蛋白質分離純化步驟

1、大多數(shù)蛋白質在組織細胞中都是和核酸等生物分子結合在一起，而且每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質。許多蛋白質在結構、性質上有許多相似之處，所以蛋白質的別離提純是一項復雜的工作。到目前為止，還沒有一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質從復雜的混合物中提取出來。但是對于任何一種蛋白質都有可能選擇一種較適宜的別離純化 程序以獲得高純度的制品。且別離的關鍵步驟、根本手段還是共同的。蛋白質提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量，同時又要保持和提高產(chǎn)品的生物活性。因此，要別離純化某一種蛋白質，首先應選擇一種含目的蛋白質較豐富的材料。其次，應設法防止蛋白質變性， 以制備有活性的蛋白質。 對于大多數(shù)蛋白質來說， 純

2、化操作都是在 04C的低溫下進行的。 同時也應防止過酸、 過堿的條件以及劇烈的攪拌和振蕩。 另外，還 要設法除去變性的蛋白質和其它雜蛋白，從而到達增加純度和提高產(chǎn)量的目的。二、別離純化蛋白質的一般程序 別離純化蛋白質的一般程序可分為以下幾個步驟：一材 料 的 預 處 理 及 細 胞 破 碎 別離提純某一種蛋白質時， 首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的 天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：1 .機 械 破 碎 法這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設備有,高速組織搗碎機、研缽等滲 透 破 碎 法這種方法是在低滲條件使細

3、胞溶脹而破碎反 復 凍 融 法生物組織經(jīng)凍結后，細胞內(nèi)液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度 變化敏感的蛋 白質不宜采用 此法。4.超 聲 波 法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等 。二蛋白質的抽提通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據(jù)欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要參加外表活性劑十二烷基磺酸鈉、trit on X-100 等，使膜結構破壞，利于蛋白質與膜別離。在抽提過程中，應注意溫度，防止劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。 三蛋 白

4、 質 粗 制 品 的 獲 得選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|與其它雜蛋白別離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質溶解度的差異進行的別離。常用的有以下幾種方法：1 .等 電 點 沉 淀 法不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互別離。2 .鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。3 .有 機 溶 劑 沉 淀 法中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質外表的水化層，促使

5、蛋白質分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下 操作，選擇合 適的有機溶劑濃度。四 樣 品 的 進 一 步 分 離 純 化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。1.凝 膠 過 濾 層 析凝膠過濾層析gel-filtrati on chromatography又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠Sephadex 裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具 有網(wǎng)狀

6、結構，不同類型凝膠的網(wǎng)孔大小不同。 當把蛋白質混合樣品加到凝膠柱中時， 比凝膠 網(wǎng)孔小的蛋白質可進入網(wǎng)孔內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子那么不能進入被排阻在凝膠顆粒之外。當用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質直接通過凝膠之間的縫隙先被洗脫下來，而比網(wǎng)孔小的蛋白質可連續(xù)不斷地進入網(wǎng)孔內(nèi)。這樣的小分子不但流經(jīng)的路程長，而且受到來自凝膠內(nèi)部的阻力也很大，所以蛋白質越小，從柱子上洗脫下來所需時間越長。 由于不同蛋白質的分子大小不同，進入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積及時間不同， 從而達到分離的目的。2 .纖 維 素 柱 層 析 法該法是利用蛋白質的酸堿性質作為別離的根底。離子交換纖維素cel

7、luloseion-exchanger 是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網(wǎng)狀結構，有較大的表 面積，使蛋白質大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質的別離。1 羧甲基纖維素 CM -纖維素在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH條件下，羧甲基上的質子可解離下來圖2-27a ，而溶液中帶正電荷的蛋白質分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結合。可 交換的基團帶正電，因此是一種陽離子交換劑。蛋白質與離子交換纖維素之間結合能力的大小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。2 二乙氨基乙基纖維素 DEAE -纖維素在中性pH條件下，它含有帶正電荷的基團，可與溶液中的帶負電荷的蛋白質結合，可交換的基團

8、帶負電荷，因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質混合溶液通過裝有DEAE-纖維素的層析柱時，帶正電荷的蛋白質不能結合而隨著洗脫液的流動先被洗脫下來。帶負電荷的蛋白質將被結合到柱上。結合力取決于彼此相反電荷基團間的靜電吸引。然后選用一定pH和離子強度的緩沖液進行洗脫，改變蛋白質分子所帶的靜電荷，依次從層析柱流出到達 相互分離的目的。3 .親和層析親和層析affinity-chromatography別離技術是根據(jù)許多蛋白質對特定的化學基團具有專一性結合的原理。這些能被生物大分子如蛋白質所識別并與之結合的基團稱為 配基或配體ligand 。親和層析是一種極有效的別離純化蛋白質的方法。例如酶對它的底

9、物具有特殊的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白A concanavalin A的別離純化為例，由于該蛋白對葡萄糖有專一性親和吸附，因此可把葡萄糖通過適當?shù)幕瘜W反響共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體外表上。為了防止載體外表的空間位阻影響待別離的蛋白質大分子與其配基的結合，在配基和載體之間往往插入一段所謂的連接臂或稱為間隔臂，s p a c e r a r m， 使配體與載體之間保持足夠的距離。將這種多糖顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱。當含有伴刀豆球蛋白的提取液加到層析柱的上部，并沿柱向下流過時，待純化的蛋白質與其特異性配基結合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結

10、合將通過柱子而流出圖2-28a 。然后采用一定的洗脫條件，如濃的葡萄糖溶液進行洗脫，即可把該蛋白質洗脫下來，到達與其它蛋白質分離的目的。三、蛋白 質 分 子 量的 測定蛋白質分子量測定的方法很多，目前常用的方法有以下幾種。一凝膠過濾法凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理如“別離純化方法中所述。一定型號的凝膠顆粒上具有一定大小的孔隙，只允許較小的分子進入膠粒，而大于孔隙的分子那么不能進入膠粒而被排阻在膠粒外面。用洗脫液洗脫時，被排阻的分子量大的蛋白質先被洗脫下來，隨后能夠進入顆粒的蛋白質也按分子量大小而先后被洗脫下來，分子量越小的越后被洗脫下 來。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范

11、圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關系。因此，用幾種分子量的蛋白質為標準進行層析分析， 以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標準洗脫曲線。 未知蛋白質在同樣的條件下進行層析分析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量來。二SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量蛋白質在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質分子大小、所帶電荷的量以及分子形狀。而 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中參加了 十二烷基硫酸鈉sodium dodecyl sulfate,SDS 。SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質 變性并解離成

12、亞基。當?shù)鞍踪|樣品中參加SDS般參加量為 0.1 %后，SDS與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上大量的負電荷，這些電荷量遠遠超過蛋白質分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質之間的電荷差異。所有結合SDS的蛋白質-SDS復合物的形狀近似于長的橢園棒，它們的短軸是恒定的，而長軸與蛋白質分子量的大小成正比。這樣， 消除了蛋白質之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質分子量的大小。進行凝膠電泳時，常常用一種染料作前沿物質，蛋白質分子在電泳中的移動距離和前沿物質移動的距離之比值稱為相對遷移率,相對遷移率和分子質量的對數(shù)成直線關系。標準蛋白質分子質量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標準曲線。

13、將未知蛋白質在同樣條件下電泳，根據(jù)測得的樣品相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子量。三沉降法沉降法又稱超速離心法。蛋白質溶液在受到強大的離心力作用時，蛋白質分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質分子的大小、密度和分子形狀有關，也與溶劑的密度和粘度有關。蛋白質顆粒在離心場中的沉降速度用每單位時間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示。在離心場中，蛋白質分子所受到的凈離心力離心力減去浮力 與溶劑的摩擦力平衡時，每單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數(shù)Sedime ntation Coefficie nt 。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位，用 S表示，以紀念超速離心法的創(chuàng)始人，瑞 典著名的蛋白質化學家 T

14、.Svedberg 。一個Svedberg單位或直接稱一個 S為1 x 10 13s。 蛋白質的沉降系數(shù)大約在1 x 1 0 1 3200 x 1 0 1 3s范圍內(nèi)，即1S200S。蛋白質別離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：一材料的預處理及細胞破碎別離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放岀來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失 活性。所以要采用適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：1. 機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。2. 滲透破碎法這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。3. 反復凍融法生物組織經(jīng)凍

15、結后，細胞內(nèi)液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化 敏感的蛋白質不宜采用此法。4. 超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。5. 酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。二蛋白質的抽提通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質提取岀來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據(jù)欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要參加外表活性劑十二烷 基磺酸鈉、tritonX-100 等，使膜結構破壞，利于蛋白質與膜別離。在抽提過程中，應注意溫度，防止 劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。三蛋白質粗制品的獲得選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|與其它雜蛋白別離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質溶解度的 差異進行的別離。常用的有以下幾種方法：1. 等電點沉淀法不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互別離。2. 鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下 來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。3. 有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多