纖維素酶發(fā)酵

1、纖纖維素酶發(fā)酵維素酶發(fā)酵汪其林維素酶發(fā)酵維素酶發(fā)酵纖維素酶是一類能水解纖維素成簡單糖的復(fù)合酶，它主要包括葡聚糖內(nèi)切酶（EG）、葡聚糖外切酶（CBH）和 -葡萄糖苷酶（BG）。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化纖維素酶的分離純化三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化以稻草粉和麩皮為主要原料，對白腐菌（White-rot fungi）NS75、黑曲霉（Aspergillus niger）NS83 和絮凝酵母（Saccharomyces cerevisiae）SP5 混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行研究單菌發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶存在個別酶活低和酶系不完整的缺陷。如，綠色木霉以及

2、其近源的菌株發(fā)酵生成的纖維素酶中普遍存在著 -葡萄糖苷酶偏低的缺陷。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化來自不同菌株的纖維素酶酶系不一樣，通過混合菌發(fā)酵培養(yǎng)能夠彌補(bǔ)菌株間的不同，生成各種有著不一樣功能的混合酶，它們可以通過作用在纖維素的不同位點來發(fā)揮各種酶之間的協(xié)同作用，從而可以大幅度的提高纖維素酶的活性。黑曲霉產(chǎn) -葡萄糖苷酶能力較高，但產(chǎn)內(nèi)切和外切葡聚糖酶能力較低；白腐菌產(chǎn)內(nèi)切酶能力較高。選用白腐菌NS75和黑曲霉NS83 在稻草粉、麩皮為主要培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化在白腐

3、菌和黑曲霉混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的基礎(chǔ)上，接入絮凝酵母消耗發(fā)酵過程中酶解形成的纖維二糖、葡萄糖等簡單糖對多菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的作用，實驗考察了三菌混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的能力和主要酶種活力，并對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化1.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)將在斜面上培養(yǎng) 2-5d 的白腐菌、黑曲霉菌和絮凝酵母菌，分別制成約 107個/mL 的孢子或細(xì)胞懸浮液。分別取 1mL 接于 50mL 液體種子培養(yǎng)基中，于30、200r/min 培養(yǎng) 24h，白腐菌和黑曲霉雙菌發(fā)酵接種 6mL 于含有 10g 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL 的廣口瓶中；三菌混合發(fā)酵則保持接種總量

4、 6mL，白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母按 1:2:1.5（v/v/v）比例接種，接種后攪拌均勻，30恒溫培養(yǎng) 5-7d，單因素實驗每組 3 個平行。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化2.單菌、雙菌與三菌混合發(fā)酵產(chǎn)酶情況對比單菌發(fā)酵分別將 6mL 白腐菌或黑曲霉孢子液接入到裝有 10g 稻草粉、麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL 廣口瓶中；雙菌混合發(fā)酵則將白腐菌孢子液和黑曲霉孢子液按 1:2 體積比接種；三菌混合發(fā)酵則以白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母按 1:2:1.5體積比接種，接種總量保持 6mL。接種攪拌均勻后放于培養(yǎng)箱中 30恒溫培養(yǎng)發(fā)酵 8d，從第 3 天開始每天取平行

5、樣三瓶，分別檢測其 CMCase 酶和 -G 酶活。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化黑曲霉NS83 產(chǎn) -G 酶能力較強(qiáng)，在培養(yǎng)第 5 天時酶活達(dá)到 15254U/g，但產(chǎn) CMCase 較弱，酶活為 7063U/g。白腐菌NS75 產(chǎn) CMCase 能力較強(qiáng)，在培養(yǎng)第 5 天時酶活達(dá)到 11188U/g，但產(chǎn) -G 酶能力較弱，酶活為 6991U/g。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化雙菌培養(yǎng)時在第 5 天酶活達(dá)到峰值，其 CMC 酶活為 17894 U/g，-G 酶活為 22325U/g，比單菌發(fā)酵有明顯提高三菌混合培養(yǎng)

6、時，在第 7 天酶活達(dá)到峰值，其 CMCase 酶活和 -G 酶活分別為 30099U/g和 54326U/g；相較單菌、雙菌發(fā)酵，三菌混合發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶活更高，發(fā)酵產(chǎn)酶時間延長，且比較穩(wěn)定三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化其原因可能是接入絮凝酵母混合發(fā)酵后，消耗了可發(fā)酵的簡單糖，有助于降低培養(yǎng)基中葡萄糖、纖維二糖等對發(fā)酵菌纖維素酶合成代謝的反饋抑制作用，使得產(chǎn)酶菌處于更有利的環(huán)境下生長和代謝產(chǎn)酶。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化2. 變溫控制混合菌按白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母=1:2:1.5 比例接種，接種總量 6mL

7、。采用變溫發(fā)酵，考查溫度對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。實驗溫度控制按以下 5 種方式進(jìn)行：先 303 天后 284 天先 304 天后 283 天，先 303 天后 354 天先 304 天后 353 天一直 30培養(yǎng) 7 天，檢測測酶活，結(jié)果如圖三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化溫度控制方式所產(chǎn)的纖維素酶活較高，即溫度一直保持在 30時酶活較高。表明溫度震蕩可能是對白腐菌、黑曲霉和絮凝酵母協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)生不利影響。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化3.混合菌接種比例對產(chǎn)酶的影響接種比例為 1:2:1.5 時，發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活

8、相對較高。原因可能是在接入絮凝酵母混合發(fā)酵后，消耗了可發(fā)酵的簡單糖，從而降低培養(yǎng)基中葡萄糖、纖維二糖等對發(fā)酵菌纖維素酶合成代謝的反饋抑制作用，且黑曲霉在接入絮凝酵母消耗簡單糖解除反饋抑制作用后的環(huán)境中更易生長和產(chǎn)酶。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化4.絮凝酵母接入時間對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響發(fā)酵實驗培養(yǎng)開始時先按 1:2 體積比例接入白腐菌 NS75 和黑曲霉 NS83 孢子液，絮凝酵母種子液按 1.5 體積比（總體積保持 6mL）分別以 4 個發(fā)酵時間點接入：培養(yǎng) 0 天后接入絮凝酵母，培養(yǎng) 1 天后接入絮凝酵母，培養(yǎng) 2 天后接入絮凝酵母，培養(yǎng) 3 天后接

9、入絮凝酵母。于 30靜止培養(yǎng) 7 天，分別檢測酶活。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化在白腐菌和黑曲霉固態(tài)發(fā)酵 2 天后接入絮凝酵母發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶酶活明顯高于其他時間接入的纖維素酶發(fā)酵酶活；與時間點接入相比，可能因絮凝酵母接入早，且簡單糖吸收代謝能力強(qiáng)，生長快，消耗了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分而影響白腐菌和黑曲霉的前期菌體生長和產(chǎn)酶代謝，導(dǎo)致整個發(fā)酵過程產(chǎn)酶活力下降；在第個時間點接入絮凝酵母，此時可能發(fā)酵培養(yǎng)基中白腐菌和黑曲霉菌絲已長成，并且逐漸代謝纖維素酶和出現(xiàn)纖維素酶水解纖維素生成葡萄糖等簡單糖產(chǎn)生對菌體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的反饋抑制作用，接入絮凝酵母菌只對發(fā)酵過程的后

10、期發(fā)揮抑制解除作用，總體效果以時間點接入絮凝酵母為好。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化5.料水比對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響實驗在稻草、麩皮固料為 10g 的基礎(chǔ)上，料水比按 1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3 的比例加入 Mandels 營養(yǎng)液，混合攪拌均勻，接種后于 30恒溫培養(yǎng) 7d，分別檢測酶活，考查含水量對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化當(dāng)料水比在 1:2 時，CMCase 酶活和 -G 酶活都較高，說明混合菌發(fā)酵過程中，水分會影響菌體生長和酶的產(chǎn)生，水分過少或過多都不利。水分過多，會

11、影響透氣性，使培養(yǎng)基內(nèi)部供養(yǎng)和散熱困難，影響菌體生長和產(chǎn)酶；水分過少，則可能滿足不了菌種正常生長和代謝產(chǎn)酶的生理需要。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化6.稻草粉麩皮質(zhì)量比對混菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響實驗保持稻草、麩皮固料總量為 10g，稻草粉和麩皮質(zhì)量比按 8:2、7.5:2.5、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8 加入，接種后，于 30培養(yǎng) 7 天，檢測酶活。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化稻草粉和麩皮質(zhì)量比為 8:2 時，混合菌的產(chǎn)酶能力比較好。這樣的原因可能和稻草粉、麩皮的組成成分有關(guān)。麩皮中含有氧化酶、淀粉酶、

12、蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)，可以有利于菌體的生長；而稻草主要是含有木質(zhì)素、果膠、纖維素等物質(zhì)，這些物質(zhì)不利于菌體很好的利用，但是稻草所含的纖維素物質(zhì)能作為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)菌體生成纖維素酶。少量的麩皮可以使菌體的前期生長較好，而大量的稻草卻可以誘導(dǎo)菌體在中后期產(chǎn)生酶，當(dāng)?shù)静莘酆望熎べ|(zhì)量比為 8:2 時，CMCase 酶活達(dá)到 25690U/g，-G 酶活達(dá)到 59814U/g。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化7.三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對變溫控制、混合菌接種比例、絮凝酵母接入時間和料水比進(jìn)行4 因素3 水平正交設(shè)計實驗，分別測定CMCase 酶

13、活和-G 酶活，分別以 CMCase 酶活和 -G 酶活為考察指標(biāo)優(yōu)化產(chǎn)酶條件三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶最優(yōu)實驗組為第 4 組，即溫度為 30，接種比為 1:2:1.5，培養(yǎng) 2 天后接入絮凝酵母，料水比為 1:2。和極差分析得到的優(yōu)化組合 A2B1C2D3相符合，在這個組合下 CMCase 酶活達(dá)到 30241U/g，-G 酶活為 62305U/g。各個培養(yǎng)條件對混合菌發(fā)酵產(chǎn) CMCase 酶的影響順序為：溫度料水比菌種比絮凝酵母接入時間；而對產(chǎn) -G 酶的影響順序為：溫度菌種比料水比絮凝酵母接入時間。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)

14、發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化CMCase 酶活和 -G 酶活為優(yōu)化考查值所得的發(fā)酵產(chǎn)酶最優(yōu)條件一致，為溫度為 30，接種比為 1:2:1.5，培養(yǎng) 2 天后接入絮凝酵母，料水比為 1:2。由表 2.8、2.9 可以看出，溫度（A）對混合菌產(chǎn)酶的影響顯著。選擇溫度為 30，接種比為 1:2:1.5，培養(yǎng) 2 天后接入絮凝酵母，料水比為1:2 為混菌固體發(fā)酵條件，對正交實驗的結(jié)果進(jìn)行驗證，所得的三組平行實驗的CMCase 酶活分別為 30150U/g、30165 U/g 和30305U/g，平均值為 30206U/g。-G酶活分別

15、為 62954U/g、61878U/g 和 62095U/g，平均值為 62309U/g。與正交實驗直觀分析所得最優(yōu)條件所得值 CMCase 酶活 30241U/g 和 -G 酶活 62305U/g十分接近。三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條三菌混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化件優(yōu)化8.優(yōu)化結(jié)果（1）選取白腐菌 White-rot fungi NS75，黑曲霉 Aspergillus niger NS83 及絮凝酵母 Saccharomyces cerevisiae SP5 進(jìn)行混合菌發(fā)酵培養(yǎng)，通過單因素實驗以及正交實驗優(yōu)化，混合菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件為：溫度 30，接種比為 1:2:1.5，培養(yǎng) 2 天后接入絮凝