動物細(xì)胞培養(yǎng)

1、重慶大學(xué)研究生專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)驗(yàn)報告書實(shí)驗(yàn)課程名稱： 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師：羅慶學(xué) 院：生物工程學(xué)院專業(yè)及類別： 生物學(xué)（學(xué)術(shù)）學(xué) 號：20161902017t姓 名：何英實(shí)驗(yàn)日期：2016/11/01成 績：重慶大學(xué)研究生院制動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握動物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。2、學(xué)習(xí)并掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)的方法。3、學(xué)習(xí)并掌握用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）：細(xì)胞在體外條件下生長，細(xì)胞不再形成組織。動物細(xì)胞培養(yǎng)（animal cell culture）就是從動物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞（使用胰蛋白

2、酶或膠原蛋白酶）然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。由于細(xì)胞具有生長和自我復(fù)制的能力，為細(xì)胞體外培養(yǎng)和研究提供可能。動物細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)（primary culture）即直接從動物機(jī)體分離、獲得組織細(xì)胞，在無菌條件下，用胰蛋白酶消化或機(jī)械分散等方法，將動物組織分散成單個細(xì)胞開始首次培養(yǎng)長出單層細(xì)胞的方法。傳代培養(yǎng)（subculture）當(dāng)細(xì)胞生長增值達(dá)到一定密度，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化分散成單細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)的方法。 高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)的功能活動是十分困難的，但如果把或細(xì)胞拿到體

3、外培養(yǎng)、增殖并進(jìn)行觀察和研究，則方便簡單的多。被培養(yǎng)的動物細(xì)胞是非常好的實(shí)驗(yàn)對象和實(shí)驗(yàn)研究材料，對體外培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行研究可以幫助人類探索防治各種疾病途徑和機(jī)制，也可以人為地誘導(dǎo)和改變細(xì)胞的遺傳性狀和特性，因此，動物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)是研究細(xì)胞分子機(jī)制非常重要的實(shí)驗(yàn)手段，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、基因工程等研究領(lǐng)域。三、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)設(shè)施及材料1、細(xì)胞培養(yǎng)室無菌操作區(qū)：只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其它無菌操作，與外界隔離。孵育區(qū)：培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37，5%CO2。制備區(qū)：培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用液體的制備，液體制備后應(yīng)該在凈化工作臺進(jìn)行過濾除菌。儲藏區(qū)：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。清洗區(qū)和消毒滅菌區(qū)：清洗區(qū)為相

4、對污染區(qū)，消毒滅菌區(qū)與清洗區(qū)分開。2、細(xì)胞培養(yǎng)常用基本設(shè)施：熒光顯微鏡、超凈工作臺、孵箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒溫水浴槽、濾器等。細(xì)胞培養(yǎng)常用器皿：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿，玻璃瓶、吸管，離心管、凍存管，注射器，燒杯、量筒等。3、細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗、消毒新玻璃器皿要用5%稀鹽酸浸泡，以中和其表面堿性物質(zhì)：刷洗：硫酸清潔液浸泡：濃硫酸+重鉻酸鉀+蒸餾水；沖洗：流水沖洗15-20次，蒸餾水沖洗3次，三蒸水漂洗1-3次。所有需滅菌的器械、物品滅菌前均需包裝，防止滅菌后污染。使用時放入超凈工作臺后打開包裝。消毒滅菌：高壓蒸汽滅菌（120，20min）；紫外線消毒：主要用于實(shí)驗(yàn)室房間空氣

5、及操作臺。四、實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基1、實(shí)驗(yàn)材料：超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酒精燈、吸管、鑷子、PBS、0.25%胰酶、DMED高糖和1640培養(yǎng)基、胎牛血清、G2細(xì)胞、GLL19細(xì)胞、水浴鍋。2、培養(yǎng)基：維持體外細(xì)胞培養(yǎng)生存和生長的溶液。（1）DMED高糖培養(yǎng)基：DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。與MEM比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。（2）1640培養(yǎng)基：RPMI是Roswell Park Me

6、morial Institute的縮寫，代指洛斯維帕克紀(jì)念研究所。 RPMI是該研究所研發(fā)的一類細(xì)胞培養(yǎng)基，1640是培養(yǎng)基代號。其中含有10%胎牛血清。五、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件（1）無菌、無毒的環(huán)境：對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行無菌處理，通常還要在培養(yǎng)液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物累積對細(xì)胞自身產(chǎn)生危害。 （2）營養(yǎng)物質(zhì)：無機(jī)物（無機(jī)鹽、微量元素等），有機(jī)物（糖、氨基酸、促生長因等） 血清和血漿， 但血清和血漿不是營養(yǎng)物質(zhì)。 （3）溫度和PH：36.50.5，7.2-7.4。所需要的特殊條件：（4）血清：動物細(xì)胞離體培養(yǎng)常常需要血清。

7、最常用的是小牛血清。血清提供生長必需因子，如激素、微量元素、礦物質(zhì)和脂肪。在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要功能： 1提供維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物以及主要的低分子營養(yǎng)物等；2提供結(jié)合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)整改變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力；3有些情況下其結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用；4新生牛血清是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料、玻璃等培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子的來源；5構(gòu)成緩沖系統(tǒng)，調(diào)節(jié)酸堿平衡；6提供蛋白酶抑制劑，在細(xì)胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害；（5）支持物：大多數(shù)動物細(xì)胞有貼壁生長的習(xí)慣。離體培養(yǎng)常用玻璃、塑料等作為支持物。（6）

8、氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不斷進(jìn)行調(diào)節(jié)，不斷維持所需要的氣體條件（95%的空氣+5%的CO2混合氣體），其中5%CO2氣體是為保持培養(yǎng)液的PH穩(wěn)定。六、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)Hep.G2細(xì)胞來源于15歲白人的肝癌組織，形態(tài)為上皮形，多成梭形或多角形，細(xì)胞膜完整無缺損，胞體豐富飽滿，核膜完整，染色質(zhì)均勻分散，密度一致。用的培養(yǎng)基為DMED高糖培養(yǎng)基，消化時間為2-3min。GLL19人黑色素瘤細(xì)胞，較細(xì)，呈長梭形，細(xì)胞膜完整無缺損，胞體豐富飽滿，核膜完整，染色質(zhì)均勻分散，密度一致。所用培養(yǎng)基為1640、消化時間為1min。2、動物細(xì)胞傳代（1）培養(yǎng)皿中的細(xì)

9、胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時要傳代；（2）準(zhǔn)備好所需材料，先將手及超凈工作臺用酒精消毒，點(diǎn)燃酒精燈，將滴管用火焰燒，將PBS、培養(yǎng)基、胰酶準(zhǔn)備好，要避免滴管交叉污染；（3）將培養(yǎng)基噴酒精消毒，拿入超凈工作臺，用滴管把原有培養(yǎng)基吸掉；（4）加入PBS吹洗培養(yǎng)皿（由于培養(yǎng)基中血清對胰酶消化有抑制作用，所以先用PBS洗），不要使勁吹，細(xì)胞貼壁不好，然后吸出PBS；（5）加入適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福ㄊ钩蓡渭?xì)胞懸液），消化30s，可快速在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，吸出胰酶；（6）加入含有血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化，用滴管吹打細(xì)胞，讓細(xì)胞懸浮起來；（7）根據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個培養(yǎng)皿中，一般癌細(xì)胞分5個，正常細(xì)胞

10、傳3個，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)；（8）把超凈工作臺消毒收拾干凈，將用過的滴管拿出超凈工作臺。七、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析1、以下圖片是用顯微鏡觀察到的G2細(xì)胞株和GLL19細(xì)胞株。G2細(xì)胞株從圖片可看出，G2細(xì)胞株為形狀不一的多邊形，細(xì)胞胞質(zhì)飽滿。GLL19細(xì)胞GLL19細(xì)胞較細(xì)，呈長梭形，細(xì)胞膜完整無缺損，胞體豐富飽滿，核膜完整，染色質(zhì)均勻分散，密度一致。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%乙醇擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完

11、畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以70%乙醇擦拭無菌操作臺面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株的操作。2、無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。驗(yàn)用品以70%乙醇擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3、小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，不要在打開的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。4、實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行