天然產(chǎn)物提取液中蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)的去除試驗(yàn)畢業(yè)論文

1、天然產(chǎn)物提取液中蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)的去除試驗(yàn)remove test of protein and fat and other impurities from natural product extraction目錄摘要iabstractii引 言1第一章緒論21.1天然產(chǎn)物的介紹21.2我國(guó)天然產(chǎn)物的研究和應(yīng)用現(xiàn)狀21.2.1天然產(chǎn)物的研究方法21.2.2天然產(chǎn)物的提取方法21.2.3我國(guó)天然產(chǎn)物的應(yīng)用現(xiàn)狀51.2.4天然產(chǎn)物的發(fā)展前景51.2.5我國(guó)天然產(chǎn)物的發(fā)展方針61.3天然產(chǎn)物提取液的精制方法71.3.1蛋白質(zhì)分離純化方法81.3.2冷凍脫脂的原理及影響因素111.4高速離心分離技術(shù)1

2、21.4.1離心分離簡(jiǎn)介121.4.2離心分離的基本原理121.4.3常用離心方法13第二章實(shí)驗(yàn)部分142.1實(shí)驗(yàn)材料142.2儀器和試劑142.2.1實(shí)驗(yàn)儀器142.2.2主要試劑142.3分析方法142.4實(shí)驗(yàn)方法142.4.1粗提取液純化142.5提取液的高效液相色譜分析15第三章 結(jié)果與討論163.1溫度控制條件的確定163.2除雜前提取液吸收光譜的測(cè)定193.3提取液處理前后的紫外光譜分析223.4提取液的高效液相色譜譜圖分析243.5除雜前后對(duì)有機(jī)玻璃的上色效果27結(jié) 論29致 謝30參考文獻(xiàn)31天然產(chǎn)物提取液中蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)的去除試驗(yàn)摘要：利用蛋白質(zhì)分子的熱變性和低溫脫脂原理

3、對(duì)迎春花和連翹花提取液進(jìn)行處理，根據(jù)提取液處理前后的紫外吸收光譜和高效液相色譜的不同以及對(duì)有機(jī)玻璃上色效果的對(duì)比；考察了除雜效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)天然產(chǎn)物提取液進(jìn)行冷凍、加熱、離心處理能夠有效除去提取液中的蛋白質(zhì)和脂肪等大分子雜質(zhì)。除雜的條件是，3 6小時(shí)，45 60分鐘，2000轉(zhuǎn)/分 離心15分鐘。關(guān)鍵詞：天然產(chǎn)物；加熱；冷凍；除雜remove test of protein and fat and other impurities from natural product extractionabstract：the extraction of jasmine and forsythia

4、flower was treated by using protein molecule thermal denaturation and the principle of low temperature defatted, the effect of removing impurities was studied by the difference of the uv absorption spectroscopy between the untreated extraction and treated extraction and by the difference of high per

5、formance liquid chromatography (hplc) between the untreated extraction and treated extraction ,and also by the effect contrast of dyeing the organic glass. the experimental results show that the protein and fat and other macromolecule impurities in natural product extraction can be effectively remov

6、ed by being frozen, heated and centrifugally separated. the conditions of removing impurity are 3 for six hours, 45 for one hour, 2000 r/min for fifteen minutes.key word：natural products; heating; freezing; impurity引 言天然產(chǎn)物廣泛存在于多種生物特別是動(dòng)植物體中，其安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有的兼有一定的藥理作用。開(kāi)發(fā)天然產(chǎn)物是世界食用色素業(yè)和醫(yī)藥等行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)之一，以天然產(chǎn)物為主的保

7、健品和藥物等具有相當(dāng)大的市場(chǎng)前景，但由于天然產(chǎn)物分離純化困難，很難達(dá)到和國(guó)際接軌的要求，因此解決天然產(chǎn)物研究中樣品分離純化的難題，得到除雜后的精制產(chǎn)品會(huì)使天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用具有更加廣闊的前景，同時(shí)開(kāi)發(fā)高效的天然產(chǎn)物的除雜方法對(duì)徹底改變中國(guó)天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)層次低，生產(chǎn)方式粗放，技術(shù)落后有重要作用，對(duì)中國(guó)天然產(chǎn)物利用現(xiàn)狀的轉(zhuǎn)型與提升具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，得出除雜效果好、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、能耗低，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)相似天然產(chǎn)物的除雜需要的操作方法，為天然產(chǎn)物研究工作者提供參考。第一章 緒論1.1 天然產(chǎn)物的介紹天然產(chǎn)物是指動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、海洋生物和微生物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物

8、以及人和動(dòng)物體內(nèi)許多內(nèi)源性的化學(xué)成分。其中主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸、各種酶類、單糖、寡糖、多糖、糖蛋白、樹(shù)脂、膠體物、木質(zhì)素、維生素、脂肪、油脂、蠟、生物堿、揮發(fā)油、黃酮、糖苷類、萜類、苯丙素類、有機(jī)酸、酚類、醌類、內(nèi)酯、甾體化合物、鞣酸類、抗生素類等天然存在的化學(xué)成分，其中許多有效成分是預(yù)防和治療疾病、調(diào)節(jié)身體的物質(zhì)基礎(chǔ)。并且天然產(chǎn)物由于其安全性高，已成為醫(yī)藥、食品和飼料等的重要來(lái)源1-2。1.2 我國(guó)天然產(chǎn)物的研究和應(yīng)用現(xiàn)狀1.2.1 天然產(chǎn)物的研究方法天然產(chǎn)物的獲得和生產(chǎn)主要有三條途徑：一是直接提取；二是人工合成；三是利用生物技術(shù)生產(chǎn)。目前絕大多數(shù)品種的天然產(chǎn)物是采用直接提取方

9、法生產(chǎn)的。由于生物合成代謝的復(fù)雜性，許多天然物質(zhì)很難在人工控制下化學(xué)合成，人工合成的方法只能生產(chǎn)極個(gè)別的具有天然產(chǎn)物化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物已為人們開(kāi)闊了廣泛的領(lǐng)域，如利用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)藍(lán)色素、紅曲色素等多種天然色素已成為現(xiàn)實(shí)3-4，利用微生物具有特定的優(yōu)勢(shì)，如不受資源、環(huán)境和空間的限制，以及生長(zhǎng)迅速等，可快速大量的生產(chǎn)天然產(chǎn)物。對(duì)天然產(chǎn)物性質(zhì)的研究，首先應(yīng)考慮毒理學(xué)的評(píng)價(jià)或安全性，其次是天然產(chǎn)物的理化性，主要包括：ph值、光照、溫度以及食品中金屬離子、碳水化合物和添加劑的影響，天然產(chǎn)物的抑菌活性、光譜性質(zhì)和抗氧化還原能力等5，同時(shí)隨著近

10、代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們要從分子水平上去認(rèn)識(shí)天然產(chǎn)物，包括它的結(jié)構(gòu)和分子方面的性質(zhì)，這樣就能更好的了解天然產(chǎn)物的性質(zhì)和應(yīng)用范圍。通過(guò)對(duì)天然產(chǎn)物分子性質(zhì)的研究，人們就可以更好地指導(dǎo)其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，為天然產(chǎn)物工業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。1.2.2 天然產(chǎn)物的提取方法發(fā)展至今，天然產(chǎn)物的提取方法常見(jiàn)的有有機(jī)溶劑提取法、堿液提取法、超臨界提取法、微波萃取法等幾種方法。 (1)有機(jī)溶劑提取法 溶劑提取法是目前從動(dòng)植物中提取色素的一種常用的方法。提取高梁紅色素是用0.1%的鹽酸水溶液浸泡2h，除去雜質(zhì)和雜色后，再用7%的乙醇水溶液在40下浸提，然后過(guò)濾、濃縮、干燥而得6。利用有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮、乙

11、酸乙酯等提取姜黃得姜黃色素7，將蝦殼用鹽酸浸泡24h 后過(guò)濾，濾渣用95%乙醇浸泡提取液經(jīng)蒸餾后得到濃縮的粗制蝦青素提取物。相對(duì)而言，有機(jī)溶劑提取法萃取劑便宜，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單易行，提取率較高，但用其提取的某些產(chǎn)品質(zhì)量較差，純度較低，有異味或溶劑殘留，影響產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。(2)堿提取法 堿提法主要是應(yīng)用堿對(duì)多種生物物質(zhì)的影響作用，其提取效率雖不如有機(jī)溶劑提取率高，但從經(jīng)濟(jì)角度和安全性考慮仍有應(yīng)用價(jià)值。蝦殼中的蝦青素大多與蛋白質(zhì)結(jié)合，應(yīng)用堿液脫蛋白的原理，當(dāng)用熱堿液煮蝦殼時(shí)，蛋白質(zhì)溶出，蝦青素也隨著溶出，從而達(dá)到提取蝦青素的目的。辣椒紅色素的堿提取是以15%- 40%的水溶液處理辣椒油樹(shù)脂，使

12、辣椒紅色素中的脂肪成分發(fā)生皂化反應(yīng)， 從而將辣椒紅色素游離釋放出來(lái)，再分離精制可得到產(chǎn)品。由于堿提法加工過(guò)程需消耗大量酸堿，且廢液較難回收，因此近幾年來(lái)對(duì)堿提法的研究報(bào)道較少。(3)超臨界流體萃取法 超臨界二氧化碳流體萃取是近二十年發(fā)展起來(lái)的一種新型物質(zhì)分離、精制技術(shù)。它兼?zhèn)溆袣怏w低粘度、高擴(kuò)散和流體的高密度、大溶解度兩方面的特點(diǎn)8。由于超臨界提取工藝簡(jiǎn)單，能耗低，萃取劑便宜，提取的產(chǎn)品具有純度高， 溶劑殘留少，無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的重視。tsunc 等的專利報(bào)道中，應(yīng)用超臨界從蝦殼中提取蝦青素，濃度可達(dá)到8.331%9。宿樹(shù)蘭等采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超臨界流體萃取姜黃藥材中姜黃素，得到

13、姜黃素占萃取物量高達(dá)8.91%。(4)微波萃取法微波萃取是在密閉容器中用微波加熱樣品及有機(jī)溶劑，將待測(cè)物質(zhì)組分從樣品基體中提取出來(lái)的一種方法，是由密閉容器中酸硝解樣品和液固萃取有機(jī)物兩種技術(shù)相結(jié)合演變出來(lái)的，其能在短時(shí)間內(nèi)完成多種樣品組分的萃取，溶劑用量少，結(jié)果重現(xiàn)性好10。微波萃取克服了超臨界萃取和溶劑萃取方法的上述缺陷， 既降低了操作費(fèi)用，又符合環(huán)境保護(hù)的要求，表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用潛力。(5)分子蒸餾技術(shù)分子蒸餾是一種特殊的液-液分離技術(shù)，其基本原理是基于不同物質(zhì)分子在高真空下分子運(yùn)動(dòng)平均自由程的差別，在遠(yuǎn)低于物質(zhì)常壓沸點(diǎn)溫度的條件下將其分離出來(lái)。該技術(shù)具有蒸餾溫度低，蒸餾壓力

14、低，分離程度高，受熱時(shí)間短等特點(diǎn)，因而能大大降低高沸點(diǎn)物料的分離成本，極好地保護(hù)熱敏性物料的品質(zhì)，真正保持了純天然的特性。鐘耕等采用分子蒸餾法，以冷榨甜橙油為原料，提取其中的類胡蘿卜素。結(jié)果表明，采用分子蒸餾法，從脫蠟的甜橙油中一步提取的色素，不含有機(jī)溶劑，純度高，色價(jià)高。(6)雙水相萃取技術(shù)(atpe)雙水相萃取技術(shù)是二十世紀(jì)60 年代以來(lái)研究開(kāi)發(fā)的新型固-液分離技術(shù)。其基本原理是利用被提取物質(zhì)在不同的兩相系統(tǒng)間分配行為的差異進(jìn)行分離。與傳統(tǒng)的萃取方法相比，atpe 技術(shù)所形成的兩相大部分為水，兩相界面張力很小， 為有效成分的溶解和萃取提供了適宜的環(huán)境， 相際間的質(zhì)量傳遞快， 操作方便， 時(shí)

15、間短，條件溫和，易于工程放大和連續(xù)操作。(7)高效液相色譜(hplc) 技術(shù)hplc是一種以液體為流動(dòng)相的現(xiàn)代柱色譜分離分析技術(shù)。該技術(shù)具有分離效率高，分析速度快，用樣量少，靈敏度高，流出組分可收集，兼具分析和制備等優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析。對(duì)于熱不穩(wěn)定性或極性大的天然產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，hplc是一種有效的分離分析方法。趙明波等建立了菊科植物紅花中的主要有效成分羥基紅花黃色素a的hplc 定量分析方法。(8)酶法提取法纖維素酶可使纖維素、半纖維素等物質(zhì)降解，引起細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生局部疏松、膨脹等變化，從而增大胞內(nèi)有效成分向提取介質(zhì)的擴(kuò)散，促進(jìn)天然產(chǎn)物提取效

16、率的提高。應(yīng)用纖維素酶提取紅花中的紅花黃色素，與傳統(tǒng)水浸提取工藝相比，提取率提高了9.40%-13.35%，具有提取條件溫和，有效成分理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用酶促反應(yīng)還可改變天然梔子黃色素中的梔子苷的結(jié)構(gòu)， 生產(chǎn)出梔子紅、藍(lán)色素。(9)膜分離法膜分離法是用天然或人工合成的高分子膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力對(duì)混合物進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和濃縮的方法。在色素分離中，利用色素與雜質(zhì)分子大小的差異， 采用纖維超濾膜和反滲透膜，可阻留各種不溶性大分子如多糖、蛋白質(zhì)等。該法工藝簡(jiǎn)單，效能高11。1.2.3 我國(guó)天然產(chǎn)物的應(yīng)用現(xiàn)狀我國(guó)疆域遼闊，有著天然產(chǎn)物生產(chǎn)所需的豐富植物資源，在發(fā)展天然產(chǎn)物方面具有一定

17、的優(yōu)勢(shì)。所以在開(kāi)發(fā)利用天然產(chǎn)物時(shí)，既要充分利用我國(guó)豐富自然資源，但也要注意綜合利用、環(huán)境的保護(hù)以及資源的可持續(xù)發(fā)展。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出80余種不同原料來(lái)源的食用天然色素。云南的西雙版納、武陵山區(qū)、秦巴山及東北的長(zhǎng)白山為天然色素植物資源較為集中的地區(qū)，玉米、紅花、辣椒等品種為我國(guó)發(fā)展天然色素工業(yè)提供了充足的原料。我國(guó)還有一支龐大的天然色素研究開(kāi)發(fā)隊(duì)伍。我國(guó)食用色素的生產(chǎn)使用管理是改革開(kāi)放以來(lái)食品工業(yè)快速發(fā)展而迅速發(fā)展壯大起來(lái)的。經(jīng)過(guò)20多年的努力，我國(guó)的食用色素產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，成為食品工業(yè)中的一個(gè)重要行業(yè)。目前，我國(guó)已推出品種繁多的天然食用色素，諸如，姜黃色素、葉綠素銅鈉鹽、紅藥子黃色素、玉米黃色素

18、、紅曲色素粉、高粱紅色素、棗紅色素、桅子黃色素、辣椒紅色素、紅花黃色素等，均受到廣大食品廠家的青睞。據(jù)1998年下半年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)食用色素的年產(chǎn)量約2.5萬(wàn)噸。其中：焦糖每年產(chǎn)量約1.82萬(wàn)噸；紅曲米及紅曲米粉每年約產(chǎn)4000多噸；紅曲紅每年約產(chǎn)200多噸；辣椒油樹(shù)脂及辣椒紅每年約產(chǎn)250多噸；桅子黃色素每年約產(chǎn)10噸；高梁紅色素每年約產(chǎn)45噸；可可殼棕每年約產(chǎn)10噸；甜菜紅每年約產(chǎn)20噸；蟲(chóng)膠紅每年約產(chǎn)20噸。這些食品天然色素產(chǎn)品除在國(guó)內(nèi)銷售外，還遠(yuǎn)銷國(guó)外。焦糖色素是一種天然的食品著色劑和天然食用色素。在人們崇尚綠色天然食品的今天，用純化學(xué)物質(zhì)人工合成的食品著色劑和食用色素已不占食用色素市場(chǎng)的

19、主流。因此，用糖類、淀粉類制作的焦糖色素作為天然食品著色劑和天然食用色素，成為國(guó)際上的食品市場(chǎng)首選的食用色素，按比例計(jì)量，焦糖色素占所有食品色素量的90%以上，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的醬油、醬菜、食醋、燒臘、肉類罐頭、糖果、烘烤食品、有色飲料、有色酒類等產(chǎn)品12。1.2.4 天然產(chǎn)物的發(fā)展前景隨著我國(guó)食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)的發(fā)展，天然產(chǎn)物的市場(chǎng)需求量將大幅度增加，新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，使得天然產(chǎn)物市場(chǎng)具有廣闊的發(fā)展前景。中國(guó)天然產(chǎn)物的發(fā)展將為我國(guó)進(jìn)人一日三餐的加工食品增加更多的色彩和安全感。同時(shí)由于人們對(duì)化學(xué)合成色素危害性認(rèn)知的增加，天然產(chǎn)物具有的天然和健康屬性，使天然色素的種類和市場(chǎng)需求量大

20、幅度增加，而且色素品種逐漸由合成色素轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊簧?，但目前天然色素的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展的需要，開(kāi)發(fā)新品種的天然色素，探索新的天然色素來(lái)源，對(duì)原有天然色素的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，擴(kuò)大天然色素的應(yīng)用范圍，降低天然色素的生產(chǎn)成本，已成為添加劑行業(yè)和研究者們非常迫切的問(wèn)題。同時(shí)我國(guó)幅員遼闊，位處寒、溫、亞熱、熱帶地區(qū)，生物資源豐富，種類繁多，而且許多品種產(chǎn)地集中，如云南的西雙版納、武陵山區(qū)、秦巴山以及東北的長(zhǎng)白山均是天然色素資源較為集中的地區(qū)，其他各地都有天然色素生產(chǎn)的原料，均可以因地制宜地開(kāi)發(fā)利用。特別是一些農(nóng)產(chǎn)品，如玉米、高粱、辣椒、蘿卜等更是隨處可見(jiàn)，這就為天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供了豐富的

21、原料，也為農(nóng)副產(chǎn)品的深加工開(kāi)辟了新的途徑。1.2.5 我國(guó)天然產(chǎn)物的發(fā)展方針我國(guó)天然產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)是改革開(kāi)放以來(lái)，隨著食品工業(yè)的蓬勃發(fā)展而發(fā)展壯大起來(lái)的。隨著人民生活水平的提高和食品工業(yè)不斷發(fā)展與壯大，食用色素發(fā)展在我國(guó)具有廣闊的前景，以天然色素為例說(shuō)明我國(guó)對(duì)天然產(chǎn)物發(fā)展的政策方針。(1)大力發(fā)展“天然、營(yíng)養(yǎng)、多功能”的食用天然色素今后在我國(guó)化學(xué)合成著色劑與天然色素并用的情況下，應(yīng)當(dāng)大力發(fā)展“天然、營(yíng)養(yǎng)、多功能”的天然色素，著力開(kāi)發(fā)、研究、生產(chǎn)、使用既可以著色，又有某些生理功能的天然色素例如天然價(jià)胡蘿卜素，作為食品黃色著色劑，進(jìn)人人體后在加氧酶作用下能在肝臟或腸粘膜裂解成兩個(gè)分子的維生素a，而維生素

22、a有使上皮細(xì)胞健全、保持正常視覺(jué)、提高免疫力等多種生理功能。紅曲米中含有降血脂物質(zhì)酪伐它汀，作為著色劑用于食品中，可以有效地使人體內(nèi)血脂達(dá)到正常平衡不少以類黃酮為天然色素的物質(zhì)有抗氧化功能或軟化血管功能。我國(guó)天然色素資源豐富，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、研究、生產(chǎn)、應(yīng)用功能性天然色素大有潛力。(2)提高技術(shù)與裝備水平，促進(jìn)天然色素的生產(chǎn)天然色素的生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)采用高新技術(shù)，不斷提高裝備水平，提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低成本，從而提高產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。我國(guó)產(chǎn)物生產(chǎn)行業(yè)雖有少數(shù)工廠擁有較好的生產(chǎn)技術(shù)、工藝和裝備，但大多數(shù)企業(yè)在技術(shù)、工藝方面比較落后，設(shè)備陳舊或簡(jiǎn)陋，必須不斷創(chuàng)新提高，才能使產(chǎn)品上檔次，行業(yè)才有發(fā)展

23、。在天然色素的生產(chǎn)過(guò)程中，可以采用的高新技術(shù)有：基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、吸附色譜、凝膠過(guò)濾、微孔過(guò)濾、超濾、電滲析、反滲透、膜分離技術(shù)、超臨界流體萃取分離技術(shù)(、丙烷)、冷凍干燥等技術(shù)。采用了高新技術(shù)，就是提高設(shè)備的裝備水平，這是提高天然色素的收率，提高產(chǎn)量，保證優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)。(3)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化、系列化、實(shí)用化，開(kāi)拓國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)。近年來(lái)，我國(guó)天然色素產(chǎn)業(yè)的管理水平和規(guī)范化方面雖然有長(zhǎng)足的進(jìn)步，但還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)。我國(guó)各天然色素生產(chǎn)企業(yè)一般規(guī)模都偏小，產(chǎn)品單一，在小量、低質(zhì)量、高損耗中徘徊，經(jīng)濟(jì)效益不明顯，抗風(fēng)險(xiǎn)能力差。多數(shù)工廠所生產(chǎn)的是原料型的天然色素，一般不能直接使用，因而價(jià)格低，經(jīng)濟(jì)

24、效益不高。就某一個(gè)天然色素而言，一個(gè)企業(yè)也沒(méi)有完全做到標(biāo)準(zhǔn)化、系列化，缺欠實(shí)用技術(shù)的開(kāi)發(fā)。歐洲、美國(guó)、日本等國(guó)天然色素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展早于我國(guó)，這些國(guó)家在管理水平、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、系列化、實(shí)用化等方面日臻完善。我們應(yīng)當(dāng)奮進(jìn)直追，迎頭趕上。在天然色素的發(fā)展方面，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)天然色素實(shí)用技術(shù)的研究、開(kāi)發(fā)，這個(gè)課題并不亞于天然色素本身的研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)，是我國(guó)天然色素打開(kāi)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的關(guān)鍵。(4)進(jìn)行原料的綜合利用在原料上應(yīng)當(dāng)走綜合利用，變廢為寶的道路。一個(gè)原料多出好幾個(gè)產(chǎn)品，物盡其用，提高經(jīng)濟(jì)效益。許多天然色素生產(chǎn)的原料是野生植物、農(nóng)作物副產(chǎn)品或廢棄物。目前許多天然紅色素，如紅高粱、酸棗色、葡萄皮紅等，

25、都是從農(nóng)產(chǎn)品的廢棄物中提取的。用高粱殼生產(chǎn)高粱紅；用葡萄皮渣生產(chǎn)葡萄色素等，原料低廉。又例如生產(chǎn)辣椒紅色素的工廠，用辣椒作為原料。辣椒的種子可以提取辣椒堿及辣椒油，殘?jiān)叩鞍?；辣椒種皮可以提取辣椒紅色素、辣椒堿，殘?jiān)倥渖厦驷u、油、鮮味劑，可精制辣醬。一個(gè)姜黃原料可以生產(chǎn)出姜黃油、姜黃素、姜黃油樹(shù)脂、姜黃粉、乳化姜黃色素等多種產(chǎn)品，這對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品的深加工以及廢棄物的處理，不失為一個(gè)好方法。這種綜合利用的開(kāi)發(fā)，可以大大提高經(jīng)濟(jì)效益。(5)立足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)、開(kāi)拓國(guó)際市場(chǎng)我國(guó)天然色素產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)立足于國(guó)內(nèi)巨大的市場(chǎng)，開(kāi)拓國(guó)際市場(chǎng)。我國(guó)是一個(gè)占世界人口四分之一的、具有13億人口的大國(guó)，因此，這樣多的人口，要進(jìn)

26、入一日三餐的加工食品時(shí)代，需要的食用天然色素是很大的。一些外國(guó)的有識(shí)之士也十分重視這個(gè)市場(chǎng)。只要我們能把自己的天然色素做到標(biāo)準(zhǔn)化、系列化、實(shí)用化，一定能培養(yǎng)出中國(guó)這個(gè)大市場(chǎng)，這已經(jīng)為火腿腸使用紅曲紅和餅干噴涂辣椒紅的中國(guó)市場(chǎng)所證明。當(dāng)今國(guó)際經(jīng)濟(jì)一體化要求我們將中國(guó)的天然色素打人世界其它國(guó)家，特別是西方發(fā)達(dá)國(guó)家，它除了要開(kāi)拓中國(guó)天然色素的國(guó)際市場(chǎng)外，還有一個(gè)東方飲食文化的交流和交融的重要意義12。1.3 天然產(chǎn)物提取液的精制方法隨著科技的發(fā)展和生活水平的提高，天然產(chǎn)物以其健康、安全的特點(diǎn)，將越來(lái)越受人們的歡迎，但天然產(chǎn)物大多不能直接使用，而只需要其中的某些物質(zhì)，因此需要對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行提取分離，提

27、取后所得提取液大多數(shù)是混合物，需利用體系中各組分物性的差別，使用不同的方法使混合物得到分離提純。1.3.1 蛋白質(zhì)分離純化方法(1)根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì)，并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以利用一些較簡(jiǎn)單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過(guò)濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時(shí)常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過(guò)程。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無(wú)機(jī)鹽

28、為主的小分子分開(kāi)。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無(wú)機(jī)鹽。由于超濾過(guò)程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質(zhì)的分子量也越來(lái)越小。所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過(guò)濾得到更理想的效果。離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)可以利用離心的方法將它們分開(kāi)。例如，在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，加入纖維素酶和-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后，再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離13。使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度(區(qū)帶)離心。常用的密度梯度有

29、蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度?？梢愿鶕?jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。蔣辰等通過(guò)比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果，利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過(guò)濾也稱凝膠滲透層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。凝膠過(guò)濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動(dòng)并最先流出柱外；反之，比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和

30、瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過(guò)程中使用凝膠過(guò)濾方法可以得到很好的效果，純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32kda、成分是多糖蛋白質(zhì)(8812)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白14。凝膠過(guò)濾在抗凝血蛋白的提取過(guò)程中也被用來(lái)除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)。(2)根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的ph值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度，根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件，就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和ph值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽

31、析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。等電點(diǎn)沉淀和ph值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn)，而且在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定ph值時(shí)很容易溶解。因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的ph值來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。王洪新等15研究茶葉蛋白質(zhì)提取過(guò)程發(fā)現(xiàn)，ph值為4時(shí)茶葉蛋白提取效果最好，提取率達(dá)到36.8%，初步純化得率為91.0%。李殿寶在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時(shí)將蛋白溶液的ph值調(diào)到34，使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來(lái)。等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。李鳳英等測(cè)得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為3.8。他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì)，得到了最佳的提取工藝為：以的溶液，按15的料液

32、比，在40攪拌40 min，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達(dá)73.78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取。利用酸法提取得到的鰱魚(yú)魚(yú)肉蛋白質(zhì)無(wú)腥味、色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)90%。蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象，其中，增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶，反之為鹽析。應(yīng)當(dāng)指出，同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽，如、對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比一價(jià)離子中性鹽如、大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來(lái)提取蛋白質(zhì)，其最佳提取工藝是：以10%溶液，按125的料液比，在30攪拌提取30min，蛋白質(zhì)提取率為57.25%。鹽析是提取血液中

33、免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性，為防止其對(duì)蛋白質(zhì)的破壞，應(yīng)用氨水調(diào)ph值至中性。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0.2%2.0%。利用鹽溶和鹽析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后，通常要使用透析或者凝膠過(guò)濾的方法除去中性鹽。有機(jī)溶劑提取法的原理是：與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、ph值和離子強(qiáng)度下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此，控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。例如，在冰浴中磁力攪拌下，在4預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25)，可以

34、使冰核蛋白析出，從而純化冰核蛋白。由于在室溫下，有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀，而且伴隨著變性。因此，通常要將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過(guò)高，蛋白質(zhì)變性問(wèn)題就可以很大程度上得到解決。對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì)，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取，它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性，是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由cohn于1949年提出，用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前who規(guī)程和中國(guó)生物制品規(guī)程推薦的方法，不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種血漿成分，而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。萃取是分離和提純有機(jī)

35、化合物常用的一種方法，而雙水相萃取和反膠團(tuán)萃取可以用來(lái)分離蛋白質(zhì)。雙水相萃取技術(shù)(aqueous two phase extraction，atpe)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相，由于被分離物在兩相中分配的不同，便可實(shí)現(xiàn)分離，被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行，雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，收率較高。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到濃縮，細(xì)胞碎片等固體物分布在下相中。采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液ph值、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響16。反膠團(tuán)萃取

36、法是利用反膠團(tuán)將蛋白質(zhì)包裹其中而達(dá)到提取蛋白質(zhì)的目的。反膠團(tuán)是當(dāng)表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑溶解時(shí)自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是萃取過(guò)程中蛋白質(zhì)因位于反膠團(tuán)的內(nèi)部而受到反膠團(tuán)的保護(hù)。程世賢等就利用反膠團(tuán)萃取法提取了大豆中的蛋白質(zhì)。(3)根據(jù)電荷不同進(jìn)行分離純化根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒(如不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子)將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質(zhì)的區(qū)帶電泳，常用于分離蛋白質(zhì)。它的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高分辨率的蛋白

37、質(zhì)分離技術(shù)，也可以用于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定。利用等電聚焦技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有ph梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。在外電場(chǎng)作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦在等于其等電點(diǎn)的ph值梯度處形成一個(gè)窄條帶。孫臣忠17等研究了聚丙烯酰胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚丙烯酰胺電泳的條帶分辨率低，加樣量不高；等電聚焦電泳分辨率最高，可以分離同種蛋白的亞成分，加樣量最??；等速提純電泳區(qū)帶分辨率較高，可將樣品分成單一成分，加樣量最大。離子交換層析(ion exchange chromatography ，iec)是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可

38、逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換層析中，基質(zhì)由帶有電荷的樹(shù)脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹(shù)脂；反之為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的ph值條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，被留在層析柱上，通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度，將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的ph值洗脫下來(lái)。李全宏等18將離子交換層析應(yīng)用于濃縮蘋果汁中蛋白質(zhì)的提純。另外，離子交換層析還用于抗凝血蛋

39、白的提取。(4)利用對(duì)配體的特異親和力進(jìn)行分離純化親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力(即生物學(xué)親和力)建立起來(lái)的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)，并且純度相當(dāng)高。應(yīng)用親和層析須了解純化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，以便設(shè)計(jì)出最好的分離條件。近年來(lái)，親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)蛋白尤其是疫苗的分離純化，特別是在融合蛋白的分離純化上，親和層析更是起到了舉足輕重的作用，因?yàn)槿诤系鞍拙哂刑禺愋越Y(jié)合能力19。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛20。范繼業(yè)等利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達(dá)到71 428，純化回收率達(dá)到62.5

40、%。該方法成本較低，吸附劑價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度高、抗污染能力較強(qiáng)、非特異性吸附較小、可反復(fù)使用、適用性廣，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。1.3.2 冷凍脫脂的原理及影響因素1.3.2.1 冷凍脫脂原理天然脂類中不同類型的甘三酯的熔點(diǎn)有一定的差異，隨著溫度的降低固體脂在有機(jī)溶劑中的溶度降低，因此通過(guò)降溫冷卻能促使固體脂結(jié)晶，然后進(jìn)行固液分離即可達(dá)到脫脂的目的。固體脂的結(jié)晶可分為3個(gè)階段：一是油脂的冷卻、過(guò)飽和；二是晶核的形成；三是脂晶的成長(zhǎng)。1.3.2.2 影響冷凍脫脂的因素影響冷凍脫脂的因素主要有4個(gè)方面。一是結(jié)晶溫度和冷卻速率。某種油脂最穩(wěn)定晶型的獲得是由冷卻速度和結(jié)晶溫度決定的，溫差過(guò)大的急驟冷卻易形成無(wú)法

41、分離的玻璃質(zhì)體，只有緩慢冷卻至一定的結(jié)晶溫度，才能獲得相應(yīng)的晶型，冷卻速率取決于冷卻介質(zhì)與油脂的溫差和傳熱面積。脫脂效果主要取決于晶粒的數(shù)量與大小，在冷凍脫脂過(guò)程中晶核的生成及晶粒的生長(zhǎng)速率與冷卻速率有著極大的相關(guān)性。二是結(jié)晶時(shí)間。達(dá)到穩(wěn)定晶型需要足夠的時(shí)間，延長(zhǎng)結(jié)晶時(shí)間有利于穩(wěn)定晶型的形成和成長(zhǎng)。三是攪拌速度。適當(dāng)?shù)臄嚢?，可使油脂中各處冷卻均勻，使已經(jīng)析出的脂晶與將要析出的脂分子碰撞，有利于晶粒的形成和長(zhǎng)大。但攪拌速度過(guò)大，則會(huì)打碎已經(jīng)形成的晶粒，也不利于結(jié)晶。故攪拌速度要適宜，要根據(jù)冷凍結(jié)晶操作的不同階段而調(diào)節(jié)，以有利于晶粒的形成與成長(zhǎng)為度。四是溶液品質(zhì)。天然提取液中的某些雜質(zhì)對(duì)結(jié)晶及其分

42、離也有很大影響，如過(guò)氧化物的存在不僅會(huì)降低油脂的固體脂指數(shù)，而且會(huì)增大油脂的黏度，對(duì)結(jié)晶和分離均有不良影響，須將其預(yù)先脫除21。1.4 高速離心分離技術(shù)1.4.1 離心分離簡(jiǎn)介離心分離(centrifugal separation)：借助于離心力，使比重不同的物質(zhì)進(jìn)行分離的方法。 由于離心機(jī)等設(shè)備可產(chǎn)生相當(dāng)高的角速度，使離心力遠(yuǎn)大于重力，于是溶液中的懸浮物便易于沉淀析出：又由于比重不同的物質(zhì)所受到的離心力不同，從而沉降速度不同，能使比重不同的物質(zhì)達(dá)到分離。離心分離生物分子是最常用的生化分離方法，因?yàn)椴煌纳锓肿佑胁煌捏w積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，離心分

43、離技術(shù)已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)中不可缺少的分離技術(shù)手段。對(duì)于兩相密度相差較小，黏度較大，顆粒粒度較細(xì)的非均相體系，在重力場(chǎng)中分離需要很長(zhǎng)時(shí)間，甚至不能完全分離。若改用離心分離，由于轉(zhuǎn)鼓高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于重力，可大大提高沉降速率，因此離心分離只需較短的時(shí)間即能獲得大于重力沉降的效果。1.4.2 離心分離的基本原理當(dāng)非均相體系圍繞一中心軸做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)時(shí)，運(yùn)動(dòng)物體會(huì)受到離心力的作用，旋轉(zhuǎn)速率越高，運(yùn)動(dòng)物體所受到的離心力越大。在相同的轉(zhuǎn)速下，容器中不同大小密度的物質(zhì)會(huì)以不同的速率沉降。如果顆粒密度大于液體密度，則顆粒將沿離心力的方向而逐漸遠(yuǎn)離中心軸。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的離心操作，就可以實(shí)現(xiàn)密度不同

44、物質(zhì)的有效分離。1.4.3 常用離心方法根據(jù)離心方式的不同，可分為差速離心法和密度梯度離心等。(1)差速離心：又叫分級(jí)離心法，是生化分離中最為常用的離心分離方法。它指采用低速和高速兩種離心方式交替使用，用不同強(qiáng)度的離心力使具有不同密度的物質(zhì)分級(jí)分離的方法。離心后把上清液與沉淀分開(kāi)，然后再將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。(2)密度梯度離心：也叫區(qū)帶離心，即離心是在具有連續(xù)密度梯度的介質(zhì)中進(jìn)行。將試樣鋪放在一個(gè)密度變化范圍較小、梯度斜度變化比較平緩的密度梯度介質(zhì)表面，在離心力場(chǎng)作用下試樣中的顆粒按照各自的沉降速率移動(dòng)到梯度介質(zhì)中的不同位置，而形成

45、一系列試樣組分區(qū)帶，使不同沉降速率的顆粒得以分離。第二章 實(shí)驗(yàn)部分2.1 實(shí)驗(yàn)材料連翹花提取液，總黃酮含量8.2%；迎春花提取液：總黃酮含量7.5%；均為本實(shí)驗(yàn)室自備，于低溫冷藏備用。 2.2 儀器和試劑2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器bcd-271sdj冰箱 (青島海爾股份有限公司)suy-22-600dt超聲清洗機(jī) （鄭州生元儀器有限公司）玻璃儀器氣流烘干器 （河南智城科技發(fā)展有限公司） hh-501超級(jí)恒溫水浴 （常州國(guó)華電器有限公司）fa 1004b電子分析天平 （上海佑科儀器儀表有限公司）85-2a雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 （金壇市杰瑞爾電器有限公司）電子溫度計(jì) （南京好又多電器有限公司）tdl80

46、-2b臺(tái)式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）t6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）agilent 1200lc高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫科技有限公司）2.2.2 主要試劑高純水（water） 408制備無(wú)水乙醇（ethanol absolute） ar(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)氫氧化鈉（sodium hydroxide） ar(天津市登科化學(xué)試劑有限公司)乙腈（acetonitrile） 色譜純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）有機(jī)玻璃(pmma) 市售2.3 分析方法用紫外分光光度計(jì)掃描迎春花、連翹提取液稀釋100倍后的吸收光譜。2.4 實(shí)驗(yàn)方法2.4.1 粗提取液純化(1)冷

47、凍脫脂分別取迎春花、連翹花粗取液各50ml于兩個(gè)燒杯中，貼上標(biāo)簽置于冰箱中按設(shè)定溫度3進(jìn)行低溫處理，低溫處理完成以2000轉(zhuǎn)速高速離心得到除去脂肪后的提取液，分別將離心后所得提取液與固體殘?jiān)蛛x，觀察處理后的提取液的色澤及澄清度，取適量上層清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在190nm-900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜。(2)高溫脫去蛋白質(zhì)將脫脂后的提取液分別用恒溫水浴加熱至45，并保溫1h，高溫處理完成后以2000高速離心得到去除蛋白質(zhì)的提取液，將提取液和固體殘?jiān)蛛x，靜置一夜觀察處理后的提取液的色澤及澄清度，取適量上層清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在190nm-900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜。2.5 提取液的高效液

48、相色譜分析用高效液相色譜對(duì)純化后的溶液進(jìn)行分析，流動(dòng)相為乙腈：水(0.4：0.6)，流速為1.0，柱溫為室溫，分離柱為c18；進(jìn)樣量20，檢測(cè)波長(zhǎng)為：迎春花；連翹花。第三章 結(jié)果與討論3.1 溫度控制條件的確定圖3.1和圖3.2為水的冷凍和加熱曲線?；貧w方程為： y=a+exp(-x/t1)+y0 （3-1）圖3.1水的降溫曲線a=16.65 t1=1.15 y0=3.70圖3.2 水45升溫曲線a=-27.29 t1=10.04 y0=45.42根據(jù)上述分析的結(jié)果，確定控溫溫度與要求溫度的差為2。恒溫時(shí)間，冷凍時(shí)間為5小時(shí)，加熱時(shí)間為30分鐘。對(duì)實(shí)際樣品的加熱曲線見(jiàn)圖3.3和圖3.6。圖3.

49、3 迎春花原液3降溫曲線圖3.4 連翹花原液3降溫曲線圖3.5 迎春花原液45升溫曲線圖3.6 連翹花原液45升溫曲線3.2 除雜前提取液吸收光譜的測(cè)定連翹花中主要含有連翹苷、連翹酯苷及黃酮類成分，黃酮類成分主要是槲皮素；迎春花含丁香甙、迎春花苷、及黃酮類成分，黃酮成分主要是蘆丁。迎春花和連翹花樣品實(shí)物圖見(jiàn)圖3.7和圖3.8。槲皮素及蘆丁分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3.9和圖3.10。圖3.7 迎春花樣品實(shí)物圖圖3.8 連翹花樣品實(shí)物圖 c27h30o16 c15h10o7圖3.9 蘆丁分子結(jié)構(gòu)式 圖3.10 槲皮素分子結(jié)構(gòu)式迎春花提取液和連翹花提取液的吸收光譜見(jiàn)圖3.11-圖3.12。圖3.11 迎春花原液

50、稀釋100倍吸收光譜圖3.12 連翹花原液稀釋100倍吸收光譜 圖3.11表明迎春花提取液在226nm處有最大吸收峰；圖3.12表明連翹花提取液在204nm處有最大吸收峰。3.3 提取液處理前后的紫外光譜分析處理后的樣品光譜見(jiàn)圖3.13-圖3.16。圖3.13 稀釋100倍迎春花原液經(jīng)冷凍處理前后紫外吸收光譜圖圖3.14 稀釋100倍連翹花原液經(jīng)冷凍處理前后紫外吸收光譜圖圖3.15 稀釋100倍迎春花原液經(jīng)脫脂45度去蛋白前后紫外吸收光譜圖 圖3.16 稀釋100倍連翹花原液經(jīng)脫脂45度去蛋白前后紫外吸收光譜圖從圖3.13-圖3.16中可以看出，除雜后的光譜強(qiáng)度增加，說(shuō)明提取液純度得到提高。3

51、.4 提取液的高效液相色譜譜圖分析迎春花與連翹提取液處理前后高效液相譜圖見(jiàn)圖3.17-圖3.22圖3.17稀釋100倍迎春花原液高效液相色譜圖圖3.18 稀釋100倍迎春花冷凍處理高效液相色譜圖圖3.19 稀釋100倍迎春花加熱處理高效液相色譜圖圖3.20 稀釋100倍連翹花原液高效液相色譜圖圖3.21 稀釋100倍連翹花冷凍處理高效液相色譜圖圖3.22 稀釋100倍連翹花加熱處理高效液相色譜圖從圖3.17- 圖3.22這些圖譜中可以看出，經(jīng)過(guò)一系列除雜后，主要成分的含量增加，但峰面積整體下降，證明在除雜過(guò)程中目標(biāo)成分也有少量損失；雜質(zhì)峰的數(shù)目減少，說(shuō)明大量雜質(zhì)被去除。3.5 除雜前后對(duì)有機(jī)玻璃的上色效果提取液除雜前后對(duì)有機(jī)玻璃上色紫外圖譜見(jiàn)圖3.23- 圖3.24。圖3.23 迎春花對(duì)有機(jī)玻璃上色紫外光譜圖圖3.24 連翹花對(duì)有機(jī)玻璃上色紫外光譜圖從圖3.23-3.24中可以看出，除雜后染色效果加強(qiáng)。這說(shuō)明染色過(guò)程中，油脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的存在，對(duì)有機(jī)玻璃染色