三七莖葉中葉苷及黃酮的同步分離工藝研究

1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減三七莖葉中葉苷及黃酮的同步分離工藝研究(作者：單位：郵編：)【摘要】目的探索分離三七莖葉中的葉苷和總黃酮的工藝條件及參數(shù)。方法以靜態(tài)飽和吸附量、動態(tài)比吸附量、比洗脫量 為考察指標，比較不同大孔樹脂富集純化三七莖葉葉苷和總黃酮的性 能，并對最佳樹脂純化工藝進行篩選。 結(jié)果AB-8樹脂綜合性能最佳， 其吸附分離工藝條件為：上樣液濃度為葉苷1.806 0 mg/ml,總黃酮0.7852 mg/ml，上樣液以1.0 BV/h 吸附流速上樣，純水沖洗，60% 乙醇洗脫后，再用95%乙醇洗脫。結(jié)論經(jīng)大孔樹脂純化后的三七莖葉有效部位中，總黃酮加葉苷的質(zhì)量分數(shù)達 90%說明

2、該純化工藝是可 行的。【關(guān)鍵詞】 三七莖葉；大孔吸附樹脂； 有效部位三七莖葉為五加科植物三七 Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen 的地上部分，三七葉苷及黃酮是三七莖葉中的有效部位。三七總黃酮與皂苷合用，生理活性最強，分開使用則證明總黃酮能顯著增加心肌 冠脈流量1?，F(xiàn)代研究表明，三七葉苷有延年益壽和增強機體活力 的作用2;三七黃酮類成分具有增加冠狀動脈血流、降低心肌耗氧量、抗心律失常、抗氧化、抗衰老以及增強機體免疫力等功能，具有 治療老年性癡呆癥的可能，其在心腦血管疾病防治及保健等方面有廣 泛的應(yīng)用前景3。三七莖葉在三七道地產(chǎn)地文山資源豐富，大約每 年可收獲1

3、0 000 t ,本實驗以三七莖葉為原料，以提取物收率（提 取物質(zhì)量/原料質(zhì)量）和葉苷、總黃酮的純度為考察指標，采用醇提 - 樹脂法對三七葉苷及黃酮的提取分離與純化工藝進行了研究，以期為三七莖葉的開發(fā)提供依據(jù)。1材料三七莖葉購自云南文山三七國際交易市場；人參皂苷Re對照品購于中國生物制品檢定所；AB-8樹脂為天津南開大學化工廠產(chǎn)品，HPD-100 為河北滄州寶恩化工有限公司產(chǎn)品，D101-大孔吸附樹脂（華北地區(qū)特 種化學試劑開發(fā)中心）；其他試劑均為分析純。島津2550型紫外分光 光度計（日本島津公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科技有限 公司），R201D-H旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物

4、科技有限公司）。2方法與結(jié)果2.1工藝流程見圖1。2.2三七葉苷的含量測定22.2.1標準溶液的配制精密稱取人參皂苷 Re對照品0.020 0 g 用甲醇溶解并定容至10.0 ml，即每毫升含人參皂苷 Re 2.0 mg。2.2.2樣品測定精密吸取待測液1.0ml于蒸發(fā)皿，置于60C水 浴揮干；同樣精確吸取人參皂苷 Re標準溶液0.1 ml于蒸發(fā)皿中，置 于60C水浴揮干。在已揮干的蒸發(fā)皿中，分別準確加入 0.2 ml質(zhì)量 分數(shù)為5%的香草醛冰醋酸溶液，0.8 ml高氯酸，混勻后移入5 ml具 塞刻度離心管中；于60C水浴加熱10 min，取出后用流水冷卻，再 準確加入5.0 ml冰醋酸溶液搖

5、勻，以1 cm比色池于560 nm波長處 測定吸收值4，并通過下式計算求出含量。葉苷含量（mg/ml）二對照品量x A樣/A對樣品體積式中：A樣，樣品吸收值；A對，對照品吸收值；對照品量，標準管 人參皂苷Re的量（mg）;樣品體積（ml）。2.3黃酮含量測定4采用分光光度計法測定總黃酮含量，即 利用黃酮類化合物與鋁鹽反應(yīng)，產(chǎn)生紅色絡(luò)合物，以蘆丁為對照品于 500 nm波長處測定吸收值。2.3.1標準溶液的配制5精密稱取于120C干燥至恒重的蘆 丁對照品48.35 mg置于50 ml容量瓶中，加乙醇溶解至刻度，搖勻， 精確吸取此溶液10.0 ml置于50 ml容量瓶中，再加水至刻度，搖勻， 即得

6、標準溶液。2.3.2標準曲線的制作精密吸取蘆丁標準溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml分別置于25ml容量瓶中，各加水至6 ml，再加入 5%的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，混勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，混勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉10.0 ml再加水至25 ml，放置15 min （不加蘆丁作空白對照）。按分光光度計法在500 nm波 長處測定吸收值。所取標準溶液的濃度和吸收度數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理， 得回歸方程：A= 0.219 6C 0.011 2，其線性范圍為 00.6 mg相關(guān) 系數(shù) r=0.999 3。2.4上柱液的制備及預(yù)處理取干燥的三

7、七莖葉，用70%乙醇溶液為溶劑，料液比為1 : 50（g : ml），回流提取1.5 h，提取2次，合 并提取液，通過減壓蒸餾回收乙醇溶液，得到的固形物用一定量的熱 蒸餾水溶解、過濾后作為樣品溶液，總黃酮濃度為1.570 4 mg/ml，葉苷濃度為3.6120 mg/ml。2.5不同型號樹脂篩選2.5.1大孔吸附樹脂預(yù)處理先將樹脂放在水中浸泡，除去浮在表面的樹脂（反復幾次），再用95%乙醇浸泡24 h，使樹脂充分溶脹，濕 法裝柱。用95%乙醇以2 BV/h的流速通過樹脂層，流至流出液加蒸 餾水不變白色渾濁為止。再用蒸餾水以同樣流速洗盡乙醇。將5%的鹽酸溶液以46 BV/h流速通過樹脂層，并浸泡

8、24h，然后用蒸餾 水以同樣流速洗至中性，再用 2%勺NaOH溶液以46 BV/h流速進行 堿洗，用去蒸餾水洗至中性即處理完畢。2.5.2靜態(tài)吸附試驗由于三七葉苷和黃酮的極性較弱，根據(jù)相似相溶原理，弱極性的化合物更易被弱極性的樹脂所吸附，故本實驗選擇D101 （非極性）、AB-8 （弱極性）、HPD-100（非極性）作為備選樹 脂。在帶塞的錐形瓶中，各加入取處理好的樹脂1 ml和150 ml上柱液于25C恒溫搖床中，振蕩24 h，充分吸附后，過濾，取濾液，分 別按“ 2.2 ”和“2.3 ”項下方法測定樣品吸附前后葉苷和總黃酮的濃 度,按下式計算各種樹脂的靜態(tài)飽和吸附量（mg/ml濕樹脂）。吸

9、附量（mg/ml）二C0-CrW樹脂x V式中C0和Cr分別為吸附前后提取液中的質(zhì)量濃度（mg/ml），W樹脂 為樹脂的體積（ml） , V為溶液的體積（ml）。結(jié)果見表1。表1樹脂靜 態(tài)吸附結(jié)果（略）試驗結(jié)果表明AB-8、HPD-100對葉苷及總黃酮靜態(tài)飽和吸附量均較 大，D101樹脂對葉苷及總黃酮的吸附能力較小。2.5.3樹脂動態(tài)吸附實驗比吸附量是評價樹脂真實吸 附能力的指標，是選擇樹脂種類的參數(shù)；比洗脫量是評價樹脂解吸能 力與洗脫劑的洗脫能力的指標，也是選擇樹脂種類及洗脫劑的參數(shù)。 本實驗以比吸附量和比洗脫量為指標， 對上述3種樹脂進行篩選。將 經(jīng)預(yù)處理的樹脂30 ml，濕法裝柱，徑高比

10、為1 : 10,上柱液以1.0 BV/h 流速上樣，隨時采用FeCI3乙醇溶液檢測流出液，以FeCI3反應(yīng)變綠 為泄露，停止上樣，收集過柱液；純水沖洗至流出液顏色極淡，然后 用95臨醇洗脫，流速為1.0 BV/h，洗至無明顯FeCl3顏色反應(yīng)。分 別收集各支柱子的洗脫液，定容，按“ 2.2 ”及“ 2.3 ”項下方法測定 葉苷及總黃酮含量，計算比吸附量、吸附率、比洗脫量、洗脫率。結(jié) 果見表23。表2總黃酮動態(tài)吸附及洗脫試驗結(jié)果（略）比吸附量（mg/ml） =M-M殘-M水洗 WM上為上柱液中指標成分的含量，M殘為流出液中指標成分含量；M 水洗為水洗脫液中指標成分含量；W為樹脂體積（ml）。吸附

11、率（% 二CO-CrCOX 100%C0為上柱液指標成分濃度（mg/ml） ； Cr為過柱液中指標成分濃度 (mg/ml)。比洗脫量二M洗脫W M洗脫為洗脫液中指標成分的含量， W為樹脂體 積（ml）。洗脫率（%二比洗脫量比吸附量x 100%表23的結(jié)果表明，AB-8、HPD-100型大孔樹脂對葉苷及總黃酮的動態(tài)吸附量、洗脫率均較大，但綜合比較可以發(fā)現(xiàn)， AB-8樹脂的綜 合收率（葉苷比洗脫量加總黃酮比洗脫量）最好，因此將 AB-8型大 孔吸附樹脂作為進一步分離純化三七莖葉中葉苷和總黃酮所用樹脂。表3葉苷動態(tài)吸附及洗脫試驗結(jié)果（略）2.6純化工藝參數(shù)篩選2.6.1上樣吸附參數(shù)的篩選上樣濃度篩選

12、：取處理好的AB-8大孔吸附樹脂，濕法裝柱， 取5份上柱液，分別調(diào)整總黃酮濃度為 0.196 3，0.392 6，0.785 2,1.570 4，3.1408mg/ml，葉苷濃度為 0.451 5，0.903 0，1.806 0，3.612 0，7.2240 mg/ml。以1BV/h流速上樣，然后用純水洗脫至顏色極淡，計算比吸附量。結(jié)果見表4。表4上柱液濃度對比吸附量的 影響（略）從表4可以看出，AB-8樹脂的比吸附量隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加 而增高，當上樣液質(zhì)量濃度升高到總黃酮濃度0.785 2 mg/ml、葉苷濃度為1.806 0 mg/ml時，AB-8樹脂的比吸附量趨于飽和。吸附流速的篩

13、選：精確量取相同體積的上述項中確定的最佳上樣液濃度的上樣液5份，分別以0.5，1，1.5，2, 2.5 BV/h對相同 型號層析柱、相同體積的 AB-8樹脂柱進行吸附，然后用蒸餾水洗至 顏色極淡，用“2.2 ”及“2.3 ”項下的方法測定葉苷及總黃酮的含量， 計算出比吸附量。結(jié)果見表5。表5吸附流速對比吸附量的影響（略）從表5可以看出，隨著吸附流速的增加，樹脂比吸附量呈顯著下降 趨勢，以0.5 BV/h和1.0 BV/h的流速吸附效果基本相近最佳，考慮 到工作量及工作效率等因素，以 1.0 BV/h的流速吸附效果最佳。流 速過快則樹脂泄漏嚴重，有部分樹脂吸附還未達到飽和就已經(jīng)泄漏， 吸附效果明

14、顯下降。但若流速過慢，工作量大且工作效率低。2.6.2洗脫參數(shù)篩選葉苷與總黃酮的梯度洗脫：將總黃酮濃度為 0.785 2 mg/ml、葉苷 濃度為1.806 0 mg/ml，上樣液以1.0 BV/h流速上樣達飽和時，用 蒸餾水洗至顏色極淡，分別用 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70，80, 90，100%勺乙醇溶液以1.0 BV/h的流速進行洗脫得不同洗脫液，用“2.2 ”的方法進行測定葉苷含量；用“ 2.3 ”的方法進行測定總黃酮 含量。結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，用60%L醇溶液可以把吸附在 AB-8樹脂上的大部分葉苷洗脫下來，再用95%L醇溶液（乙醇的一般 商品規(guī)格）可

15、以把吸附于 AB-8樹脂上的大部分總黃酮洗脫下來。但 由圖2可以看出：葉苷與總黃酮仍有一定的交叉，分析其原因：大孔 樹脂吸附原理主要為物理吸附，所以比表面積增加，表面張力隨之增 大，吸附量提高，對吸附有利。但樹脂的實際應(yīng)用是由樹脂的極性、 孔徑、孔容及均一性的綜合性能決定的。因此，出現(xiàn)此結(jié)果，可能是 大孔吸附樹脂的均一性差以及裝柱效果不理想等因素所造成的。綜合以上分析，采用 60%勺乙醇溶液洗脫，富集以葉苷為主要成分 的三七莖葉有效部位（含葉苷87.0%,總黃酮含量為6.4%）;用60%L 醇溶液洗脫后，再以95%勺乙醇溶液洗脫，富集以總黃酮為主要成分 的三七莖葉有效部位（葉苷含量為 13.3

16、%,總黃酮含量為76.5%）。洗脫流速的篩選：根據(jù)上述的篩選結(jié)果，以60呀口 95%勺乙醇溶液為 洗脫劑，分別米用不同的洗脫流速進行梯度洗脫。 結(jié)果見表6。表6洗 脫流速對比洗脫量的影響（略）從表6的實驗結(jié)果可以看出，當洗脫流速大于 1.5 BV/h時，無論是 采用60%L醇溶液，還是95%的乙醇溶液進行洗脫，葉苷和黃酮的洗 脫率均大幅度下降，故采用1.5 BV/h的洗脫流速進行洗脫。2.7重復性實驗采用上樣液的總黃酮濃度0.785 2 mg/ml,葉苷濃度為1.806 0 mg/ml的質(zhì)量濃度上樣，以1.0 BV/h的流速吸附， 用蒸餾水洗至顏色極淡，以60%勺乙醇溶液為洗脫劑，洗脫流速為1

17、.5 BV/h，洗脫直至FeCI3乙醇溶液呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，收集洗脫液，改用 95%L醇溶液繼續(xù)洗脫，至FeCl3乙醇溶液不呈現(xiàn)顏色反應(yīng)停止洗脫， 收集洗脫液，減壓蒸餾回收溶劑，于60 C真空干燥，測定總黃酮及葉苷的含量，并計算提取物總收率。重復實驗6次。結(jié)果見表7。表7重復性實驗結(jié)果（略）表7的實驗結(jié)果表明，采用該工藝提取分離三七莖葉中的葉苷及總 黃酮重復性較好，工藝穩(wěn)定。3討論利用醇提、AB-8大孔吸附樹脂純化工藝提取分離三七莖葉中葉苷及黃酮的方法，采用島津2550型紫外分光光度計測定葉苷及黃酮的含 量，方便快捷，操作成本低。通過考察上樣液濃度、上樣液洗脫速率 及乙醇洗脫劑濃度對三七莖葉中葉苷

18、及總黃酮分離純化的影響，確立了提取分離三七葉苷及總黃酮的最佳工藝條件。其工藝為：上樣液的 總黃酮濃度0.785 2 mg/ml、葉苷濃度為1.806 0 mg/ml的質(zhì)量濃度 上樣，以1.0 BV/h的流速吸附，用蒸餾水洗至顏色極淡，以 60%勺 乙醇溶液洗脫直至FeCI3乙醇溶液呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，收集洗脫液，改用 95沱醇溶液繼續(xù)洗脫，至Fecl3乙醇溶液不呈現(xiàn)顏色反應(yīng)停止洗脫， 收集洗脫液，減壓蒸餾回收溶劑，于60C真空干燥至恒重，得到提取物。通過該工藝分離得到的三七莖葉有效部位，60%L醇溶液洗脫部位以 葉苷為主要成分，其葉苷含量達到87注右，總黃酮含量達到 6.7%左右；95%L醇溶液洗脫部位以總黃酮為主要成分，其總黃酮含量為 76.5%左右，葉苷含量為13%右。可以根據(jù)提取需要，選擇95%醇 溶液洗脫，也可分別用60呀口 95%醇溶液進行分部洗脫。醇提取物 加水溶解后，通過大孔吸附樹脂，先用洗脫除盡游離糖等非皂苷成分 后，改用30% 60%L醇洗脫，皂苷被洗脫下來，而總黃酮成分被吸 附在大孔樹脂上5。從三七莖葉中提取分離葉苷和總黃酮，使用樹 AB-8脂法可 作為初步分離的手段，但從分離效果可以看出，葉苷和黃酮還存在著 較大的交聯(lián)，對大孔吸附樹脂的型號還需要進一步篩選