腸道菌群與高脂血癥相關(guān)性研究

1、腸道菌群與高脂血癥相關(guān)性研究研究目的收集 2021年 1月-10 月中央民族大學(xué)校醫(yī)院慢性病體檢人員的臨 床生化檢測(cè)信息和糞便生物樣本 , 采用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)糞便樣本中腸道菌群 ASV( arnplicon sequence variant)的豐度 , 通過傾向性評(píng)分匹配法控制性別、年齡、高血壓、糖尿病等混雜因素的影響 , 篩選出高脂血癥與非高脂血癥人群的 差異ASV,再利用WGCNft概率圖模型(貝葉斯網(wǎng)絡(luò))模擬差異 ASV與高脂血癥 的因果作用關(guān)系 , 為核心菌群預(yù)防與治療高脂血癥提供科學(xué)依據(jù)。研究方法菌群 測(cè)序與結(jié)構(gòu)分析提取各糞便樣本腸道菌群總 DNA根據(jù)細(xì)菌V3-V4區(qū)設(shè)計(jì)引物(上

2、游弓I物為5 -ACTCCTACGGGAGGCAGCA下游弓I物為5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT擴(kuò)增 16S rRNA基因，在 illumina Hiseq2500 平臺(tái) 上進(jìn)行高通量測(cè)序,生成FASTQ格式的下機(jī)數(shù)據(jù)。運(yùn)用R軟件DADA2包過濾，去重復(fù)，嵌合體識(shí)別和合并雙端讀取，完成物種注 釋;用R軟件vegan包分析a多樣性、B多樣性,初步探索兩組樣品間的菌群結(jié)構(gòu) 差異。差異篩選與富集分析為了控制混雜因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，運(yùn)用R軟件 MatchIT 包按 1:1 的比例將高脂血癥組與非高脂血癥組進(jìn)行傾向性評(píng)分匹配。再利用R軟件DESe包篩選傾向性評(píng)分匹配后的高脂血癥組與非高

3、脂血癥組 的差異ASV按照界、門、綱、目、科、屬、種的分類結(jié)構(gòu)繪制差異ASV勺分類樹,并對(duì)每個(gè)分類進(jìn)行富集分析。功能聚類與因果模擬運(yùn)行R語(yǔ)言WGCN包進(jìn)行差異ASV的共表達(dá)分析,尋找差異ASV功能聚類模塊與高脂血癥及其生化指標(biāo)(CHOTG HDL-C LDL-C)的關(guān)系；對(duì)與高脂血癥臨床指標(biāo)有顯著性關(guān)聯(lián)的功能 模塊中差異ASVS行貝葉斯網(wǎng)絡(luò)分析,推測(cè)高脂血癥與ASM相互作用關(guān)系,確定 高脂血癥核心菌群研究結(jié)果本研究共收集 133 例體檢人員的臨床生化信息和糞便生物樣本。 其 中,高脂血癥樣本 87 例, 非高脂血癥樣本 46例。菌群測(cè)序與結(jié)構(gòu)分析通過dada2包對(duì)數(shù)據(jù)前處理,生成20295個(gè)A

4、SV 87份 非高脂血癥糞便樣品 , 在門水平上共 23 個(gè), 含量最高的四個(gè)細(xì)菌門依次是 Bacteroidetes (46.7%)、Firmicute ( 44.2%)、Actinobacteria (8.0%)和 Proteobacteria (0.3%); 在屬水平上 , 共有 368個(gè)屬, 有 18 個(gè)相對(duì)豐度大于 1.0% 細(xì)菌屬。相對(duì)豐度>5%屬,依次為 Bacteroides (33.32%)、Prevotella9 (7.68%)、 Bifidobacterium(6.74%)、 Faecalibacteriu(5.77%)。在相對(duì)豐度大于 1.0%的細(xì)菌屬中 , 屬于

5、擬桿菌門有 Bacteroides 、 Prevotella9; 屬于放線菌門為 Bifidobacterium; 屬于厚壁菌門有 Lachnospira (3.64%)、 Agathobacter (3.46%)、 Lachnoclostridium(3.39%)、 Blautia (1.93%)等。46份非高脂血癥糞便樣品 , 在門水平上共 19個(gè), 含量最高的四個(gè)細(xì)菌門依次 是 Firmicute (50.67%)、 Bacteroidetes (42.88%)、 Actinobacteria ( 5.84%) 和 Verrucomicrobia (0.26%)。在屬水平上共有 297個(gè)

6、屬, 有 18 個(gè)相對(duì)豐度大于 1.0%細(xì)菌屬。相對(duì)豐度>5%屬，依次為 Bacteroides (33.75%)、Faecalibacteriu (9.40%)、 Prevotella 9(5.23%)。在相對(duì)豐度大于 1.0%的細(xì)菌屬中 , 屬于擬桿 菌門的有 Bacterokides (33.75%)、 Prevotell9 (5.23%)、 Alistipes(1.51%)、Parabacteroide ( 1.17%) ; 屬于放線菌門為 Bifidobacterium ( 4.77%) ; 屬于厚 壁菌門的有 Lachnospira (3.54%)、 Agathobacter

7、 (3.77%)、 Lachnoclostridium2.78%)、 Blautia (1.665)、 Lachnoclostridium(9.40%)等。高脂血癥組與非高脂血癥組 Alpha 多樣性( Chao1 p=0.64,Observed species p=0.75,Simpsonp=0.6,Shannon p=0.71 )、Beta 多樣性( Bray-Curtis distance (R2=0.007,p=0.52 ),jaccard distance(R2=0.07,p=0.48 )均沒有顯著性差異(p>0.05 )。差異篩選與富集分析采用 PSM法 (匹容差為0.2 )

8、將高脂血癥 組與非高脂血癥組按 1:1 的比例配對(duì) , 共匹配出 44 對(duì)。匹配后的人群根本特征除了暴露因素(CHO TG HDL LDL)有顯著性差異, 混雜因素(年齡、性別、其他疾病等)均無顯著性差異。隨后利用R軟件的DESeq 包, 篩選傾向性評(píng)分匹配后的高脂血癥組與非高脂血癥組的差異ASV。共篩選出 359 個(gè)差異 ASV(|logFC|>2 且 adj.P.Val<0.01)。與 ASV物種注釋表比對(duì),差異ASV在門水平上被分為擬桿菌門(Bacteroidetes )、厚壁 菌門(Firmicutes )、變形菌門(Proteobacteria )、梭桿菌門(Fusoba

9、cteria )、 放線菌門( Actinobacteria )、疣微菌門( Verrucomicrobia ) , 共 6 個(gè)菌門。在屬水平上被分為擬桿菌屬( Bacteroides )、RuminococcaceaeUCG-01 、4 Paraprevotella 、 Asteroleplasma 、 Prevotella9 等,共42個(gè)屬,其中有35個(gè)ASV只能注釋到科水平。分 類學(xué)上 , 高脂血癥與非高脂血癥的關(guān)鍵菌群為擬桿菌屬、Prevotella9 、 Parabacteroid9 、 Paraprevotella, 同時(shí) 這些群落都隸屬于擬桿菌科至擬桿菌門的脈絡(luò)上。功能聚類與因果

10、模擬通過對(duì) 88 個(gè)樣本的高脂血癥檢測(cè)指標(biāo)及該疾病與各個(gè) 模塊進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析 , 篩選出與臨床信息顯著相關(guān)的目的模塊。根據(jù)加權(quán)基因共表 達(dá)網(wǎng)絡(luò)與高脂血癥臨床信息關(guān)聯(lián)結(jié)果顯示:CHO并沒有與之相關(guān)的模塊,與TG顯 著正相關(guān)的模塊為 blue 模塊(cor=0.22,p=0.44 )、red 模塊(cor=0.26,p=0.01 ),其中模塊所包含的ASV隸屬于厚壁菌門和擬桿菌門，主要菌屬有擬桿菌屬、毛螺 菌科、Erysipelatoclostridium 等；與HDL-C顯著負(fù)相關(guān)的模塊為cyan模塊(cor=-0.25,p=0.02 ),模塊內(nèi)ASV隸屬于擬桿菌門且皆為擬桿菌屬；與LDL-C 顯

11、著負(fù)相關(guān)的模塊為magenta模塊(cor=-0.23,p=0.03 ),ASV隸屬于厚壁菌門 和放線菌門 , 共有 3 個(gè)屬 , 分別為雙歧桿菌、 Ruminococcus2、Rothia;salmon 模塊(cor=-0.22,p=0.04 )、pink 模塊(cor=0.23,p=0.03 )、green 模塊(cor=0.26,p=0.02 )與高脂血癥(HL)顯著相關(guān)，但是salmon模塊與HL 是顯著負(fù)相關(guān),pink模塊、green模塊HL是顯著正相關(guān)。其中與HL顯著負(fù)相關(guān)salmon模塊的ASV的Prevotella9 隸屬于擬桿菌門。HL顯著正相關(guān)pink、green模塊的AS

12、V隸屬于擬桿菌門、厚壁菌 門,以擬桿菌屬和毛螺菌科為主。在差異功能模塊中,根據(jù)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)分析,ASV151直接影響HDL-C該菌為擬桿菌門的擬桿菌屬(Bacteroides )。ASV1756直接影響LDL-C,該菌為雙歧桿菌( Bifidobaoterium )。ASV360直接影響高脂血癥，且高脂血癥呈負(fù)相關(guān)，該菌為擬桿菌門的Prevotella9 。ASV428 ASV658直接影響高脂血癥,且與高脂血癥呈 正相關(guān) , 該菌為擬桿菌屬( Bacteroides )。研究結(jié)論從分類學(xué)角度，ASV151、ASV360 ASV428 ASV658屬于擬桿菌門,ASV1756屬于放線菌門；ASV151、ASV428 ASV65