子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染

1、病理學新技術o FISHo 原位雜交o 免疫組織化學o 生物傳感器o 熒光原位雜交熒光原位雜交Fluorescence in situ hybridizationo 原理原理利用DNA堿基對的互補性，將直接標記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補的目標樣本的DNA(玻片上的標本)雜交,通過觀察熒光信號在染色體上的位置反映相應染色體的情況FISH操作樣本預處理樣本預處理 脫蠟，脫水及水化，消化，脫蠟，脫水及水化，消化，探針、樣本變性探針、樣本變性 78 78 探針樣本雜交探針樣本雜交 45-5045-50雜交后洗滌雜交后洗滌結果觀察結果觀察FISH FISH 探針種類探針種類CSP著絲粒探針著絲

2、粒探針GLP特異性位點探針特異性位點探針染色體整臂探針FISHFISH探針的類型探針的類型l 全染色體涂抹探針全染色體涂抹探針 （WCPWCP）l 染色體計數（著絲粒）探針染色體計數（著絲粒）探針（CSPCSP）l 位點特異性探針（位點特異性探針（GLPGLP） l單色特異性探針單色特異性探針l雙色分離重排探針雙色分離重排探針l雙色雙融合易位探針雙色雙融合易位探針 IgHBcl2IGH/BCL2探針探針14（灰）號和（灰）號和18號（黑）染色體號（黑）染色體IgH基因基因Bcl-2基因基因雜交雜交正正 常常 異異 常常融合融合基因擴增基因擴增雙色雙融合易位探針雙色雙融合易位探針( IGH/BC

3、L2( IGH/BCL2） FISHFISH的特點的特點操作簡單 檢測快速 結果易觀察靈敏性和特異性高可檢測樣本種類多 空間定位精確FISH檢測在臨床中的應用o產前診斷o血液病檢測o實體瘤檢測端粒，端粒酶及作用o端粒是真核細胞染色體末端的特殊NDA-蛋白結構，其DNA含大量TTAGGG重復序列，在進化中高度保守oDNA酶不能復制線性DNA（端粒是線性DNA）o大多數體細胞的端粒會隨周期性復制而縮短，最終達到一個使染色體完整性喪失的臨界點，細胞增殖停止；許多腫瘤細胞端粒酶活性增高，是腫瘤細胞增殖的關鍵步驟o作用：n保護染色體基因組免受降解或重組n為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列，以緩解或取

4、消末端復制所帶來的染色體DNA進行性縮短o生殖細胞具有端粒酶活性，其端粒不隨年齡增加而縮短，故成為永生細胞o端粒酶由RNA，DNA及蛋白質組成，本質是一種逆轉錄酶o端粒酶活性決定于端粒酶RNA（human telomerase RNA, hTERChTERC)和端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase, hTERThTERT)nhTERC是端粒長度穩(wěn)定的直接因素o保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細胞長期有活性和潛在的繼續(xù)增殖能力o人端粒酶基因位于3q26.3，該基因的擴增可阻止細胞凋亡，導致腫瘤產生 宮頸脫落細胞及組織學FISH探針CSP3TER

5、ChTERChTERC基因定位于基因定位于3q26.33q26.3 3 3號染色體著絲粒信號號染色體著絲粒信號All the three centers obtained similarly increasing trend of hTERC positive rates according to the severity of cervical lesions, for both cytological results and pathological diagnosis. 中國8350例子宮頸病變TERC擴增TBSTBS分級分級正常正常/ /炎癥炎癥ASCUSASCUSASC-HASC-H

6、LSILLSILHSILHSILTERCTERC基因擴增發(fā)生率（基因擴增發(fā)生率（% %）4.64.613.513.528.628.625.225.287.787.7病理分級病理分級正常正常/ /炎癥炎癥CIN 1CIN 1CIN 2CIN 2CIN 3CIN 3浸潤癌浸潤癌TERCTERC基因擴增發(fā)生率（基因擴增發(fā)生率（% %）4.2-10.64.2-10.626.826.865.465.483.183.193.593.5hTERC檢測臨床意義o 伴有hTERC基因擴增的癌前病變的病人有52%96%的惡變可能。 o 可預測CIN1/CIN2 向CIN3發(fā)展的風險因素，其靈敏度是100% ， 特

7、異性是 70%. o FISH是早期診斷和風險預測的有效手段(AJP April 2005, Vol. 166, No. 4)ohTERChTERC基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病變診斷中有重要價值病變診斷中有重要價值n魏麗惠，李亞里，吳瑞芳，陳忠，屠錚，江靜，李靜然o北京大學人民醫(yī)院婦科，北京，中國o中國解放軍總醫(yī)院婦科，北京，中國o北京大學深圳醫(yī)院婦產科，深圳，中國o猶他大學醫(yī)學遺傳學科，鹽湖城，美國o該研究顯示，采用FISH技術檢測hTERC基因擴增可在宮頸細胞學玻片上進行，具有無創(chuàng)性和客觀性的特點，敏感度和特異度高，在宮頸癌和宮頸癌前病變的診斷中有重要價值。hTE

8、RC基因的異常擴增可能成為宮頸病變惡性進展的早期標記物。o北京協(xié)和醫(yī)院郎景和教授點評：北京協(xié)和醫(yī)院郎景和教授點評：n在液基細胞學檢查和檢測人乳頭狀瘤病毒篩查宮頸癌的同時，檢測hTERC基因，有望成為協(xié)助宮頸癌和宮頸癌前病變診斷及預測癌前病變是否向子宮頸癌發(fā)展的重要指標，而造福廣大婦女。細胞癌變細胞癌變阻止細胞正常凋亡阻止細胞正常凋亡高危型高危型HPVHPV持續(xù)性感染持續(xù)性感染人類染色體端粒酶基因人類染色體端粒酶基因(hTERC)(hTERC)擴增擴增致癌基因致癌基因E6/E7E6/E7編碼的原癌蛋白表達編碼的原癌蛋白表達TERC基因的擴增可阻止細胞凋亡，導致腫瘤產生 P16P16表達表達E7結

9、合結合RBE6結合結合p53o 隨著宮頸病變級別增加，hTERC的陽性率增加o hTERC陽性率n 正?；蜓装Y組 4.2-10.6%n CIN1組 26.8% n CIN2組 69.23%n CIN3組 83.58%n 宮頸癌組 95.65% 正常及正常及CIN1CIN1的的hTERChTERC基因陽性率明顯低于基因陽性率明顯低于CIN2CIN2及以上者，及以上者，P P 0.010.01 o hTERC診斷CIN2或CIN2以上病變n 敏感度 81.40%n 特異度 95.04%n 陽性預測值 70.00% n 陰性預測值陰性預測值 97.29%97.29% Human Papilloma

10、Virus(HPV)o 環(huán)狀雙鏈DNA病毒o 超過120種亞型o 其中的72種亞型可引起肛門及生殖器疾病o Low risk (LR-HPV): 6,116,11,40,42,44,54,61,70,72,81,40,42,44,54,61,70,72,81o High risk (HR-HPV): 16,18,16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,731,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,828,82 HPV的生物學狀態(tài): 游離或整合o 在HPV感染的早期或瞬間感染，HPV基因組以游離的環(huán)狀DNA形式存在于宿主細胞核中。

11、 (Condyloma and CIN-1)o 持續(xù)的HPV感染，使其DNA整合進宿主DNA，標志著惡性轉化。 (CIN2lesions)o 持續(xù)性的HPV感染幾乎總是發(fā)生在兩種上皮的交界處（宮頸移行帶、肛門和口咽）o HPV通過宮頸鱗腺交界處感染基底細胞o 或HPV通過微創(chuàng)傷直接感染基底細胞HPV 檢測及預后預測價值o 陰性預測價值(NPV)約 99%n women not infected with HR-HPV have 1% chance to have HSIL lesiono 陽性預測價值(PPV) 根據患者的年齡:n 30: PPV gradually increased wit

12、h age and persistent HPV infection原為雜交法o 用標記的HPV探針在組織上或細胞上進行原位的雜交，并進行顯色o 特異性最強o 敏感性高o 直觀o 可結合組織學或細胞學形態(tài)o 探針有：6/11, 16/18, 31/33導流雜交法o 擴增所取樣本的DNAo 放在固定好基因探針的基因芯片上（21種亞型包括13種高危亞型16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,68及5種低危亞型6, 11, 42, 43,44和3種中國人群常見的亞型53,66,CP8304型進行雜交o 探針標記Biotin及堿磷酶o 用NBT/B

13、CIP進行顯色o 結果呈藍紫色o判定標準判定標準RLU/CutoffRLU/Cutoff 的比值的比值 n 1 = 1 = 陽性陽性, 50, 50以內的數值對病情的嚴重程度并沒有指示性，以內的數值對病情的嚴重程度并沒有指示性，但但5050的數值對病情的嚴重程度的估計有指導意義。的數值對病情的嚴重程度的估計有指導意義。n 1 =1 =陰性，表示未檢出陰性，表示未檢出1313種高危型種高危型HPV DNAHPV DNA序列或標本中不含序列或標本中不含有高危型有高危型HPV DNAHPV DNA序列，又或者其濃度水平在測定方法的檢測限序列，又或者其濃度水平在測定方法的檢測限度以下，不能除外潛伏感染

14、；度以下，不能除外潛伏感染；n 如果接近但小于如果接近但小于1.01.0且被懷疑有高危型且被懷疑有高危型HPVHPV感染，應該重新采集感染，應該重新采集標本。標本。 HC-II的應用條件o HPV test 不適用的情況：n 細胞學顯示異型增生時n 年齡30歲的女性,細胞學檢查結合HPV testHPV檢測方法的比較原位雜交導流雜交基因捕獲HC-II原理在原位進行HPV DNA的雜交提取DNA進行PCR，進行膜雜交DNA分解，DNA-RNA雜交，抗體捕獲，特點組織學及細胞學涂片上原位顯示分型HPV具體分型顯示HPV,無病毒負荷的提示只顯示高危病毒感染，不具體分型，可提示病毒的負荷敏感性及特異性

15、敏感性+特異性+敏感性+特異性+敏感性+特異性+取材組織或細胞涂片陰道分泌物陰道分泌物生物傳感器技術o 24種HPV亞型，其中低危8種（ 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 70 ），高危16種（ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ,81 ）o 可檢測HPV的載量o 子宮頸細胞中HPV的情況 單獨感染 混合感染（2、3，6種HPV型）子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV檢出率1(導流雜交）病毒種類1HR-HPV檢出率2（HC-II)尖銳濕疣92%6,11,31,52低級別CIN89%16,31

16、,18,52,33,6,1174.93%高級別CIN100%16,33,52,1891.72%鱗狀上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科2.解放軍總醫(yī)院婦產科CIN中需注意的問題o CIN病變也可表現為鱗狀上皮的表面上皮顯著的不典型增生，而非基底層細胞，是CINI的病理基礎o CIN病變累及腺體n 一般：鱗狀上皮CINIII，進一步向下發(fā)展延伸至腺體，但未突破基底膜n 少數：鱗狀上皮CINII，腺體鱗化也呈CINII，這時為表達腺體的改變，診斷為CINII累及腺體n 個別：在腺體鱗化的基礎上出現不典型增生，甚至出現的不典型增生的程度超過表面鱗狀上皮絕大多數的HP

17、V感染可回退Cancer持續(xù)性HPV感染導致CIN2-3 o LSIL LSIL 一般由瞬間一般由瞬間HPVHPV感染引起感染引起o HSIL HSIL 發(fā)生在那些持續(xù)性發(fā)生在那些持續(xù)性HR-HPVHR-HPV感染感染2 2年以上的年以上的患者患者o 大多數年輕的女性大多數年輕的女性(30 yrs)(30 yrs)的的HPVHPV感染為暫時感染為暫時性的，將被自體免疫系統(tǒng)清除性的，將被自體免疫系統(tǒng)清除o HPVHPV持續(xù)性感染一般發(fā)生在老年女性持續(xù)性感染一般發(fā)生在老年女性HPV感染與機體免疫反應o 陰道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗體，酸性環(huán)境及鋅離子等組成第一道防線o 子宮頸鱗狀上皮（復層上皮

18、）形成天然屏障，組成第二道防線o 內在的非特異性免疫防御系統(tǒng)即炎癥反應，構成第三道防線o 局部的細胞免疫監(jiān)視，可啟動接觸性級連反應，放大傳遞信號，形成針對殼蛋白L1的特異性細胞免疫反應o 大多數的HPV感染細胞將成為HPVL1抗原遞呈細胞；細胞毒T淋巴細胞和輔助T淋巴細胞可識別此細胞，并通過免疫監(jiān)視和免疫清除殺滅細胞CytoReacto 用敏感的非同位素核酸雜交和免疫組織化學及免疫細胞化學的方法檢測子宮頸細胞中HPV L1 蛋白的存在，可用于細胞學涂片，組織學切片的檢測。o 廣譜的HPV L1抗體可識別大多數的HPV L1蛋白（ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 5

19、2, 56，58）。 基本原理特點o 多聚物微球結合非同位素標記HPVL1DNA探針與多聚酶混合物（固態(tài)雜交液）o 解鏈及雜交過程與抗原修復過程合并o 標記物為堿性磷酸酶，底物為AECo 原為雜交與免疫組化反應顏色重疊，提高敏感性20-30倍o 可檢測出0.01pgHPV L1蛋白o 細胞核陽性表達（核膜及核）o HPV L1HPV L1的存在表明的存在表明HPVHPV病毒感染處于游離狀病毒感染處于游離狀態(tài)或瞬時感染期態(tài)或瞬時感染期o 在在 HPV(+) HPV(+) 的病人中，的病人中，HPV L1HPV L1的缺失，提的缺失，提示存在示存在HPVHPV的持續(xù)感染，并有向高級別的持續(xù)感染，并

20、有向高級別CINCIN發(fā)展的趨勢發(fā)展的趨勢HPV L1檢測的臨床意義 p16檢測的意義o p16是cyclin依賴性激酶抑制劑，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增強RB的功能，抑制E2F-1的釋放，從而抑制細胞周期o E7結合RB，釋放E2F-1，促使細胞周期o E2F-1的聚集（RB的磷酸化的結果）導致p16的增加o p16的高表達提示HPVE7的存在小小 結結o臨床常用的HPV檢測方法（HC-II，導流雜交）n陰道小環(huán)境的HPV感染狀況n間接代表子宮頸HPV感染狀況n不知HPV的生物學存在狀況o生物傳感儀檢測子宮頸組織和細胞中的HPV類型oTERC基因擴增表明細胞

21、的增殖活性增強，提示病變向惡性發(fā)展的原動力存在op16的檢測可提示HR-HPV感染，并整合宿主DNAo子宮頸組織和細胞中HPV L1檢測陽性，提示機體免疫可清除HPV病毒感染細胞，使CIN病變向良性發(fā)展u 液基薄層細胞制片技術n真空負壓吸引，膜式采集技術n重力沉降技術n離心沉降技術n其他u 特點：n標本保存時間長，更完整，結構更清晰n細胞數量更多n細胞平鋪，不重疊n更利于觀察，不易漏觀察n可重復制片u應用范圍：1.子宮頸細胞學檢查2.體液細胞學檢查（胸腔積液、腹腔積液、尿液、腦脊液及灌洗液等）3.分泌物細胞學檢查（痰液）u優(yōu)勢：明顯提高陽性細胞檢出率u前提：具備豐富診斷經驗的病理醫(yī)師是關鍵國外

22、細胞學醫(yī)師需要獲得醫(yī)師資格證、病理醫(yī)師資格證以后，再經過2-3年的?？婆嘤柌拍軓氖录毎麑W診斷，并擔負相應法律責任國內正在規(guī)范，從事細胞學診斷必須有醫(yī)師資格證并注冊到病理診斷o 1988年，美國國家癌癥研究所在馬利蘭州的Bethesda召開了病理細胞學會議，提出子宮頸細胞學報告的新分類，即Bethesda報告系統(tǒng)（The Bethesda System,TBS）The Bethesda system for Reporting Cervical Cytology(TBS)o根據根據20012001年第三屆國際年第三屆國際BethesdaBethesda工作會議要求工作會議要求o由著名細胞病理學家由著名細胞病理學家SolomonSolomon和和NayarNayar編著編著