin）（參考文獻(xiàn)：胡爽.青貯飼料中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選、發(fā)酵和產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶潘建梅產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究）7.生長(zhǎng)因子（宋培換） 查看文獻(xiàn)均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)添加生長(zhǎng)因子的，百度查看克雷伯氏菌屬均不需要添加生長(zhǎng)因子，也可正常生長(zhǎng)。8.培養(yǎng)溫度的優(yōu)化（郭智） 設(shè)24,25,26,27,28,29,306個(gè)溫度梯度，將液體菌種在最優(yōu)培養(yǎng)基，最適初始ph值的條件下，以10的接種量轉(zhuǎn)接到自動(dòng)發(fā)酵罐中，然后在不同的溫度下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，轉(zhuǎn)速200

9、rmin、通氣量1 000 ml·h-1發(fā)酵24h后取樣，測(cè)定酶活力以確定最適溫度。9.通氣量的優(yōu)化（郭智） 設(shè)200、400、600、800、1 000、1200l·h-1 6個(gè)通氣量梯度將液體菌種在最適溫度和最適ph值下，以10的接種量轉(zhuǎn)接到自動(dòng)發(fā)酵罐中，然后在不同的通氣量下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，轉(zhuǎn)速200 rmin，發(fā)酵24h后取樣，測(cè)定發(fā)酵液中的酶活力，根據(jù)結(jié)果判定最佳的通氣量。10.接種量的優(yōu)化（郭智） 接種量是指待接種的液體培養(yǎng)基與接入的培養(yǎng)液的體積百分比。用無(wú)菌水對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌進(jìn)行稀釋，使其細(xì)菌細(xì)胞密度成梯度，設(shè)接種量分別為0.5、1、2、3、4、5，在最適初始ph值和最

10、適溫度的條件下，在不同接種量下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，轉(zhuǎn)速200 rmin，發(fā)酵24h后取樣測(cè)定發(fā)酵液中的酶活力，確定最適接種量。三纖維素酶活性鑒定：（陳文竹） 纖維素酶是多組分復(fù)合物，各組分的底物專一性不同。纖維素酶作用的底物比較復(fù)雜，反應(yīng)產(chǎn)物不同，致使纖維素酶活力測(cè)定方法很多，各國(guó)的方法亦不統(tǒng)一。我們選擇濾紙、cmc為底物，原理系利用纖維素酶催化水解纖維素，產(chǎn)生纖維多糖、二糖及葡萄糖等還原糖，與顯色劑反應(yīng)，求出還原糖的濃度，間接求出酶的活力。由不同底物測(cè)得的酶活力分別稱作fpa(濾紙?zhí)敲富盍?和cmc(羧甲基纖維素酶酶活力)。1.酶液的制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)35，220 r瑚jn搖床培養(yǎng)。72 h，發(fā)

11、酵液用4層紗布過(guò)濾，3 000 rmin離心15 min，取上清液備用。2.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制原理：3，5一二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的強(qiáng)度成比例關(guān)系，利用分光光度計(jì)測(cè)出其在520 nm處的吸光度，得出還原糖的量。 取11支編號(hào)的試管按下表的順序加入0.2%glc，水及3,5-二硝基水楊酸試劑。然后在沸水浴中加熱5分鐘，然后立即用自來(lái)水冷卻，搖勻，于540nm測(cè)光密度，結(jié)果如下表所示：    管號(hào)含糖量（ug）bg濃度0.2%glc標(biāo)準(zhǔn)液（ml）水（ml）3，5-二硝基水楊酸試劑（ml）od540nm10.00.0

12、3.00.520.40.22.80.530.80.42.60.541.20.62.40.551.60.82.20.562.01.02.00.572.41.21.80.582.81.41.60.593.21.61.40.5103.61.81.20.5114.02.01.00.53.纖維素酶活力測(cè)定：dns法fpa濾紙酶活力: dns法即3，5一二硝基水楊酸比色法的英文簡(jiǎn)稱。 其原理是3，5一二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物一3一氨基一5一硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比。 取適當(dāng)稀釋的酶液，分別以濾紙或1的cmc溶液為底物

13、，于50恒溫水解反應(yīng)1 h；然后加人顯色劑dns，沸水浴中煮沸5 min；再加入蒸餾水，于530 nm測(cè)定吸光度od值。od值越大，說(shuō)明該菌株的酶活力越強(qiáng).酶活力計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出葡萄糖-mol數(shù)；酶活力(uml)=葡萄糖量/60ew其中：60為保溫時(shí)間(酶與底物作用時(shí)間，min)；ew為粗酶液的體積(ml)；u是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1umol葡萄糖的酶量。cmc酶活力的測(cè)定：(羧甲基纖維素鈉鹽(cmc-na)酶活性測(cè)定方法) 纖維素酶對(duì)cmcna有降解能力，生成葡萄糖等還原糖，再用dns法顯色，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)液，22 pc分光光度計(jì)在520 nm處測(cè)其吸光度，以每分鐘生成相當(dāng)于1umol的葡萄糖為一個(gè)酶活性單位。 取3支帶有20 ml刻度的試管，1支管作空白對(duì)照，2支管作平行樣品管。每支樣品管中加1 ml酶溶液，置于50水浴鍋中預(yù)熱2 min，然后在3支試管中分別加人4 ml已預(yù)熱至50的底物溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5 min取出，每管立即分別加入1 ml 2moll氫氧化溶液和2 ml dns顯色液，搖勻后在對(duì)照管中再加入1 ml酶液。將3支試管放人沸水浴中，5 min