磁珠分選腫瘤干細胞操作規(guī)程

1、腫瘤干細胞的分選工作0 l2 e% ?- i( n4 r9 v( 一、消化4 _- t% a) c7 m t) j4 _0 b（1）取出腫瘤組織，低溫保存（離體組織冰上最多能保存多久仍可以用來分離cscs？）（2）pbs漂洗，盡可能去除血細胞; 9 b 6 g. w% b1 a（3）放在dmem/f12中盡量剪碎或剁碎組織3 w, z: g# - v$ 5 q+ r% p（4）用膠原酶和透明質(zhì)酸酶37c 搖床中消化一小時（透明質(zhì)酸酶是否必要？）5 w- h) - c4 l) l% r（5）慢速離心，去上清。dmem/f12混懸沉淀，% h5 s5 r+ r9 my+ i（6）過濾（請問40微米

2、篩是否可以？）。+ b9 x, q! q; g0 g! （7）濾液用histopague-1077去除紅細胞（據(jù)文獻報道，請問是否有必要？）% l l# q1 u) 3 w; _（8）離心，沉淀用無血清cscs培養(yǎng)液混懸。接著進行分選（請問細胞養(yǎng)一天影響大不大？）( n8 o% b0 g- 二、分選（據(jù)文獻看流行的做法是磁珠分選，再流式檢測純度）, t t# - 1 - v （1）負選：去除cd45標記的血干細胞及cd117、fap標記的間質(zhì)細胞（請問各位大俠是否做這一步？）9 ) j( : v0 r: c( w （2）正選目的細胞1 y+ u( j. uf)5 v9 s6 s- e7 b(

3、m5 x; j磁珠分選步驟g8 a# a7 ! r6 _試劑和設(shè)備：0 n3 y( x) i. d. c2 jbuffer：無ca，mg離子的pbs，ph 7.2, 含0.5%bsa，2mm edta, 是用automacs稀釋液（美天旎貨號130-091-222）稀釋macs bsa儲備液（130-091-376）制成，保持buffer冰冷（48），使用前脫氣，避免氣泡堵塞分選柱。+ 8 n5 7 o4 b一磁性標記2 z q% / iu1 m保持細胞冰冷，108或小于次數(shù)的細胞則使用下述體積試劑，磁性分選前獲取較佳的單細胞懸液，可以將細胞通過40um尼龍篩，去除可能阻塞分選柱的細胞團塊。高

4、溫和延長孵育時間會導致非特異性細胞標記。+ # k& a* g! w! p* p* w/ ) u1.細胞計數(shù)0 r9 w- o7 q3 |, n3 t- i9 k3 m4 e2 y, w2.300g離心細胞懸液，盡量去除上清, y; z9 s7 4 m: q- n3.用350 ul buffer重懸# w/ x+ _+ i q* o* n# o0 t# |4.加100 ul fcr 封閉試劑/ q& m6 g z: f) d; n5.加50 ul cd133/1(ac133)-biotin6 i) ( r4 e6 r% d5 h5 p6.充分混合后冷處孵育10分鐘（48）% 2 h5 h: z

5、9 b. w4 n7.加50ul pe連接cd133抗體（#130-090-853）遮光冰箱孵育5分鐘( i: k; i2 k( t8.用10-20倍標記樣體積的buffer洗細胞300g離心10分鐘。充分洗,去上清。( n7 q4 t2 t1 f9.重復清洗細胞5 g# c! x6 f7 d6 % 8 y10.用400ul buffer 重懸細胞5 / ; e( w/ : 11.加100 ul抗生物素微珠. p# # & l8 y* f2 e12.充分混合冰箱孵育15分鐘3 t- |* k) r* $ m( k13.用10-20倍體積buffer洗細胞并300g離心10分鐘，充分吸去上清 c

6、4 b7 # v: 14.用500ul buffer 重懸細胞 _2 s1 n5 r- , e15.繼續(xù)磁性分選步驟5 c7 l9 m9 h8 k二磁性分選1 n: k h+ ! 4 q& q8 o1.安裝分選柱+ z8 f$ a% b1 i3 ! j2.用500ul buffer沖洗分離柱# r) a o2 i# o& d; o3.細胞懸液上柱6 u. g! m, l0 b k, s4.收集過柱的未標記細胞，用適量buffer洗柱子，洗三次，每次等柱內(nèi)buffer流干再加，ms柱：3500ul， 收集總流出液。這部分就是未標記細胞組分; s2 n. ) y% q$ d- s9 _ l* u5

7、.將ms柱從分離器上取下，放在新收集管上. |+ 5 r/ u9 r8 n/ ?6.加1ml buffer 到分離柱中，立即用活塞堅定地吹洗出磁性標記的細胞& q! q8 _* # k/ c2 0 c, c7.要想進一步純化cd133細胞，洗出的細胞可再次上柱，即用新分離柱重復16步驟注意：所有過程在超凈臺和冰上進行以保證細胞活力: s1 _, r5 q7 r. t/ f; t1用冰預冷的macs buffer 重懸108膠質(zhì)母細胞瘤細胞7 c, m0 ) x2用冰預冷的macs buffer 洗幾次: ) y/ q q: g/ h34下在90ul 冰預冷的macs buffer中用pe連接的

8、cd133抗體10ul 與5105細胞結(jié)合30分鐘（抗體濃度需要被調(diào)整） 2 ?9 k h- e4用macs buffer洗幾次細胞! r# o b& q4 o* x0 l6 ? n5 4用微珠連接的抗pe的抗體處理細胞30分鐘（20ul微珠連接pe抗體/5105在80ul冷macs buffer中）7 p9 c j1 s/ n0 q i1 s 9 r6用冷macs buffer洗幾次細胞1 q2 n- q |u; . s l7用500ul 冷macs buffer重懸抗體黏附的膠質(zhì)母細胞瘤細胞 u4 -8附圖，準備ms柱2 c! a( f$ z; n( 9細胞懸液上柱. m% w n( z c7 p10收集過柱的未標記細胞，用500ul 冷macs buffer 洗ms柱三次，每次當柱內(nèi)積液干時加buffer，收集總流出液為未標記細胞部分2 v7 ?; t, a6 c1 u+ i%