實(shí)驗(yàn)五、葉綠體的分離與觀察

1、實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 葉綠體的分離與觀察葉綠體的分離與觀察 葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，光合作用就是在葉綠體中進(jìn)行的。 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 目目 的的 1. 通過植物細(xì)胞葉綠體的分離, 了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。 2. 觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光, 并了解熒光顯微鏡的使用方法。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。是分離細(xì)胞器的常用方法。 一個(gè)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決于顆粒的大一個(gè)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的

2、粘度有關(guān)。在一給定的離心場(chǎng)中，同一時(shí)間內(nèi)，密度有關(guān)。在一給定的離心場(chǎng)中，同一時(shí)間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使非均一懸浮液中的離心力和離心時(shí)間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。 low speedhigh speeddifferential centrifugation 試劑與器械試劑與器械 1. 器材器材 : 普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平

3、、熒光顯微鏡。燒杯天平、熒光顯微鏡。燒杯2個(gè)個(gè), 250ml量筒量筒1個(gè)個(gè), 滴管滴管20支支, 10ml刻度離心管刻度離心管20支支, 試試管架管架5個(gè)，紗布若干，載片和蓋片各個(gè)，紗布若干，載片和蓋片各4片。片。 2. 試劑試劑: 0.35mol/l氯化鈉溶液，氯化鈉溶液，0.01%吖吖啶橙啶橙(acridine orange)。三三. .實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（一）葉綠體的分離與觀察（一）葉綠體的分離與觀察 1.1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g30g于于150150ml ml 0.35mol/l nacl 0.35mol/l na

4、cl溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。 2. 2. 利用組織搗碎機(jī)低速利用組織搗碎機(jī)低速(5000r/min)(5000r/min)勻槳?jiǎng)驑?-53-5minmin。 3. 3. 將勻漿用將勻漿用6 6層紗布過濾于層紗布過濾于500ml500ml燒杯中。燒杯中。 4. 4. 取濾液取濾液4ml4ml在在1000r/min1000r/min下離心下離心2min2min，棄去沉淀。，棄去沉淀。 5. 5. 將上清液在將上清液在3000r/min3000r/min下離心下離心5min5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體。棄去上清液，沉淀即是葉綠體 ( (混有部分細(xì)胞核混有部分細(xì)胞核)

5、)。 6. 6. 將沉淀用將沉淀用0.350.35mol/lnaclmol/lnacl溶液懸浮。溶液懸浮。 7. 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。 （二）菠菜葉手切片觀察（二）菠菜葉手切片觀察 新鮮菠菜葉新鮮菠菜葉 刀片切出一斜面置于載玻片上刀片切出一斜面置于載玻片上 滴加滴加12d12d氯化鈉溶液氯化鈉溶液 蓋上蓋片顯微鏡下觀察蓋上蓋片顯微鏡下觀察 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 結(jié)結(jié) 果果 （一）葉綠體的分離和觀察一）葉綠體的分離和觀察 1. 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的

6、綠色小顆粒，即基粒。 2. 以olympus熒光顯微鏡為例，在先用b(bule)激發(fā)濾片、b雙色鏡和o530(orange)陰斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。 3. 加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。 （二）菠菜葉手切片觀察（二）菠菜葉手切片觀察 1. 在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞 (1)表皮細(xì)胞: 為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細(xì)胞; (2)保衛(wèi)細(xì)胞: 為構(gòu)成氣孔的成對(duì)存在的腎形細(xì)胞；(3)葉肉細(xì)胞: 為排列成柵狀的長(zhǎng)形和橢圓形細(xì)胞。葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。 2. 在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強(qiáng)度要比游離葉綠

7、體弱, 氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。 3. 用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā)出綠色熒光, 氣孔仍為綠色。 3. 用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā)出綠色熒光, 氣孔仍為綠色。 作作 業(yè)業(yè) 1. 根據(jù)熒光觀察結(jié)果，繪制菠菜葉氣孔的結(jié)構(gòu)模式圖。 思考題： 1. 葉綠體分離的實(shí)驗(yàn)原理是什么？在分離葉綠體時(shí)應(yīng)注意些什么問題？ 五五. . 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 1. . 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒?？吹饺~綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。2. 2. 用目微尺和臺(tái)微尺測(cè)量一下葉綠體的長(zhǎng)軸和短軸，分別測(cè)用目微尺和臺(tái)微尺測(cè)量一下葉綠體的長(zhǎng)軸和短軸，分別測(cè)量量5-10