熒光抗體技術(shù)

1、第二節(jié) 熒光抗體技術(shù)一、熒光抗體的制備（一）抗體的熒光素標記用于標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應(yīng)含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取igg后再作標記。作為標記的熒光素應(yīng)符合以下要求：應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價健的化學(xué)基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。標記方法簡單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。常用的標記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以 fitc 標記為例，攪拌標記法為：先將待標記

2、的蛋白質(zhì) 溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入fitc溶液，在室溫持續(xù)攪拌 46h后，離心，上清即為標記物。此法適用于標記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點是標記時間短， 熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當會引起較臺強的非特異性熒光染色。透析法適用于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含 fitc 的 0.01mol/lph9.4 碳酸鹽緩沖液中反應(yīng)過夜，以后再 對 pbs 透析法去除游離色素。低速離心，取上清。標記完成后，還應(yīng)對標記抗體進一步純化以去除未結(jié)合

3、的游離熒光素和過多結(jié)合熒光素的抗體。純化方法 可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。二）熒光抗體的鑒定熒光抗體在使用前應(yīng)加以鑒定。鑒定指標記包括效價及熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率?？贵w效價可以用瓊脂雙擴散法進行滴定，效價大于1:16者較為理想。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率（f/p）的測定和計算的基本方法是：將制備的熒光抗體稀釋至a28o1 1.0，分別測讀a28o （蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰,按公式計算。按公式計算。圖3-8RB200標記抗體反應(yīng)（三）四甲基異硫氰酸羅達明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC )它是一種紫紅色粉末， 較穩(wěn)定。其最大

4、吸收光譜為 550nm ,最大發(fā)射光譜620nm ,呈橙紅色熒光，與FITC 的黃綠色熒光對比清晰（圖3-9），與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同 TITC。它可用于雙標記示蹤研究。化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下（圖 3-10 ）。圖3-9 TMRITC在可見光區(qū)的吸收光譜和發(fā)射光譜熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加O.OImg圖3-10 TMRITC結(jié)構(gòu)式、熒光素標記抗體的方法（一） FITC標記抗體的方法1. Marsshall 氏法（1）材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol/LpH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（2550ml ）、冰及冰槽（或1000ml燒杯

5、）、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml八 pH7.2或8.0的 0.01 mol/L PBS 等。（2）方法及步驟： 抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不 起泡沫為宜）510min熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。結(jié)合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約510min內(nèi)加完），加畢后，繼續(xù)攪拌 1218h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于

6、4C左右，故須及時添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在 透析：結(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液離心（后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（04C）過夜。 過柱：取透析過夜的標記物，過葡聚糖凝膠行鑒定（圖3-11，圖-3-12 ）。4 C冰箱或冰庫中。2500r/min ） 20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進圖 3-11 Sephadex G-25 對 FITCuHi $.一一一-說陽.o12It何f h圖 3-12FITC與家兔IgG球蛋白在25 C和2C時結(jié)合的動力學(xué)（Kawamura1964 )洗脫液：0.01mol/L磷酸鹽緩

7、沖液（pH7.2 ）;過濾量:12ml標記全球蛋白液（過濾前未透析）;收集量:20ml（稀釋1.7倍）。分別以1mgFITC 溶于2份1mol0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖液（分別為pH9.5和pH9.0 ），于2C下攪拌將其各加入 100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2C下，另一半置 25 C下。間隔一定時間后各取出 0.5ml 通過 sephadexG-25去游離FITC，由上計算出5mg家兔IgG結(jié)合的FITC量。2. Chadwick 氏法1）材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、 0.01mol/LPh8.0 磷酸鹽緩沖鹽水、

8、 1%硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶（ 25ml ）、冰槽、無菌吸管及毛細滴管、 燒杯（ 500ml ）、透析袋、棉線、玻棒等。（2 ）方法及步驟： 抗體準備：用o4CpH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為3040mg/ml，置入三角燒瓶內(nèi)，放于冰槽中。 熒光色素準備：按每毫克蛋白加入熒光素 0.01mg計算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶 解。 將準備之抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在04C,冰箱中結(jié)合1824h。 透析和柱層析：方法同 Marshall氏法。3改良法（ 1963 年） 根據(jù) Marshall氏法取高價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水

9、（ 0.15mol/LNaCl ）及緩沖液（ 0.15mol/LNaHC03 -la2CO3 PH9.0 ）稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白10mg,緩沖液為總量的10%，降溫至4C,加入異硫氰酸鹽熒光素，（蛋白：熒光素 =5080mg:1mg ），在04C下電磁攪拌1214h。然后用半飽和和硫 酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用0.01%,Nessler 氏試劑測驗至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素為止）。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4C）可以用半年以上，-20C保存可達2年以上?！靖揭弧?0.01mol/L pH7.2

10、 PBS 配法： NaCl18g 、 Na2HPO41.5g 、 KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸餾水中，校定 pH至7.2?！靖蕉?0.5mol/L pH9.0 碳酸鹽緩沖液配法：取 0.5mol/LNa2CO3（5.3%）10ml 加入 0.5mol/LNaHCO3（4.2%）90ml, 混合后，校定 pH 至 9.0。【附三】 3%重碳酸鈉水溶液配法：稱 1.5g 無水重碳酸鈉充分溶解于 50ml 滅菌蒸餾水中即成。4透析標記法此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。（1 ）用 0.025mol/L 碳酸鹽緩沖液 pH9.0 ，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1%濃

11、度，裝入透析袋中。（2）用同一緩沖液將 FITC 配成 0.1mg/ml 的溶液，按 1 %球蛋白液體積的 10倍，將 FITC 稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4C電磁攪拌下，透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用sephadex G-50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝、貯存于4C中（圖3-13 ）-圖3-13 標記抗體溶液通過 sephadex產(chǎn)膠柱層析分布（二）四乙基羅達明標記抗體方法取 1g RB200 及 PCL52g放在乳缽中研磨5min （在通風(fēng)櫥中）。然后加入 10 ml無水丙酮，放置5min，不斷攪拌。過濾，用濾液進行標

12、記抗體剩余部分吸附在濾紙上，4 C干燥保存。取抗體（20mg/ml ）每毫升加入生理鹽水和 0.5mol/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液各1ml稀釋。逐滴加入0.1mlRB200溶液，邊加入邊攪拌，在04C中結(jié)合1218h，再用生理鹽水透析 57h，經(jīng)葡聚糖凝膠 G-50柱層析，除去游離熒光素，分裝，貯存于4C備用三）四甲基異硫氰酸羅達明標記抗體方法1 ) IgG10ml (6mg/ml) 在 0.01mol/L pH9.5 碳酸鹽緩沖液中透析過夜。（2）將四甲基異硫近氰酸羅達明（每毫克IgG加入520卩g）溶于二甲亞砜（1mg/ml ）,取此溶液300卩l(xiāng)，一滴一滴加入蛋白質(zhì)溶液中，同時電磁攪

13、拌。（3）在室溫中攪拌2h，避光4 ）把結(jié)合物移入直徑 3 cm, 高 30cm 大小的 Bio-Gel P-6 層析柱(用 0.01mol/L pH8.0 的 PBS 平衡過），流速為 1.5ml/min（5）收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標記抗體，分裝，4C保存?zhèn)溆盟模┰寮t蛋白標記抗體的方法1 巰基化藻紅蛋白（ phycoerthrinPE)的制備，600卩的15.5mg/ml 鹽酸巰醇亞胺( iminothiolanehydrochloride )加到1.2ml 的 3.6mg/ml 的 PE 中，和 1.2mlPB 、pH6.8 混合，裝入透析袋置入 50mmol/LpH6.8 PB中透

14、析，4C過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個PE分子中可結(jié)合8個巰基。2PE-IgG 制備 異雙功能試劑 SPDPN-Succ - inimdyl 3-(2- pyridyldlthio) propinate 30卩 l(1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入 700卩啲4.2mg/mlIgG PB 溶液( 50mmol/LpH7.5 )，在室溫中反應(yīng) 2.5h。再加入巰基化 PE400 11 l 1.7mg/ml )加到500 gl反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h，加入100 gl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，用PB透析過夜，4C。加入0.01%Na3N3分裝，4C保存半年。(五)PE

15、-標記蛋白A方法1）取 4.08mgPE 溶于 0.1mol/L pH7.4PB （含 0.1mol/LNaCI ） 1ml中，溶解后，取出 0.5ml，再加入10卩ISPDP無水甲醇液（2.65mg/ml ） ,SPDP/蛋白摩爾比為10， 22 C 反應(yīng) 5min，過 SephadexG-50（1 x 17cm）,用 100mmol/LpH7.4 PBS （含 0.1mol/LNaCl ）平衡和洗脫。（2） 0.5ml 蛋白（ 2mg/ml ） 100mmol/LPB（含有 100mmol/LNaCl） pH7.4，加入 2.6 卩止述 SPDP 甲醇液，SPDP :蛋白=9.5,22 C

16、 ,40min，加入25卩mol/L二硫蘇糖醇（DTT ） pH7.4緩沖液，22 C，25min，同上過 SephadexG-50 ，收集蛋白 A 峰。（3 ）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22 C反應(yīng)6h，混合物4C保存?zhèn)溆?。以上兩種 PE 標記制品，可最后溶于 0.01mol/LpH7.4PB（ 含有 0.1mol/LDETA 、1mol/L 碘乙酰胺、 1%BSA 和 0.1%NaN3),0 5C保存六）藍色熒光素標記抗體方法Kbaffan 等（ 1986 ）首先創(chuàng)立了藍色熒光素標記和染色技術(shù)，可進行雙標記或多標記1）取 7-氨基 -4-甲基香豆素（ 7

17、-amino-4-methyl coumarin, AMC ) 260 溶于二甲亞砜 25卩中2 ）將上液加入 10mlIgG的 巴比妥緩沖液（0.5mol/L,pH8.5,內(nèi)含50100mgIgG ）中，室溫反應(yīng) 2h，過SephadexG-50 除去游離熒光素AMC 呈黃色結(jié)晶固體，最大吸收波長 354nm, 最大熒光波長 430nm三、熒光抗體質(zhì)量控制對制備的熒光抗體必須進行質(zhì)量鑒定，主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。一）染色特異性和敏感性的測定1 特異性染色效價的測定直接染色以倍比稀釋熒光抗體溶液如1 : 2, 1 : 4, 1 : 8，與相應(yīng)抗原標本作一系列染色，熒光強度在“ +

18、”的最大釋釋度，即為該熒光抗體的染色滴度（效價）或單位。實際染色應(yīng)用時，可取低一個或兩個稀釋度（即24個單位），如染色效價為 1 : 64，實際應(yīng)用時可取1 : 32或1: 16。間接染色效價可按抗核 抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強度“+”為標準，染色用效價和直接法相同。2非特異性染色測定根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結(jié)果在標本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色滴度，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的 方法處理熒光抗體。3. 吸收試驗在熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4C中過夜，3000

19、r/min,離心 30min ，收集上清液，再用以染相應(yīng)抗原陽性標本，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽性熒光。4. 抑制試驗如前述。（二） F/P 比值的測定F （熒光素）和P （抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為12。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，降低敏感性。1. 蛋白質(zhì)定量測定熒光抗體的蛋白質(zhì) mg/ml 量。2. 結(jié)合熒光素定量先制作熒光素定量標準曲線，即準確稱取 FITC1mg, 溶于 10ml0.5mol/L pH9.0 碳酸鹽緩沖液中，再用 0.01mol/LPH7.2PBS稀釋到100ml，此時熒光素含量為10卩g/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液,用分光光度計在490nm波長測定光密度值（OD），以光密度為縱坐標，熒光素含量為橫坐標，作標準函 數(shù)圖熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移約 5nm,FITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?493495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?595nmF/P比值的計算：可按以下公式計算。HKHOC -Hl 比