工作手冊(cè)獸藥及違禁藥物

1、第四節(jié)獸藥及違禁藥物 1動(dòng)物源性食品中B-受體激動(dòng)劑殘留GC/MS法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 1適用范圍 本程序適用于動(dòng)物源性食品中10種俟受體激動(dòng)劑殘留的氣相色譜 一質(zhì)譜聯(lián) 用法測(cè)定。 當(dāng)試樣取5.0g時(shí)，本方法10種俟受體激動(dòng)劑的檢出限為0.5他/kg1.0卩 g/kg,定量限為 1.0 他/kg 2.0 pg/kg。 2 原理 本方法采用3-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶解動(dòng)物組織，然后通過(guò)固相萃取 柱凈化，用雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA） +1% （ ）三甲基氯硅烷（TMCS ） 衍生后采用GC/MS測(cè)定動(dòng)物組織中10種3受體激動(dòng)劑殘留，同位素內(nèi)標(biāo)法定 量。 3 試劑 除非另有說(shuō)明，所有試

2、劑均為分析純。 3.1甲醇（色譜純）； 3.2 鹽酸； 3.3 正己烷； 3.4 乙酸乙酯（色譜純）; 3.5氨水； 3.6 無(wú)水硫酸鈉，于450 C灼燒4h，冷卻后貯于干燥器中備用。 3.7特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、馬布特羅、西馬特羅、班布特羅、 克侖潘特、苯氧丙酚胺、卡布特羅；萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品。 3.8 D9-克倫特羅、D3-沙丁胺醇、D5-萊克多巴胺內(nèi)標(biāo)。 3.9 俟葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶購(gòu)自 Sigma ; 3.10 雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+1%（）三甲基氯硅烷（TMCS ） 3.11 俟受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱(chēng)取各種受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品10mg 于10mL容量

3、瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在-18 C冰箱中備用；受體 激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)使用液用甲醇稀釋至 O.1mg/L。 3.12D9-克倫特羅、D3-沙丁胺醇、D5-萊克多巴胺（1.0mg/L ）受體激動(dòng) 劑內(nèi)標(biāo)混合液：使用時(shí)用甲醇稀釋儲(chǔ)備液至1.0 mg/L混合液。 4 儀器與耗材 4.1氣相色譜質(zhì)譜儀。 4.2漩渦混勻器。 4.3 氮吹儀。 4.4 具塞刻度試管:10 mL o 4.5固相萃取儀。 4.6 離心機(jī):最低轉(zhuǎn)速8 , 000r/min 4.7 SLW固相萃取柱:規(guī)格為500mg/6ml （杭州福裕科技服務(wù)有限公司） 5 操作步驟 5.1樣品采集、制備、保存 動(dòng)物組織（包括肌肉、肝臟

4、、腎臟、肺等）采集200_500g,取肌肉部分用組織 搗碎機(jī)（或者榨汁機(jī)）絞碎，四分法取 50 100g，放在具塞玻璃瓶或者食品袋 中，貼上標(biāo)簽后，放在-18 C冰箱凍藏 5.2樣品酶解 稱(chēng)取5.0g經(jīng)絞碎均勻的動(dòng)物組織于50mL離心管中,分別加50此1.0 mg/L 受體激動(dòng)劑內(nèi)標(biāo)混合液，靜置10min，加入15ml0.2mol/LpH5.2 乙酸鈉-醋酸 緩沖液，用勻質(zhì)機(jī)勻質(zhì)20s，加入50此禺葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶液，在 37 C水浴中水解16h后取出冷卻，8，000 r/min 離心10min，分出上層溶液， （注意如果液面有脂肪析出，可以用棉花過(guò)濾）用2.0mol/鹽酸溶液調(diào)節(jié)至

5、2.0 0.1（pH測(cè)定儀），再在8，000 r/min 離心10min，分出上清液待用。 5.3樣品凈化 取SLW （或者SLS）固相萃取柱，先用甲醇 5mL、水5mL、50mmol/L 鹽 酸5mL活化柱子，然后將10mL上清液加到柱子上過(guò)柱，再用5mL水淋洗除雜， 真空泵抽干5min ,先用5mL甲醇洗脫，然后用10ml5%氨化乙酸乙酯洗脫收 集，在50 C水浴中氮?dú)獯蹈伞?5.4樣品衍生 蒸發(fā)剩余物加0.1mL雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+1% （仍三甲 基氯硅烷（TMCS），在80 C的烘箱中加熱衍生1.0h，氮?dú)獯蹈?，?.2mL甲 苯溶解；另外分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液，加50此內(nèi)標(biāo)

6、使用液，氮?dú)獯蹈珊笈c樣品同時(shí)進(jìn) 行衍生化。取1.0此甲苯溶液進(jìn)行GC-MS分析。 5.5樣品分析 5.5.1色譜質(zhì)譜參考條件 a）HP 5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱 （30 m X0.25 mm x 0.25 m）或等同柱； b）進(jìn)樣口溫度：280 C； c）柱溫:初溫100 C,保持3min，然后以10C/min升至280 C,保持 5min,300 C postrun 5min ； d）載氣:氦氣，純度99.999 %，流速1mL/min ; e）進(jìn)樣量:1-2此； f）電離方式：EI源,70eV。 g）離子源溫度：230 C； h）進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣； i）溶劑延遲：

7、11min。 5.5.2選擇離子監(jiān)測(cè)方式：監(jiān)測(cè)離子見(jiàn)下表1,標(biāo)準(zhǔn)總離子流圖見(jiàn)下圖1,樣品空 白離子流圖見(jiàn)圖2。 表1參考保留時(shí)間及監(jiān)測(cè)離子 保留 定量離定性離子檢測(cè)限 定量限 化合物內(nèi)標(biāo) 時(shí)間 子 m/z m/zjig/kg呃/kg 馬布特羅 D9 - -克倫特羅 11.39 86 277、296、367 1.0 2.0 特布他林 D3-沙丁胺醇 13.77 356 86、426、370 0.5 1.0 D9 克倫 特羅 13.78 262 95 卡布特羅 D9 - -克倫特羅 13.78 325 86、282、308 1.0 2.0 克倫特羅 D9 - -克倫特羅 13.83 262 86、

8、243、277 1.0 2.0 西馬特羅 D9 - -克倫特羅 14.00 72 219、276、287 1.0 2.0 D3-沙 丁 14.51 372 86、443 胺醇 沙丁胺醇 D3-沙丁胺醇 14.52 369 86、440、384 0.5 1.0 克侖潘特 D9 - -克倫特羅 14.82 100 262、243、277 1.0 2.0 苯氧丙酚 胺 D5- 胺 萊克多巴 17.93 178 267、430、267 1.0 2.0 班布特羅 D5- 胺 萊克多巴 18.98 354 86、282、354、 1.0 2.0 D5-萊克 多巴胺 20.26 255 507 萊克多巴 胺

9、 D5- 胺 萊克多巴 20.26 250 179、267、502 1.0 2.0 強(qiáng)度x 104 10 16 12 11 12+13 1.馬布特羅；2.特布他林；3+4 D9-克倫特羅+卡布特羅；5.克倫特羅；6+7+8. 西馬特羅+D3-沙丁胺醇+沙丁胺醇；9.克侖潘特；10.苯氧丙酚胺；11.班布特羅; 12+13 D5-萊克多巴胺+萊克多巴胺 圖1受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)總離子流圖 3.D9-克倫特羅；7.D3-沙丁胺醇；12 D5-萊克多巴胺 圖2樣品空白空白離子流圖 5.5.3樣品測(cè)定 分別取100 , 150 , 200 , 250 , 500此 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，加 50此 內(nèi)標(biāo)使

10、用液，氮?dú)獯蹈裳苌筮M(jìn)行儀器分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；然后進(jìn)行樣品測(cè)定，根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中10種受體激動(dòng)劑含量n。根據(jù)受體激動(dòng)劑保留時(shí)間及碎片 離子進(jìn)行定性、定量分析。 6計(jì)算 試樣中對(duì)應(yīng)10種受體激動(dòng)劑含量按式（1）計(jì)算，結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后1位： n X = m人 式中： X試樣中對(duì)應(yīng)10種受體激動(dòng)劑含量，單位為微克每千克（旳/kg ）； 試樣中中色譜峰與內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值對(duì)應(yīng)的受體激動(dòng)劑的 含量，單位為納克（ng ）； m 樣品的取樣量，單位為克（g）; 7 精密度 本方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 7.6%15.4%。 8 說(shuō)明 8.15%氨化乙酸乙酯要求現(xiàn)配現(xiàn)用，充分混勻。 8.2為了保證分析結(jié)

11、果的準(zhǔn)確，要求在分析每批樣品時(shí)，進(jìn)行樣品加標(biāo)5.0 他/kg試驗(yàn)，計(jì)算添加回收率，多組分殘留測(cè)定添加回收率應(yīng)在 60-120%范圍 之內(nèi)。對(duì)于每批固相萃取柱應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)回收率在80% 以上。 2肉及肉制品中B-興奮劑的測(cè)定酶聯(lián)免疫方法 1適用范圍 本方法適用于肉及肉制品中 伕興奮劑的測(cè)定。 2原理 試劑盒提供的微孔板上的微孔預(yù)包被了伕興奮劑抗體。標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的 俟 興奮劑即抗原和樣品中的抗原分別與酶標(biāo)記結(jié)合物（酶標(biāo)記抗原）同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)包被 抗體上的有限結(jié)合位點(diǎn)，形成抗體/抗原、抗體/酶標(biāo)記抗原復(fù)合物。室溫孵育， 使競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)完全。洗滌酶標(biāo)板，除去游離的反應(yīng)物。加入底物，在室溫下，

12、酶標(biāo) 記結(jié)合物上的辣根過(guò)氧化物酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，孵育一定時(shí)間使顏色發(fā)生 最大變化。加入終止液使反應(yīng)終止，同時(shí)反應(yīng)物顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)黃。顏色的深度與標(biāo) 準(zhǔn)品/樣品中的俟興奮劑含量成反比，使用酶標(biāo)儀在450 n m波長(zhǎng)下讀取相應(yīng)的 吸光度值。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品中 1.4氫氧化鈉（1M ） 4儀器與耗材 4.1裝載450nm濾光片的酶標(biāo)儀，推薦同時(shí)裝載 630nm參考濾光片； 4.2 37 T孵育器； 4.3移液器及吸頭：10 uL -125 uL ; 4.4密圭寸膜或微孔板密圭寸蓋 4.5離心機(jī) 5操作步驟 5.1樣品制備 5.1.1稱(chēng)取1 0.1g均質(zhì)后的組織樣品于帶蓋的離心管中 5.1.2

13、加入5mL乙酸乙酯，然后以5000r /min以上的速度渦旋30s，注 意防止乙酸乙酯飛濺。 5.1.3 7000r /min的速度離心2min ,注意蓋上蓋子防止乙酸乙酯揮發(fā)， 吸 取上層有機(jī)溶劑于離心管中。 5.1.4在有機(jī)溶劑中加入2mL0 . 10mol /L的鹽酸溶液，旋渦30s。 5.1.5 5000r /min的速度離心2min，吸取2ml下層溶液。 5.1.6用2 . 5mol / L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至為7。 5.1.7調(diào)整后的液體即可上板檢測(cè)。 5.2測(cè)定 5.2.1將足夠標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。 5.2

14、.2加入25ul的標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做 兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，然后加入100ul酶標(biāo)記結(jié)合物到每個(gè)微孔。 5.5.3用密圭寸膜或微孔板密圭寸蓋將微孔板密圭寸，在桌面做圓周運(yùn)動(dòng)將內(nèi)容物 混勻，然后將其置于室溫下（19 C25 C ）黑暗孵育1小時(shí)。 5.2.4翻轉(zhuǎn)輕拍微孔板，將微孔內(nèi)液體倒出。 在15分鐘內(nèi)用稀釋的洗滌/緩沖液洗滌酶標(biāo)板6次（洗滌中要確保所有的 孔均注滿(mǎn)洗滌緩沖液），最后一次洗滌完成后，將酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)置于吸水紙巾上并 輕拍以去除殘液，直至徹底干燥。 5.2.5干燥后，立即用8通道移液器向每一個(gè)微孔移取 125讓底物溶液。 完成后，從一端至另一端輕拍微孔板，19

15、 C至25 C黑暗孵育20坐分鐘。 5.2.6每個(gè)孔加入100讓終止液終止反應(yīng)，反應(yīng)物的顏色會(huì)由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃 色。 5.2.7于10分鐘內(nèi)，用450nm的酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。如果有必要，可以 采用630nm參考波長(zhǎng)。 6. 計(jì)算 分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光值。 以吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì) 數(shù)值（Iog10）為橫坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀取樣品的濃度，由于樣品制備過(guò)程中被不同程度的稀釋?zhuān)虼藦?標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出的濃度需乘以稀釋系數(shù) 2才為樣品實(shí)際濃度。 也可使用數(shù)據(jù)處理軟件。 7. 說(shuō)明 7.1本產(chǎn)品僅用于體外診斷，不要用口移取溶液。 7.2請(qǐng)?jiān)谡?guī)的實(shí)驗(yàn)室中，由受過(guò)相關(guān)培訓(xùn)的實(shí)

16、驗(yàn)人員進(jìn)行操作，并遵守實(shí)驗(yàn)室 操作守則。 7.3洗滌緩沖液中含有防腐劑，請(qǐng)勿食用或與皮膚、粘膜接觸。 7.4溫度低于20 C或試劑及標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有回到室溫（15-25 C）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 值偏低。 7.5洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重 復(fù)性不好的現(xiàn)象，所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 7.6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，最好避免直接暴露在光線(xiàn)下。 7.7混合要均勻，洗板要徹底（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 7.8反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 7.9不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑 盒這樣會(huì)引起靈敏度降低

17、。 3食品中氯霉素殘留測(cè)定法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 1 適用范圍 本程序適用于規(guī)定了肉制品、水產(chǎn)品、蜂蜜和乳制品等食品中氯霉素的氣相 色譜質(zhì)譜聯(lián)用負(fù)化學(xué)源法(GC-MS-NCI )定性、定量檢測(cè)。 本方法檢出限和定量限分別為0.1他/kg和0.3他/kg。 2 原理 樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，液液分配、固相萃取凈化，硅烷化衍生后采用 GC-MS-NCI選擇離子方式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。 3 試劑 3.1 乙酸乙酯：色譜純。 3.2甲苯：色譜純。 3.3 正己烷：色譜純。 3.4氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mg/mL(甲醇)：準(zhǔn)確稱(chēng)取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)10.0mg,用 甲醇溶解并定容至10mL,存放在冰箱中備用。 3.5 D5

18、-氯霉素同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液 0.1mg/mL :取D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)1.0mg, 用甲醇溶解并定容至10mL,存放在-18 C冰箱中備用。 3.6 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液50ng/mL :由1mg/mL的儲(chǔ)備液臨用前分級(jí)用甲 醇稀釋得到50ng/mL,于4 C冰箱中保存，有效期7天。 3.7 D5-氯霉素同位素內(nèi)標(biāo)使用液50ng/mL :由0.1mg/mL的儲(chǔ)備液分級(jí) 用甲醇稀釋得到50ng/mL.,于4 C冰箱中保存。 3.8 衍生試劑：BSTFA+1%TMCS。 4 儀器和耗材 4.1 氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS-NCI 4.2均質(zhì)機(jī) 4.3氮?dú)獯蹈蓛x 4.4 離心機(jī) 4.5 硅膠固相萃取柱：規(guī)格 500

19、mg/6mL 。 5 操作步驟 5.1試樣的制備與保存 5.1.1肉制品和水產(chǎn)品 肉制品和水產(chǎn)品去骨后用攪肉機(jī)攪碎并混合均勻，按法取樣后測(cè)定，留樣密 封，做好標(biāo)記后于18 C冷凍保存。 5.1.2蜂蜜和乳制品 對(duì)無(wú)結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)室樣品，將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下， 置于不超過(guò)60 C的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室 溫。按法取樣后測(cè)定，留樣密封，并做上標(biāo)記于- 18 C冷凍保存。 5.2樣品提取 5.2.1肉制品和水產(chǎn)品 稱(chēng)取4g絞碎的樣品，加100uL內(nèi)標(biāo)使用液，20mL乙酸乙酯，均質(zhì)，離心, 取上清液10mL，50 C氮?dú)獯蹈扇軇┖?，加?.5mL甲醇溶解

20、殘?jiān)?，再?mL 的1mol/L NaCI溶液，混勻后加2mL X2的正己烷脫脂，最后用3mL、2mL乙 酸乙酯分別萃取水相，離心后取乙酸乙酯層，合并用氮?dú)獯蹈伞?5.2.2蜂蜜和乳制品 稱(chēng)取4g混勻的樣品，力卩100uL內(nèi)標(biāo)使用液、5mL水、20mL乙酸乙酯， 混勻后室溫超聲提取5min，離心，取上清液10mL，50 C氮?dú)獯蹈扇軇┖螅?入0.5mL甲醇溶解殘?jiān)?，再?mL的1mol/L NaCI溶液，混勻后加2mL X2 的正己烷脫脂，最后用3mL、2mL乙酸乙酯分別萃取水相，離心后取乙酸乙酯 層，合并用氮?dú)獯蹈伞?5.3樣品凈化 由于負(fù)化學(xué)源對(duì)氯霉素的選擇性較高， 基體干擾較少，樣品經(jīng)

21、上述液液分配 凈化后可以直接硅烷化后進(jìn)行篩選。 對(duì)于有干擾或者陽(yáng)性的樣品，可以按下述方 法固相萃取凈化。 5.3.1硅膠柱的活化，依次用5mL的乙腈和二氯甲烷淋洗活化。 5.3.2上述處理后的殘?jiān)?mL二氯甲烷溶解，并定量上樣于活化后的硅膠 柱中。 5.3.3用10mL二氯甲烷淋洗，并棄去。用10mL乙酸乙酯洗脫，并收集洗 脫液，氮?dú)獯蹈纱苌鬁y(cè)定。 5.4衍生化 取上述吹干后的殘?jiān)尤?00uL甲苯，80uL衍生化試劑，混勻，密封，于 65 C烘箱中反應(yīng)20min后用氮?dú)獯蹈?，力卩甲?.2mL溶解后測(cè)定。取110ng 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，加100uL內(nèi)標(biāo)使用液，氮?dú)獯蹈珊笸窖苌瘻y(cè)定。

22、5.5樣品分析（色譜質(zhì)譜測(cè)定） 5.5.1色譜條件 a）色譜柱 HP-5MS （30m X0.25mm X0.25um ）。柱溫 100 C保持 1min, 以15 C /min 升溫到240 C保持5min;再以10 C /min 升溫到270 C保持 5min。 b）進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為250 C和280 C。 c）傳輸管溫度280 C。 d）氦氣流速1mL/min 。 5.5.2質(zhì)譜條件 負(fù)化學(xué)源法，四級(jí)桿和離子源溫度均為150 Co 40 %甲烷為反應(yīng)氣。氯霉 素定量離子466，定性離子468、376、378 , D5-氯霉素定量離子 471，定性 離子473、381 ;標(biāo)準(zhǔn)品提取

23、離子色譜圖見(jiàn)圖1 o Ti 氯霉素：11.26min D 5-氯霉素:11.23min 氟甲砜霉素：13.49min 甲砜霉素：14.87min 圖1標(biāo)準(zhǔn)品提取離子色譜圖 氯霉素質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2 , d5-氯霉素質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3 o Abundance l4000 3000 12000 1000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 000 253 466 376 488 351 186 0丄十117144J66Fi 120 140 160 180 200 220 240260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

24、 460 480 m/z- 圖2氯霉素質(zhì)譜圖 n 30 1(12 .9 0 2 m i n): C A P 0 0 0 1 .D (-30 7 )(-) 4 7 1 3 5 2 1 2194 4 2 0 4060 82022242628303234363802(4468 - 圖3 D5-氯霉素質(zhì)譜圖 計(jì)算 樣品中氯霉素含量按式（1）計(jì)算： C X1000 X = W X1000 1）（ 式中：X試樣中氯霉素含量，單位為微克每千克（ 他/kg ）; C內(nèi)標(biāo)法氯霉素的測(cè)定值，單位為納克（ng）； W 取樣量，單位為克（g ）。 7 說(shuō)明 同時(shí)為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確，要求在分析每批樣品時(shí)，取空白樣品

25、進(jìn)行 1.0他/kg加標(biāo)，計(jì)算添加回收率，添加回收率應(yīng)在60-120%范圍之內(nèi)。要求同 位素內(nèi)標(biāo)物的絕對(duì)回收率30 %，不符合時(shí)需重新稱(chēng)樣檢測(cè)。 4動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 1 適用范圍 本程序適用于水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品和畜禽副產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中氯霉素、氟 甲砜霉素和甲砜霉素殘留量的液相色譜一質(zhì)譜 /質(zhì)譜法定性確證和定量測(cè)定。 本方法氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的檢出限和定量限分別均為 0.1 他/kg 和 0.3 /kg。 2 原理 針對(duì)不同動(dòng)物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留，分別采用乙 腈、乙酸乙酯一乙醚或乙酸乙酯提取， 提取液用固相萃取柱進(jìn)行凈化，液相

26、色譜 一質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定，氯霉素采用內(nèi)標(biāo)法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外標(biāo) 3 試劑 除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和二次去離子水或相當(dāng) 純度的水。 3.1甲醇：液相色譜級(jí)。 3.2乙腈：液相色譜級(jí)。 3.3丙酮：液相色譜級(jí)。 3.4正丙醇：液相色譜級(jí)。 3.5 正己烷：液相色譜級(jí)。 3.6 乙酸乙酯：液相色譜級(jí)。 3.7 乙醚。 3.8 乙酸鈉。 3.9 乙酸銨。 3.10 俟葡萄糖醛酸苷酶：約40000活性單位。 3.11 乙腈飽和正己烷：取200 mL正己烷于250 mL分液漏斗中，加人少 量乙腈(3.2)，劇烈振搖，靜置分層后，棄去下層乙腈層即得。 3.12 丙酮一正

27、己烷(1+9):丙酮、正己烷按體積比1 : 9混勻。 3.13 丙酮一正己烷(6+4):丙酮、正己烷按體積比6: 4混勻。 3.14 乙酸乙酯一乙醚(75+25) : 75 mL乙酸乙酯與25 mL乙醚溶液混勻。 3.15 乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L):稱(chēng)取乙酸鈉13.6 g于1000 mL容量瓶 中，加人980 mL水溶解并混勻，用乙酸調(diào)pH到5.0，定容至刻度混勻。 3.16 乙酸銨溶液(10 mmol/L):稱(chēng)取乙酸銨0.77 g于1000 mL容量瓶中， 用水定容至刻度混勻 3.17 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度99.0%。 3.18 氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）

28、物質(zhì)：純度 99.9% 3.19 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確到0.1 mg），用乙腈配成500舊/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4 C避光 保存可使用6個(gè)月）。 3.20 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別準(zhǔn)確移取適量的 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈稀釋成50他/mL的氯霉 素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4C避光保存可使用3個(gè)月）。 3.21 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液： 分別準(zhǔn)確移取適 量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液， 用流動(dòng)相稀釋成合適的混合 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。 3.22

29、 氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的氯霉素 -D5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確到0.1 mg），用乙腈配成100 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4 C避光 保存可使用12個(gè)月）。 3.23 氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）中間溶液：準(zhǔn)確移取適量的氯霉素 -D5 儲(chǔ)備溶液（3.22），用乙腈配成1血/mL內(nèi)標(biāo)中間溶液（4 C避光保存可使用6個(gè) 月）。 3.24 氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）工作溶液：準(zhǔn)確移取適量的氯霉素-D5 中間溶液（3.23），用乙腈配成0.1 pg/mL內(nèi)標(biāo)工作溶液（4 C避光保存可使用2周）。 4 儀器和耗材 4.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。 4.2高速

30、組織搗碎機(jī) 4.3均質(zhì)器。 4.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 4.5 分析天平。 4.6 移液槍?zhuān)?00丄、1 mL。 4.7 心形瓶：100 mL，棕色。 4 8 分液漏斗：200 mL。 4.9 聚四氟乙烯離心管：50 mL 。 4.10 離心機(jī)。 4.11 渦旋混合器。 4.12 固相萃取裝置。 4.13 硅膠固相萃取柱或相當(dāng)者： 200 mg ， 3 mL。 4.14 EN固相萃取柱或相當(dāng)者： 200 mg ，3 mL。 4.15 一次性注射式濾器：配有 0.45 阿 微孔濾膜。 5 操作步驟 5.1 試樣制備 從原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻搗碎或混勻， 用四分法縮分出適量

31、試樣，均分成兩份，裝人清潔容器內(nèi)，加封后作出標(biāo)記，一 份作為試樣，一份作為留樣。試樣應(yīng)在-20 C條件下保存。 5.2提取 5.2.1動(dòng)物組織（肝、腎除外）與水產(chǎn)品 稱(chēng)取試樣5 g（精確至O.OIg），置于50 mL離心管中，加人100此氯霉素 氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）工作溶液和30 mL乙腈，勻漿，離心5 min。將上清液移 人250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈飽和的正己烷，振蕩5 min，靜置分層, 轉(zhuǎn)移乙腈層至100 mL棕色心形瓶中。殘?jiān)性偌尤?30 mL乙腈，振搖3 min , 離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至同一分液漏斗，振蕩 5 min，靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈 層至同一棕色心形

32、瓶中。向心形瓶中加人 5 mL正丙醇，于40 C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)近干，用氮?dú)獯蹈桑? mL丙酮-正己烷(3.12)溶解殘?jiān)?5.2.2動(dòng)物肝、腎組織 稱(chēng)取試樣5g(精確至0.01g)，置于50 mL離心管中，加人30 mL乙酸鈉緩 沖液(3.15)，均質(zhì)2 min，加人300丄伕葡萄糖醛酸苷酶(3.10)，于37 C溫育過(guò) 夜。消解樣品中加人100此氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-D5)工作溶液(3.24) , 20 mL 乙酸乙酯-乙醚(3.14)，振搖2 min，離心5 min。取上層有機(jī)層入心形瓶中，在 40 C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用氮?dú)獯蹈桑? mL丙酮-正己烷(3.12)溶解殘?jiān)?5

33、.2.3蜂蜜 稱(chēng)取蜂蜜試樣5 g(精確至0.01g)，置于50 mL離心管中，加人100讓氯霉 素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-D 5)工作溶液(3.24) , 5 mL水，混勻，再加人20 mL乙酸乙 酯，振搖2 min，離心5 min，移取有機(jī)層到100 mL棕色心形瓶中，于離心管 中再加人20 mL乙酸乙酯，振搖2 min，離心5 min，合并有機(jī)層于棕色心形 瓶中，40 C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，3 mL水溶解殘?jiān)?，混勻?5.3 凈化 5.3.1動(dòng)物組織與水產(chǎn)品 用5 mL丙酮-正己烷(3.12)淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將殘?jiān)芙?溶液(5.1.1、5.1.2)轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱上，棄去

34、流出液，用5 ml.丙酮-正己烷 (3.13)洗脫，收集洗脫液于心形瓶中，40 C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈桑?用1 mL水定容，定容液過(guò)0.45 口濾膜至進(jìn)樣瓶，待測(cè)定。 5.3.2蜂蜜 分別用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取柱，將提取液（5.2.3）轉(zhuǎn)移上 柱，用5 mL水淋滌，用玻璃棒壓干1 min，用3 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液用 氮?dú)獯蹈?，? mL水定容，定容液通過(guò)0. 45阿濾膜至進(jìn)樣瓶，待測(cè)定。 5.4液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定 5.4.1液相色譜條件 5.4.1.1 色譜柱：Zorbax SB-C 18， 5 pm，2. 1 mm X150 mm，或與之相 5.4.

35、1.2 流動(dòng)相：水-乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序參見(jiàn)表 表1梯度洗脫程序 時(shí)間/min 水/% 乙腈/% 10 mmol/L 乙酸銨溶液 /% 0.00 20 25 5 2.00 25 70 5 3.00 25 70 5 8.00 70 25 5 5.4.1.3 流速：0. 6 mL/min ; 5.4.1.4 進(jìn)樣量：20此； 5.4.1.5 柱溫：40 C。 5.4.2質(zhì)譜/質(zhì)譜參考條件 542.1 離子源：電噴霧離子源； 542.2 掃描方式：負(fù)離子掃描； 542.3 檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）; 542.4 電噴霧電壓：-4.5kV; 5.4.2.5 霧化氣壓

36、力：0.276 MPa; 5.4.2.6 氣簾氣壓力：0.172 MPa; 5.4.2.7 輔助氣流速：0.206 MPa; 5.4.2.8 離子源溫度：550 C ; 5.4.2.9 定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量 氯霉素、甲硯霉素和氟甲硯霉素的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量見(jiàn) 表2，標(biāo)準(zhǔn)總離子流圖見(jiàn)圖1 o 表2氯霉素、甲硯霉素和氟甲硯霉素的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量 藥物名稱(chēng) 定性離子對(duì)（m/z） （母離子/子離子） 疋量離子對(duì)（m/z） （母離子/子離子 碰撞氣能 /eV 氯霉素 321.0/152.0 321.0/152.0 -25 321.0/257.0 -16 甲

37、砜霉素 353.9/289.9 353.9/289.9 -18 353.9/184.9 -28 氟甲砜霉素 356.0/336.0 356.0/336.0 -15 356.0/184.9 -27 氯霉素-D5 326.1/357.0 326.1/157.0 -25 326.1/262.0 -17 圖1氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素總離子流圖 6 計(jì)算 試樣中目標(biāo)化合物殘留量使用儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或氯霉素殘留量按式(1)計(jì) 算，甲砜霉素和氟甲砜霉素按式(2)計(jì)算: c ci AAsiV Cs汽A漢AW 1000 1000 (1) X=c A V 100 AW1000 式中 X試樣中待測(cè)組分殘留量，單

38、位為微克每千克(舊/kg); c標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)； csi標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)； c樣液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL); As標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積； A 樣液中待測(cè)目標(biāo)物的峰面積； Asi 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積； Ai樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積； V試樣定容體積，單位為毫升（mL）; W 樣品稱(chēng)樣量，單位為克（g）。 注：計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。 7 精密度 本方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 6.4%14.7%。 8 說(shuō)明 8.1如同時(shí)測(cè)定氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，由于三者之間極性差異, 建議甲砜霉素和氟甲砜霉素采

39、用工作曲線(xiàn)外標(biāo)法測(cè)定。 8.2 如僅測(cè)定蜂蜜中氯霉素，凈化柱也可采用HLB柱（60mg , 3mL ）。 5蛋類(lèi)中氯霉素的測(cè)定酶聯(lián)免疫方法 1適用范圍 本方法適用于蛋類(lèi)中氯霉素的測(cè)定。 2原理 試劑盒提供的微孔板上的微孔預(yù)包被了氯霉素抗體。標(biāo)準(zhǔn)品中的氯霉素即抗 原和樣品中的抗原分別與酶標(biāo)記結(jié)合物（酶標(biāo)記抗原）同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)包被抗體上的有 限結(jié)合位點(diǎn)，形成抗體/抗原、抗體/酶標(biāo)記抗原復(fù)合物。室溫孵育，使競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng) 完全。洗滌酶標(biāo)板，除去游離的反應(yīng)物。加入底物，在室溫下，酶標(biāo)記結(jié)合物上 的辣根過(guò)氧化物酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，孵育一定時(shí)間使顏色發(fā)生最大變化。 加入終止液使反應(yīng)終止，同時(shí)反應(yīng)物顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)黃。顏

40、色的深度與標(biāo)準(zhǔn)品/樣品 中的氯霉素含量成反比，使用酶標(biāo)儀在 450 n m 波長(zhǎng)下讀取相應(yīng)的吸光度值。 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品中氯霉素濃度。 3試劑 3.1氯霉素檢測(cè)試劑盒 3.1.1微孔板 3.1.2稀釋/洗滌緩沖液（濃縮）：用970mL雙蒸水稀釋一整瓶洗滌緩沖液 后方可使用。稀釋后，+2 C - +8 C可保存30天。 3.1.3酶標(biāo)記結(jié)合物（濃縮）：試劑盒以濃縮液形式提供酶標(biāo)記結(jié)合物，必 須用已稀釋的稀釋/洗滌緩沖液稀釋至工作液濃度后方可使用。具體稀釋方法請(qǐng) 參照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)” CONJUGATE DILUTION ” .需要多少制備多少，現(xiàn) 用現(xiàn)配。以35000稀釋為例，稀釋方法

41、如下： 稀釋方法：將酶標(biāo)記結(jié)合物（濃縮）1:35000稀釋于已稀釋的稀釋/洗滌緩 沖液中，因稀釋比例很大，所以需要進(jìn)行二步稀釋。第一步：取20此酶標(biāo)記結(jié) 合物（濃縮）至新的離心管中，再加入 2000此已稀釋的稀釋/洗滌緩沖液，混 勻；第二步：取20此第一步稀釋獲得混合液至新的離心管中，再加入 7 mL已 稀釋的稀釋/洗滌緩沖液，混勻。這是足夠32孔的用量。如需更大體積，重復(fù)上 述稀釋步驟。 稀釋后的酶標(biāo)記結(jié)合物應(yīng)立即使用，剩余的酶標(biāo)記結(jié)合物（濃縮）應(yīng)在+2 C -+8 C避光下保存。 3.1.4組織提取緩沖液：將組織提取緩沖液 （濃縮）1 : 400稀釋于已稀釋的 稀釋/洗滌緩沖液中，如取0.

42、05 mL濃縮物加20 mL已稀釋的稀釋/洗滌緩沖液。 稀釋后的提取緩沖液應(yīng)立即使用。 3.1.5底物 3.1.6牛奶緩沖液 3.1.7標(biāo)準(zhǔn)品 3.1.8 高標(biāo) 100ng/ml 3.1.9終止液 3.2甲基叔丁基醚，HPLC級(jí) 3.3異辛烷，分析純 3.4氯仿，分析純 4儀器與耗材 4.1裝載450nm濾光片的酶標(biāo)儀，推薦同時(shí)裝載 630nm參考濾光片； 4.2 37 T水浴鍋/孵育器； 4.3移液器及吸頭：10 uL -125 uL ; 4.4密圭寸膜或微孔板密圭寸蓋 4.5離心機(jī) 5操作步驟 5.2樣品制備 5.1.1稱(chēng)取2g蛋液至玻璃試管，加入2mL甲基叔丁基醚，渦旋3分鐘。 5.1.

43、2 2000rpm 離心 15 分鐘。 5.1.3移取1mL上層相到干凈的玻璃試管中，將試管置于氮吹儀，70 C, 蒸發(fā)干燥。 5.1.4加入2mL異辛烷/氯仿（2: 3）溶解殘留物，渦旋1分鐘。 5.1.5加入0.4mL稀釋的組織提取緩沖液溶解殘留物，渦旋2分鐘。 5.1.6 2000rpm 離心15分鐘。上層相即為制備好的樣品，這就是制備好的 樣品，可直接用于Elisa檢測(cè)。 5.2測(cè)定 5.2.1將足夠標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。 5.2.2加入25ul的標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做 兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，然后

44、加入100ul酶標(biāo)記結(jié)合物到每個(gè)微孔，充分混合。用密封 膜或微孔板密封蓋將微孔板密封，將其置于室溫下（19 C25 C）黑暗孵育1 小時(shí)。 5.3.3翻轉(zhuǎn)輕拍微孔板，將微孔內(nèi)液體倒出。在10-15分鐘內(nèi)用稀釋的洗滌 /緩沖液洗滌酶標(biāo)板6次（洗滌中要確保所有的孔均注滿(mǎn)洗滌緩沖液），最后一 次洗滌完成后，將酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)置于吸水紙巾上并輕拍以去除殘液， 直至徹底干燥 534干燥后，立即用8通道移液器向每一個(gè)微孔移取125此底物溶液。完 成后，從一端至另一端輕拍微孔板，19 C至25 C黑暗孵育20 分鐘。 5.3.5每個(gè)孔加入100讓終止液終止反應(yīng)，反應(yīng)物的顏色會(huì)由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃 色。 536于10分鐘內(nèi)

45、，用450nm的酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。如果有必要，可以 采用630nm參考波長(zhǎng)。 6. 計(jì)算 分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光值。 以吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度 的對(duì)數(shù)值（Iog10）為橫坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。也可使用數(shù)據(jù)處理軟件 從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀取樣品的濃度，由于樣品制備過(guò)程中被不同程度的稀釋?zhuān)?此從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出的濃度需乘以稀釋系數(shù) 0.4才為樣品實(shí)際濃度。 7. 說(shuō)明 7.5本產(chǎn)品僅用于體外診斷，不要用口移取溶液。 7.6請(qǐng)?jiān)谡?guī)的實(shí)驗(yàn)室中，由受過(guò)相關(guān)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作，并遵守實(shí)驗(yàn)室 操作守則。 7.7洗滌緩沖液中含有防腐劑，請(qǐng)勿食用或與皮膚、粘膜接觸。 7.8溫度低于20 C或試劑及標(biāo)準(zhǔn)

46、品沒(méi)有回到室溫（15-25 C）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 值偏低。 7.5洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重 復(fù)性不好的現(xiàn)象，所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 7.10 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，最好避免直接暴露在光線(xiàn)下。 7.11 混合要均勻，洗板要徹底（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合 均勻）。 7.12 反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 7.13 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的 試劑盒這樣會(huì)引起靈敏度降低。 6水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 1適用范圍 -串聯(lián)質(zhì)譜測(cè) 本程序適用于水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物

47、殘留量的液相色譜 定。 本方法四種硝基呋喃代謝物衍生產(chǎn)物的檢出限為 0.5卩g/kg，定量限為1.5 卩 g/kg 。 2原理 試樣中殘留的硝基呋喃類(lèi)代謝物在酸性條件下用 2-硝基苯甲醛衍生化，用 -串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧離子化檢 OasisHLB或性能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈鶅艋?。液相色譜 測(cè)，用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)法定量。 3試劑 除特別注明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為色譜純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的 一級(jí)水。 3.1甲醇。 3.2乙腈。 3.3乙酸乙酯。 3.4甲酸。 3.5乙酸銨。 3.6濃鹽酸：分析純。 3.7 稀鹽酸：0.2 mol/L，量取17 ml濃鹽酸（3.6）用水定容至1000 ml。 3.

48、8氫氧化鈉：分析純。 3.9氫氧化鈉溶液：1 mol/L ，稱(chēng)取40 g氫氧化鈉，用水溶解，定容至1000 ml ； 0.2 mol/L，取100ml 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，用水稀釋至 500 ml。 3.10甲醇水溶液（1+1，體積比）：取50 ml甲醇和50 ml水混合。 3.11 標(biāo)準(zhǔn)品 3.11.1四種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：呋喃它酮代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基 -2-噁唑烷基酮（3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone，縮寫(xiě)為 AMOZ ）、呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone ，

49、縮寫(xiě)為AOZ ）、呋喃西林代謝物氨基脲（semicarbazide，縮寫(xiě)為SEM ）、呋喃 妥因代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin ，縮寫(xiě)為AHD ），四種標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)純度均為9%。 3.11.2四種硝基呋喃代謝物內(nèi)標(biāo)物：D5-AMOZ、D4-AOZ、13C15N-SEM、 13C3-AHD，四種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度均 為9%。 3.11.3四種硝基呋喃代謝物衍生產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：2-NP-AMOZ、2-NP-AOZ、 2-NP-SEM、2-NP-AHD ，四種硝基呋喃代謝物衍生產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度均為9%。 3.11.4四種硝基呋喃代謝物衍生產(chǎn)物內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：2-NP-D5-AM

50、OZ 、 2-NP-D4-AOZ、2-NP-13C15N-SEM、2-NP-13C3-AHD ，四種硝基呋喃代謝 物衍生產(chǎn)物內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度均為9%。 3.11.5 衍生劑：含 0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛（2-Nitrobenzaldehyde ，縮 寫(xiě)為2-NBA ）的乙腈溶液；稱(chēng)取2-硝基苯甲醛0.151 g溶于10 ml乙腈，現(xiàn)用 現(xiàn)配。 3.12流動(dòng)相A :含濃度為5mmol/L乙酸銨的0.01%甲酸水溶液：精確量 取甲酸1 ml加水稀釋至1000 ml，再加入0.385 g乙酸銨制成。 3.13標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取適量硝基呋喃代謝物衍生產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于乙腈配置成標(biāo)準(zhǔn)貯備

51、液，用甲醇一水溶液（3.10）配制成0.5他/L、1他/L、5血/L、8他/L、10 pg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，并加入各種衍生產(chǎn)物內(nèi)標(biāo)液，使內(nèi)標(biāo)物濃度為5 pg/L， 依次進(jìn)行測(cè)定，以得到的峰面積比為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)， 繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 4儀器與耗材 4.1超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）; 4.2 高速冷凍離心機(jī)（10 000 r/min ）; 4.3pH 計(jì)； 4.4電子天平感量0.01 g和0.0001 g; 4.5超聲波清洗儀； 4.6氮?dú)獯蹈蓛x； 4.7搖床； 4.8恒溫烘箱； 4.9旋渦混合器； 4.10組織勻漿機(jī)； 4.11固相萃取裝

52、置； 4.12 Oasis HLB 固相萃取柱或相當(dāng)固相萃取柱：60 mg/3ml ;使用前分別 以3 ml甲醇，3 ml水進(jìn)行活化； 4.13微孔濾膜：0.22 m。 5操作步驟 5.1樣品的制備 取樣品的可食用部分用組織勻漿機(jī)絞碎，分出500g作為試樣，試樣置于 -18 C冰柜，避光冷凍存放。 5.2衍生化 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g樣品于50 ml具塞塑料離心管中，依次加入 50 pl混合內(nèi)標(biāo) 工作液(100 ng/ml )，10 ml HCl溶液，200 p衍生劑2-NBA溶液，震蕩30min 后，將離心管置于37 C恒溫箱中放置過(guò)夜(約16h )。 5.3提取 從恒溫箱中取出離心管并冷卻至室

53、溫，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH 值，使其pH = 7.27.4。再以10000 r/min的速度，在4 C下離心10 min， 取上清液進(jìn)行固相萃取凈化。 5.4凈化 將提取液以2 ml/min-3 ml/min 的速度通過(guò)預(yù)先活化過(guò)的 Oasis HLB固相 萃取柱，再用5 ml超純水淋洗小柱后，將小柱減壓抽干。用 5 ml乙酸乙酯洗 脫小柱，洗脫液在氮?dú)饬飨麓蹈?，用甲?水溶液定容，過(guò) 0.22 pm微孔濾膜 后待上機(jī)測(cè)定。 5.5測(cè)定 5.5.1液相色譜條件 a）色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18 柱，2.1 mm （內(nèi)徑）X100 mm , 粒徑1.7 pm，或相

54、當(dāng)者。 b）流動(dòng)相：A，含5mmol乙酸銨的0.1%甲酸水溶液；B，乙腈； c）進(jìn)樣量：10山 d）柱溫：40 C。 液相色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表1 表1液相色譜梯度洗脫程序 時(shí)間（min ） 流速（ml/min )A B 0 0.3 90% 10% 4 0.3 10% 90% 5 0.3 10% 90% 5.1 0.3 90% 10% 7 0.3 90% 10% 5.5.2質(zhì)譜條件 a）電離源：點(diǎn)噴霧正離子模式; b）毛細(xì)管電壓：3.5 kV ； c）源溫度：120 C； d）脫溶劑氣溫度：450 C； e）脫溶劑氣流量：700 L/h ； f)碰撞室壓力：0.35Pa ( 3.510-3 mb

55、ar )； 硝基呋喃代謝物衍生產(chǎn)物及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)及錐孔 電壓、碰撞能量見(jiàn)表2。 表2目標(biāo)物保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量 目標(biāo)物 保留時(shí)間 (min) 定性離子對(duì) (m/z) 定量離子對(duì) (m/z) 錐孔電壓 (V) 碰撞能量 (eV) 334.8261.9 15 2-NP-AMOZ 1.35 334.8290.9 25 334.8290.9 10 209.0165.8 10 2-NP-SEM 1.71 209.0165.8 25 209.0192.0 13 249.0103.5 20 2-NP-AHD 1.73 249.0133.8 27 249.013

56、3.8 10 236.0103.3 20 2-NP-AOZ 1.91 236.0133.6 30 236.0133.6 10 340.1264.9 20 2-NP-D 5-AMOZ 1.35 340.1296.0 25 340.1296.0 12 211.8167.6 10 2-NP- 13C15N-SEM 1.71 211.8167.6 25 211.8194.6 12 251.8133.6 13 2-NP- 13C3-AHD 1.73 315.597.0 25 251.8178.6 18 239.7103.5 20 2-NP-D 4-AOZ 1.91 239.7133.5 30 239.7

57、133.5 15 5.6 定性方法 各測(cè)定目標(biāo)化合物的定性以保留時(shí)間和兩對(duì)離子（特征離子對(duì)/定量離子對(duì)） 所對(duì)應(yīng)的LC-MS/MS色譜峰相對(duì)豐度進(jìn)行。要求被測(cè)試樣中目標(biāo)化合物的保留 時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)化合物的保留時(shí)間一致，同時(shí)被測(cè)試樣中目標(biāo)化合物的 兩對(duì)離子對(duì)應(yīng)的LC-MS/MS色譜峰相對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物色譜峰 豐度比一致，允許的偏差見(jiàn)表3。 表3定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差 相對(duì)離子豐度 50% 20% 50% 至 10% 20% 至 10% 允許的相對(duì)偏差 20% 25% 30% 50% 5.7定量方法 本實(shí)驗(yàn)采用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法定量。 每次測(cè)定前配制標(biāo)準(zhǔn)系列，按濃

58、度從小到大的順序，依次上機(jī)測(cè)定，得到的 目標(biāo)化合物濃度與峰面積比的工作曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的 LC-MS/MS 多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM ）色譜圖參見(jiàn)圖1。 5.8 空白試驗(yàn) 除不加試料外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。 5.9色譜圖 Nitrofuran - STD-1m H-Snml 23101014-7 1C0 丄dCranrrei m試樣的質(zhì)量，單位為克（g ）。 7精密度 本方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于10%。 8說(shuō)明 8.1衍生劑可以適當(dāng)過(guò)量添加，以保證目標(biāo)物完全被反應(yīng)。 8.2若無(wú)恒溫震蕩裝置，可在恒溫過(guò)夜前將離心管充分震蕩、渦旋，使內(nèi) 標(biāo)物和衍生劑與樣品充分混勻。 8.3 調(diào)節(jié)混合液的p

59、H時(shí)，要保證樣品已完全冷卻至室溫，否則顯示的pH 值將不準(zhǔn)確。 8.4為避免離心后的上清液中懸浮物過(guò)多而堵塞固相萃取柱，可在離心前 將樣品稍加冷凍，或在上清液過(guò)小柱之前將其過(guò)濾。 8.5固相萃取柱要完全抽干，否則有影響乙酸乙酯的洗脫和上機(jī)測(cè)定；當(dāng) 固相萃取柱內(nèi)填料已明顯松散流動(dòng)，可視為已經(jīng)抽干。 8.6本方法采用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法定量，每次測(cè)定前配制標(biāo)準(zhǔn)系列，按濃 度從小到大的順序，依次上機(jī)測(cè)定，得到的目標(biāo)化合物濃度與峰面積比的工作曲 線(xiàn)。 7動(dòng)物源性食品中硝基呋喃代謝物殘留量液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn) 操作程序 1適用范圍 3.4 二甲亞砜(DMSO )。 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬肉、牛肉、雞肉和水

60、產(chǎn)品(魚(yú)類(lèi)、蝦蟹和貝類(lèi))中呋喃它酮 (furaltadone )的代謝產(chǎn)物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮 (3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone, AMOZ)、呋喃西林 (nitrofurazom )的代謝產(chǎn)物氨基脲(semicarbazide, SEM )、呋喃妥因 (nitrofurantoin )的代謝產(chǎn)物 1-氨基-2-內(nèi)酰脲(1-aminohydantoin, AHD ) 和呋喃唑酮(furazolidone )的代謝產(chǎn)物3-氨基-2-惡唑烷基酮 (3-ami no-2-0 xazolidi none, AOZ)殘留量的測(cè)定方法