實體腫瘤的微環(huán)境蛋白質(zhì)組研究0

1、 項目名稱： 實體腫瘤的微環(huán)境蛋白質(zhì)組研究 起止年限：依托部門：徐寧志 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所 2011.1至2015.8 衛(wèi)生部 首席科學(xué)家： 二、預(yù)期目標1總體目標本項目研究的總體目標是，系統(tǒng)分析結(jié)腸癌的體外和體內(nèi)模型中腫瘤微環(huán)境的分泌蛋白質(zhì)組，揭示分泌蛋白質(zhì)對巨噬細胞、成纖維細胞和結(jié)腸上皮細胞的基因表達和功能影響，深入探討腫瘤微環(huán)境中分泌蛋白質(zhì)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程的作用機制。本項目將通過多種細胞共培養(yǎng)體系和蛋白質(zhì)組分析獲取結(jié)腸癌微環(huán)境中四種主要細胞相互作用所產(chǎn)生的分泌蛋白質(zhì)組；將采用標記或非標記的蛋白質(zhì)組方法，準確測定不同的細胞類型對于細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的總分泌蛋白質(zhì)的定量貢獻；將運用微環(huán)

2、境的分泌蛋白質(zhì)信息，研究它們在結(jié)腸上皮細胞癌變、巨噬細胞和成纖維細胞功能異化過程中的分子作用機制；將有效整合小鼠動物模型與細胞模型的分泌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，發(fā)展檢測腫瘤相關(guān)的生物標記物的測定方法。通過本項目的執(zhí)行，我們將全面系統(tǒng)地加深對于實體腫瘤微環(huán)境的分泌蛋白質(zhì)組的了解，革命性地改變傳統(tǒng)分泌蛋白質(zhì)組的研究方法，具體回答腫瘤微環(huán)境與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)問題。 2五年目標1) 針對腫瘤微環(huán)境研究，發(fā)展一整套多種細胞共培養(yǎng)的分泌蛋白質(zhì)的定量分析方法；2) 同一生物材料的背景下，系統(tǒng)研究腫瘤微環(huán)境相關(guān)細胞的蛋白質(zhì)組和生物學(xué)行為；3) 發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于臨床的結(jié)腸癌相關(guān)蛋白質(zhì)標志物和藥物靶標；4) 在國際主

3、流雜志發(fā)表論文30篇左右，申請發(fā)明專利5-10項；5) 造就一支具有綜合素質(zhì)隊伍，培養(yǎng)橫跨腫瘤基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、細胞生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的多方位科學(xué)人才。培養(yǎng)一批博士研究生10-15人，碩士研究生20-25人，博士后研究人員5-10人。 三、研究方案1. 學(xué)術(shù)思路實體腫瘤微環(huán)境是一個相當復(fù)雜的開放系統(tǒng)，如何合理簡化腫瘤微環(huán)境的相關(guān)因素是這個領(lǐng)域研究工作所必須考慮的關(guān)鍵問題。功能明確和細胞數(shù)量較多的腫瘤相關(guān)細胞是研究腫瘤微環(huán)境較為理想的候選細胞，例如腫瘤相關(guān)巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等。腫瘤微環(huán)境中各種細胞的主要通訊分子之一是存在于細胞間液的分泌蛋白質(zhì)，它是微環(huán)境中各種細胞所分泌蛋白質(zhì)的綜合產(chǎn)物。

4、系統(tǒng)地分析腫瘤組織中的分泌蛋白質(zhì)組，定量地估算腫瘤相關(guān)細胞和腫瘤細胞對總分泌蛋白質(zhì)組的貢獻，是腫瘤微環(huán)境研究工作中最為基本的要求。應(yīng)當選擇科學(xué)問題明確和前期實驗數(shù)據(jù)翔實的實體腫瘤作為本項目的研究對象，而結(jié)腸癌正是這樣一個典型實例。就具體研究材料而言，保持體外和體內(nèi)實驗的生物材料一致性將極大地減少非實驗性來源的誤差。c57小鼠背景的細胞和結(jié)腸癌模型是具有可操作性的選擇。就蛋白質(zhì)分析策略而言，整合現(xiàn)代蛋白質(zhì)分析技術(shù)可保證腫瘤微環(huán)境分泌蛋白質(zhì)研究的系統(tǒng)性和嚴謹性，如親和層析方法富集低豐度分泌蛋白質(zhì)、高精度質(zhì)譜儀提高蛋白質(zhì)鑒定的準確性和靈敏度、體內(nèi)或體外標記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)分析差異分泌蛋白質(zhì)、mrm技

5、術(shù)測定潛在的蛋白質(zhì)標志物。 2. 技術(shù)途徑為了避免實驗的誤差和技術(shù)路線的偏好，本項目將在各課題組實行較為統(tǒng)一的技術(shù)途徑，如圖1所示： 圖1. 技術(shù)路線示意圖在這些技術(shù)環(huán)節(jié)中，我們特別強調(diào)下列的技術(shù)特點：1) 高精度質(zhì)譜儀應(yīng)用于分泌蛋白質(zhì)組分析：已建立高通量和高精度的質(zhì)譜分析平臺，擁有velos orbitrap和maxis質(zhì)譜儀。這些質(zhì)譜儀在質(zhì)譜信號的分辨率和ms/ms掃描速度上已達到當前的最高水平，完全滿足分泌蛋白質(zhì)的肽段分析。2) 單克隆抗體或重組蛋白質(zhì)在親和層析中的應(yīng)用：在分泌蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)生物標志物的研究中，親和富集技術(shù)是至關(guān)重要的。本課題相關(guān)團隊已建立高通量的蛋白質(zhì)重組表達和單克隆抗

6、體制備系統(tǒng)，可以實現(xiàn)親和材料的研發(fā)和制備。3) 定量蛋白質(zhì)分析技術(shù)：廣泛采用蛋白質(zhì)組的定量技術(shù)，在標記定量法中主要采用itraq法，而在非標記定量中主要采取mrm法。同時開展蛋白質(zhì)組定量分析的統(tǒng)計方法和計算機軟件的開發(fā)。4) 小鼠細胞系和結(jié)腸癌動物模型：采用兩種c57小鼠背景的結(jié)腸癌模型aom-dss和apcmin，同時所用的小鼠細胞系同樣來自于c57小鼠的遺傳背景。本項目研究已具備了較好的技術(shù)平臺支撐，承擔單位擁有2個國家重點實驗室，3個部級重點實驗室，項目所需的絕大部分實驗儀器和實驗手段均已具備，各承擔單位間有著長期的良好合作關(guān)系和基礎(chǔ)。本項目的研究隊伍具有豐富的前期工作積累與相關(guān)研究成果

7、及多學(xué)科背景，已經(jīng)建立起成熟的研究手段和方法， 有能力完成所計劃的研究任務(wù)。 3. 創(chuàng)新性和特色本項目的創(chuàng)新之處集中表現(xiàn)在下面五個方面：1）首次提出了簡化腫瘤微環(huán)境的實驗方案，試圖從四種微環(huán)境相關(guān)的細胞著手，重點考察它們相互作用所產(chǎn)生的分泌蛋白質(zhì)對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響；2）與傳統(tǒng)的分泌蛋白質(zhì)研究所不同的是本項目特別強調(diào)多種細胞共培養(yǎng)才是研究腫瘤微環(huán)境分泌蛋白質(zhì)的可行實驗方案，二元或三元細胞培養(yǎng)體系及其蛋白質(zhì)組分析構(gòu)成了體外細胞實驗的主體；3）重視定量蛋白質(zhì)組分析在二元/三元培養(yǎng)系統(tǒng)中的應(yīng)用，不僅僅要了解共培養(yǎng)體系的分泌蛋白質(zhì)譜，還要定量測定不同細胞在總分泌蛋白質(zhì)譜圖中的貢獻；4）首次在同一遺傳

8、背景的小鼠模型和細胞模型上開展系統(tǒng)的腫瘤微環(huán)境研究，其中體外細胞培養(yǎng)探索腫瘤相關(guān)分泌蛋白質(zhì)，而體內(nèi)動物模型驗證和發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)；5）參與本課題的團隊來自我國腫瘤學(xué)界和蛋白質(zhì)組學(xué)界的優(yōu)秀實驗室，在腫瘤微環(huán)境、分泌蛋白質(zhì)、動物模型和蛋白質(zhì)組研究方面都具備相當?shù)膶嵙?。從地域分布而言，參加的研究團隊來自于我國的東西南北中，本項目在真正意義上實踐了集中全國精英，團結(jié)攻關(guān)的理想。 4. 取得重大突破的可行性分析本項目瞄準了當前腫瘤研究的熱點和重點，即腫瘤微環(huán)境的分子研究。在項目的執(zhí)行過程中，我們將建立一套完全新型的腫瘤微環(huán)境研究系統(tǒng)，試圖從同一遺傳背景的小鼠模型中找到體外和體內(nèi)所共享的腫瘤相關(guān)分泌蛋白

9、質(zhì)，籍此開展它們對巨噬細胞和成纖維細胞異變分子機制的探討，開展它們對上皮細胞癌變的誘導(dǎo)機制研究。我們有信心在腫瘤微環(huán)境分泌蛋白質(zhì)領(lǐng)域開辟一條新的道路，在結(jié)腸癌相關(guān)的蛋白質(zhì)生物標記物鑒定和測定，結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制研究等方面取得突破。我們的信心植根于：1) 本項目所提的生物學(xué)問題和技術(shù)困難在國際間仍然懸而未決，我們和其他的競爭者正處在同一起跑線上；2）參與本項目的各個團隊在相關(guān)的領(lǐng)域處在先進水平，某些課題已取得了進展；3）參與本項目的實驗室已具備開展此項研究的所有的實驗條件，特別是已搭建蛋白質(zhì)組分析平臺和已擁有小鼠模型和相關(guān)細胞。同時，項目首席科學(xué)家和課題組長在科研項目的組織和協(xié)調(diào)方面具有

10、豐富的 經(jīng)驗，均承擔并完成多項國內(nèi)或國外的重要科研項目。本項目計劃是基于研究團隊的研究基礎(chǔ)和前期工作而提出的，在本項目的申報過程中，項目專家組及研究骨干多次研討，圍繞本研究計劃擬解決的重大科技問題，制定了合理可行的研究方案和技術(shù)路線。相信通過學(xué)科交叉、集成多種研究方法，我們研究團隊完全有可能在本領(lǐng)域取得突破性進展。 5. 課題設(shè)臵課題設(shè)臵思路本項目首次提出體外的實體腫瘤微環(huán)境研究，采用簡化細胞組分的策略，選擇實體腫瘤中幾種生物學(xué)行為較為清晰而且相對細胞數(shù)量較大的細胞為研究對象，系統(tǒng)考察這些細胞相互作用所產(chǎn)生的分泌蛋白質(zhì)變化以及它們對于實體腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用。在這一基礎(chǔ)上開展小鼠腫瘤模型的體內(nèi)

11、研究，檢驗體外實驗結(jié)果與體內(nèi)實際發(fā)生事件的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)這樣的思路，我們將實體腫瘤的研究對象定位在結(jié)腸癌；選擇三種微環(huán)境相關(guān)的細胞來考察腫瘤與其它細胞相互作用所產(chǎn)生的分泌蛋白質(zhì)；采用兩種c57小鼠的結(jié)腸癌模型來檢驗可能的腫瘤蛋白質(zhì)標志物。本項目將設(shè)臵四個課題，分別為，1）結(jié)腸癌及其相關(guān)巨噬細胞的分泌蛋白質(zhì)組與腫瘤發(fā)展的相關(guān)性研究；2）結(jié)腸癌及其相關(guān)成纖維細胞的分泌蛋白質(zhì)組與腫瘤發(fā)展的相關(guān)性研究；3）腫瘤微環(huán)境分泌蛋白質(zhì)介導(dǎo)的上皮細胞癌變的機制研究；4）腫瘤微環(huán)境分泌蛋白質(zhì)與動物模型和臨床樣本的關(guān)聯(lián)分析。我們關(guān)于課題的設(shè)臵是從三個層次上給以考慮的：首先，從簡化腫瘤微環(huán)境細胞組分著手，我們選擇了三個

12、腫瘤相關(guān)的微環(huán)境細胞，即巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞。因為我們的基本假設(shè)是腫瘤相關(guān)分泌蛋白質(zhì)的研究需要建立在細胞之間的相互作用基礎(chǔ)上，這樣在簡化的微環(huán)境體系中就形成了結(jié)腸癌細胞與這三種環(huán)境細胞的配對，構(gòu)成了三個二元培養(yǎng)體系和一個三元培養(yǎng)體系（結(jié)腸癌細胞/tam/taf）。其次，從體外和體內(nèi)實驗著手，雖然我們在本項目中特別強調(diào)細胞系的選擇必須考慮到來源的遺傳統(tǒng)一性，以減少非實驗因素的干擾，但是體外的細胞實驗結(jié)果最終還需在體內(nèi)模型得以證實。因此，我們設(shè)定三個課題開展細胞的實驗，從二元或三元系統(tǒng)中分析腫瘤相關(guān)分泌蛋白質(zhì)，而設(shè)定一個課題從事于小鼠結(jié)腸癌模型的分泌蛋白質(zhì)分析，試圖做到體外和體內(nèi)的實驗數(shù)

13、據(jù)互相呼應(yīng)。 再次，從生物學(xué)問題著手，一般認為上皮細胞受腫瘤微環(huán)境影響可能表現(xiàn)于正常上皮細胞的癌變，而巨噬細胞和成纖維細胞則在微環(huán)境作用下可能異化變成tam和taf，tam和taf可顯著地促進腫瘤組織的侵潤和轉(zhuǎn)移。因此，在設(shè)定課題的生物學(xué)問題時，我們有關(guān)腫瘤微環(huán)境對上皮細胞影響的研究更多地投射在腫瘤的發(fā)生機制上；有關(guān)腫瘤微環(huán)境對巨噬細胞和成纖維細胞影響的研究更多關(guān)注于腫瘤的發(fā)展機制。在第四課題中，我們則從動物模型中動態(tài)地觀察微環(huán)境對于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響。 課題的關(guān)聯(lián)本項目的四個課題中，三個課題注重在細胞水平上的分泌蛋白質(zhì)研究，一個課題聚焦于動物體內(nèi)腫瘤組織的分泌蛋白質(zhì)和血液中腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。

14、各個課題之間既存在學(xué)術(shù)邏輯上的必然聯(lián)系，又有研究內(nèi)容上的互為補充。在結(jié)腸癌與tam和/或taf的分泌蛋白質(zhì)分析中所得到的結(jié)果將應(yīng)用于上皮細胞癌變的研究中。同樣，正常上皮細胞與結(jié)腸癌細胞的差異分泌蛋白質(zhì)又有助于tam和taf的功能分析。在細胞水平上的分析結(jié)果將體現(xiàn)在第四課題上的結(jié)腸癌模型中，而動物模型課題組產(chǎn)生的腫瘤組織又服務(wù)于細胞課題組的tam和taf的制備。如圖2所示，四個課題之間形成了較為完整的研究關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，在不同的層次和角度上共同研究結(jié)腸癌微環(huán)境分泌蛋白質(zhì)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的分子機制。 圖2. 各課題關(guān)聯(lián)示意圖紅色代表課題1，綠色代表課題2，黃色代表課題3，藍色代表課題4。 課題1.

15、 結(jié)腸癌及其相關(guān)巨噬細胞的分泌蛋白質(zhì)組與腫瘤發(fā)展的相關(guān)性研究課題背景巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境的一個主要的組成部分。alberto mantovani在1978年首次在實體瘤中觀察到先天性免疫細胞聚集的現(xiàn)象。近年來研究表明，各種免疫細胞向腫瘤（如乳腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、淋巴癌、黑色素瘤）的遷移聚集，其數(shù)量和細胞種類與癌癥病人的預(yù)后和生存率呈現(xiàn)非常密切的聯(lián)系。其中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞tams作為腫瘤中重要的免疫細胞組分被廣泛研究。巨噬細胞來源于血液單核細胞，血液單核細胞受腫瘤細胞分泌的如m-csf，ccl家族蛋白，cxcl家族蛋白等細胞因子或者趨化因子的吸引，被募集至腫瘤病灶，滲入腫瘤內(nèi)部并進一步轉(zhuǎn)

16、化為tams。正常的巨噬細胞具有吞噬腫瘤細胞，向t細胞呈遞抗原，表達細胞因子以活化t細胞及nk細胞的能力。與此相反，在腫瘤微環(huán)境的若干刺激因子的作用下，巨噬細胞轉(zhuǎn)向tams，使其失去了正常功能，反而成為腫瘤病人預(yù)后差的標志。大量研究已經(jīng)表明，tams的廣泛浸潤與乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、膀胱癌等腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。 腫瘤細胞分泌的蛋白質(zhì)，例如csf-1、ccl2, 3, 4, 5,6、mcp1, 2, 3, 4, 5、mip、mif和vegf等，可以促進tams的聚集，因此，在腫瘤細胞或組織中，這些蛋白質(zhì)的表達水平與tams的數(shù)量正相關(guān)。tam所分泌的蛋白質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大的關(guān)系。首先，t

17、am可表達多種刺激腫瘤細胞增殖和存活的細胞因子：egf、pdgf、tgf-b1、hgf、bfgf、il-6、il-1和tnfa等。tam是egf刺激腫瘤增殖的重要細胞來源。其次，tam可存在于基底膜部分，且伴有局部cathb和mmp的蛋白水解酶活性增強，促進了腫瘤細胞向周圍正常組織的侵襲。再次，腫瘤生長需要新生血管的形成，這個過程涉及廣泛的細胞因子的協(xié)同調(diào)控，包括bfgf、vegf、il-1、il-8、tnfa、mmp9、mmp2及no等。這些分子的協(xié)調(diào)作用促進內(nèi)皮細胞的增殖、基質(zhì)重構(gòu)及血管形成。tam可釋放上述促血管生成的分子，同時表達了一系列參與調(diào)節(jié)血管發(fā)生的酶類，包括mmp2、mmp7、

18、mmp9、mmp12和環(huán)氧化酶2，在促進腫瘤組織血管生成過程中發(fā)揮重要的作用。最后，tam還能釋放免疫刺激因子從而使腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)。例如，正常的巨噬細胞表達il-12，它的功能是促進t細胞核nk細胞的增殖，但是在腫瘤細胞分泌il-10、tgfb和pge2的刺激下，tam失去了表達該因子的能力；相反，將腫瘤細胞和過表達il-12的tam共同種植于小鼠時，tam向t細胞呈遞抗原的能力增加，且機體抗腫瘤的能力加強。在多數(shù)腫瘤組織中，腫瘤細胞和巨噬細胞存在一種共生的關(guān)系：巨噬細胞在腫瘤細胞及其釋放的可溶性分子的趨化下，遷移至腫瘤局部；tam產(chǎn)生大量的細胞因子則促進腫瘤的生長、增殖、轉(zhuǎn)移及血管形成

19、并抑制免疫細胞的活性。因此，深入探討在腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞與巨噬細胞的相互作用，闡明tam在微環(huán)境中功能變化的分子機制，以發(fā)揮巨噬細胞的積極作用，激活其抗腫瘤活性，將可能為未來腫瘤生物治療提供新的線索。盡管腫瘤與巨噬細胞的研究已經(jīng)有了很大的進展，有關(guān)這些細胞的分泌蛋白質(zhì)的報道也頻見于文獻，人們在這個領(lǐng)域的認知仍然差強人意。我們以為，大致有三個方面亟待加大研究的深度和力度。第一，目前有關(guān)腫瘤分泌蛋白質(zhì)的研究大都關(guān)注于單種細胞或癌組織的分泌分子，忽略了癌細胞和其相關(guān)細胞實際上生活在一個具體的微環(huán)境中，這些細胞的基因表達和分泌狀態(tài)與腫瘤微環(huán)境是密不可分的。第二，現(xiàn)有的文獻大都關(guān)注于腫瘤細胞或tam所

20、分泌的某個或某類蛋白，而實際上，在腫瘤微環(huán)境中的各種相關(guān)細胞所分泌的蛋白是作為一個整體， 相互促進表達，分泌及功能的實施，是一個協(xié)同的作用，至今卻沒有任何一個分泌蛋白質(zhì)的集合的報道。第三，tam可分泌大量的基底蛋白質(zhì)水解酶類或促血管生成的酶類，這些酶類大多屬于同一蛋白質(zhì)家族，但是迄今尚無較為有效的分離和鑒定手段較全面地了解它們的分泌和功能狀態(tài)，也就無法從這些關(guān)鍵分子出發(fā)更為深刻地了解腫瘤細胞和tam之間的相互作用是如何促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展的。 研究目標為了全面了解實體腫瘤的癌細胞與tam之間的相互作用，主要是它們的分泌蛋白質(zhì)組的構(gòu)成以及這些蛋白質(zhì)對癌細胞和巨噬細胞的作用，我們將以結(jié)腸癌細胞及其t

21、am為研究對象，開展如下三個方面的研究：1）定性及定量研究tam的腫瘤分泌蛋白質(zhì)組，2）結(jié)腸癌細胞分泌蛋白質(zhì)對巨噬細胞蛋白質(zhì)組和功能的影響，和3）tam分泌蛋白質(zhì)對結(jié)腸上皮細胞和結(jié)腸癌細胞的蛋白質(zhì)組和功能的影響。 研究內(nèi)容1. tam細胞的分離、培養(yǎng)和多維細胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建1.1正常巨噬細胞和tam細胞系培養(yǎng)我們將選用半懸浮ana-1細胞為c57小鼠巨噬細胞系，28sc細胞為人巨噬細胞系。兩個細胞系均用rpmi 1640+10%fbs培養(yǎng)。在tgf-b1的刺激下，巨噬細胞可轉(zhuǎn)化為tam。1.2 體內(nèi)正常巨噬細胞和tam細胞的分離和培養(yǎng)1.2.1 體內(nèi)正常小鼠巨噬細胞分離和培養(yǎng)取6周左右的c5

22、7小鼠，腹腔注射1毫升無菌的巰基乙酸肉湯，3-4天后處死動物，用外科方法無菌摘取小鼠脾臟和胸腺，臵于盛有預(yù)冷rpmi-1640，1%小牛血清培養(yǎng)液中，用無菌注射器將脾臟或胸腺擠壓通過200目的鋼絲網(wǎng)，獲得單個細胞。用含20%-40%小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液將細胞配成2x106-4x106/ml的濃度。以每平方厘米2x106-4x106個巨噬細胞的密度將細胞懸液接種到培養(yǎng)皿中。37 5%co2 培養(yǎng)24小時。用cd14（巨噬細胞特異抗原）抗體做免疫組織化學(xué)染色的實驗來檢驗所得巨噬細胞的純度。 1.2.2 tam的分離和培養(yǎng)用無菌的pbs洗滌腫瘤組織，腫瘤碎片孵育于含有1mg/ml膠原蛋

23、白酶i的pbs中1小時，將消化過的組織濾過70mm孔徑的濾網(wǎng)。將濾液離心得到沉淀，然后將沉淀懸浮于含有25ng/ml m-csf的mem/fbs中培養(yǎng)。在培養(yǎng)細胞24小時后應(yīng)進行cd14免疫組織化學(xué)檢驗。1.3 結(jié)腸癌細胞與tam的共培養(yǎng)將小鼠結(jié)腸癌細胞ct26或人結(jié)腸癌細胞coca-2接種在雙層共同培養(yǎng)板的下層，轉(zhuǎn)化的ana-1、28sc或腫瘤組織中分離的tam接種于共同培養(yǎng)板的上層（tam:結(jié)腸癌細胞=10:1）在rpm1-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2. tam細胞分泌蛋白質(zhì)親和富集技術(shù)的建立2.1 tam分泌糖蛋白質(zhì)的親和富集經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑的經(jīng)典分泌蛋白質(zhì)大多屬于糖基化蛋白質(zhì)，我

24、們將采用heprin/cona串聯(lián)親和層析的方法富集分泌蛋白質(zhì)，洗脫的蛋白質(zhì)臵于sds-聚丙烯酰胺膠內(nèi)，經(jīng)反復(fù)脫水和水化后，然后進行完全的胰蛋白酶消化。收集消化產(chǎn)生的肽段，經(jīng)lc-ms/ms分析鑒定分泌蛋白質(zhì)。2.2 mmps的定量蛋白質(zhì)組分析據(jù)已有的報道，tam可釋放多種細胞因子和蛋白酶類，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, mmp）是一種主要的蛋白酶。然而，目前各家實驗室報道的tam相關(guān)的mmp大相徑庭。我們認為，造成這種局面的一個重要原因是缺乏統(tǒng)一的可準確定量的mmp測定方法。在本課題中，我們提出基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑（tissue inhibi

25、tors of metalloproteinases, timp）親和層析和高精度質(zhì)譜儀相結(jié)合的策略，試圖精確定量mmp蛋白質(zhì)組。哺乳動物的timp均含有大約125氨基酸的n-端和65氨基酸的c-端，其中n-端以1:1的比例與mmps相結(jié)合，而timp-1能夠廣泛地與各種mmps相結(jié)合?；谶@種特性，我們將制備重組小鼠和人timp-1蛋白質(zhì)，然后將timp-1重組蛋白質(zhì)結(jié)合于sepharose樹脂，制作成為mmp親和層析柱。分泌蛋白質(zhì)與mmp親和樹脂相孵育之后，其中的mmps可望結(jié)合于親和樹脂，mmps以高鹽或酸性溶液洗脫，最后，采用質(zhì)譜儀鑒定所結(jié)合的mmp蛋白質(zhì)，以mrm技術(shù)定量測定差異的m

26、mps。2.3 tam分泌多肽的親和富集 為了檢測在細胞培養(yǎng)液中可能存在的多肽或蛋白酶解產(chǎn)物，我們將采用二步磁珠親和富集技術(shù)收集細胞培養(yǎng)液中的多肽。首先，用cona/wga磁珠將培養(yǎng)液中含有糖鏈的多肽富集下來，然后用rp磁珠富集其他的多肽類。洗脫吸附于磁珠上的肽段，運用lc-ms/ms測定和de novo分析，鑒定肽段的氨基酸序列。3. 正常巨噬細胞和tam細胞的分泌蛋白質(zhì)組分析3.1 正常小鼠巨噬細胞和tam分泌蛋白質(zhì)組比較分析該實驗將分為兩個小組，1）小鼠正常巨噬細胞ana-1和相對應(yīng)的轉(zhuǎn)化的tam；2）在小鼠體內(nèi)分離巨噬細胞和從小鼠結(jié)腸癌組織中分離tam。這些細胞在含有10%fbs的rp

27、mi-1640培養(yǎng)液后中，收集所有懸浮和貼壁細胞，再用不含血清的rpmi-1640培養(yǎng)72小時，每隔24小時收集一次細胞培養(yǎng)基。凍干法濃縮分泌蛋白質(zhì)。用sds-聚丙烯酰胺變性分泌蛋白質(zhì)，加入胰蛋酶完全消化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組分析將分為二個方面進行：1）對于小鼠巨噬細胞和tam各自的分泌蛋白質(zhì)組，我們將采用兩維hplc的方法分離消化所產(chǎn)生的肽段，即第一維采用反相色譜柱吸附肽段，nh4oh，ph10，的乙腈梯度溶液洗脫肽段，第二維仍采用反相色譜柱吸附肽段吸附肽段，但是用tfa，ph2.5，的乙腈梯度溶液洗脫肽段。肽段送入velos orbittrap質(zhì)譜儀來鑒定肽段和蛋白質(zhì)。2）對于小鼠正常巨噬細胞與

28、tam之間的差異蛋白質(zhì)組，我們將用itraq試劑分別標記這兩種細胞的分泌蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的消化肽段，然后等量混合分別，運用三重四極桿質(zhì)譜儀定量分析兩種肽段混合物的定量差異。3.2 正常人巨噬細胞系和人tam的分泌蛋白質(zhì)比較分析采用人巨噬細胞28sc與其轉(zhuǎn)化的tam為分析對象?；镜鞍踪|(zhì)組分析策略同上所述。4. 結(jié)腸癌與tam共培養(yǎng)體系的蛋白質(zhì)組分析4.1 構(gòu)建結(jié)腸癌與tam共培養(yǎng)體系的蛋白質(zhì)譜由tam分泌的蛋白刺激腫瘤細胞后，腫瘤細胞必然做出相應(yīng)的反應(yīng)，其分泌的蛋白質(zhì)也會發(fā)生相應(yīng)的變化，這些變化又會刺激tam的分泌，如此造成一個惡性的循環(huán)。那么tam與腫瘤細胞相互作用后，分泌蛋白質(zhì)又會發(fā)生怎樣的變

29、化呢？我們將采用小鼠結(jié)腸癌細胞ct26 和小鼠tam細胞ana-1，人結(jié)腸癌細胞caco-2和人tam細胞28sc，來開展這兩種細胞的互作實驗。用培養(yǎng)tam的培養(yǎng)基來培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞，然后收集腫瘤細胞培養(yǎng)上清，分析腫瘤細胞分泌的 蛋白質(zhì)；或在transwell培養(yǎng)小室中培養(yǎng)tam和腫瘤細胞，讓tam與腫瘤細胞受到共培養(yǎng)分泌產(chǎn)物的影響，分別收集其培養(yǎng)上清，分析tam和腫瘤細胞分泌的蛋白質(zhì)。然后將此蛋白質(zhì)分泌譜與單獨培養(yǎng)tam或腫瘤細胞的培養(yǎng)基中的分泌蛋白進行比較，得到tam與腫瘤細胞相互作用后特異改變的分泌蛋白質(zhì)。4.2 結(jié)腸癌與tam共培養(yǎng)體系的比較蛋白質(zhì)組分析將ct26與ana-1或caco-

30、2與28sc進行二元培養(yǎng)，在培養(yǎng)的不同時期，或者不同比例的培養(yǎng)系統(tǒng)中，利用免疫磁珠法分離培養(yǎng)系統(tǒng)中的腫瘤細胞和tam細胞，然后采用silac標記技術(shù)定量比較各個細胞的分泌蛋白質(zhì)對總分泌蛋白質(zhì)的貢獻。同時采用磷酸化蛋白質(zhì)/肽段富集結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法分別分析經(jīng)過共培養(yǎng)后的結(jié)腸癌細胞和tam細胞與它們單獨培養(yǎng)后細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達水平和磷酸化蛋白質(zhì)的差異。4.3 構(gòu)建三元共培養(yǎng)體系的蛋白質(zhì)譜微環(huán)境是由除腫瘤細胞外多種細胞組成的，其中包括巨噬細胞和成纖維細胞。這些細胞之間存在怎樣的相互作用呢？這些細胞相互作用后對腫瘤細胞的分泌蛋白質(zhì)又有何影響呢？我們將選用小鼠結(jié)腸癌細胞ct26、tam細胞ana-1、ta

31、f細胞，或人結(jié)腸癌細胞caco-2、tam細胞28sc、taf細胞。對于小鼠細胞，在transwell培養(yǎng)小室下層培養(yǎng)ct26，在其下層培養(yǎng)taf，在上下各層中加入等量的ana-1；對于人細胞，在下層培養(yǎng)caco-2，上層培養(yǎng)ccd-18co，在上下各層中加入28sc細胞。整個transwell培養(yǎng)小室臵于慢速轉(zhuǎn)動系統(tǒng)中，以防止巨噬細胞的積聚。三元系統(tǒng)的分泌蛋白質(zhì)組測定如圖3.1所述。并將三元分泌蛋白質(zhì)組與單獨培養(yǎng)tam、taf或腫瘤細胞的培養(yǎng)基中的分泌蛋白進行比較，可望得到tam、taf與腫瘤細胞相互作用后特異改變的分泌蛋白質(zhì)。4.4 三元共培養(yǎng)體系的比較蛋白質(zhì)組分析在三元培養(yǎng)的不同時期，或

32、者不同比例的培養(yǎng)系統(tǒng)中，采用silac技術(shù)定量測定各種細胞的分泌蛋白質(zhì)在總分泌蛋白質(zhì)中的相對豐度。5. 結(jié)腸癌細胞或tam分泌蛋白質(zhì)對正常巨噬細胞的功能影響5.1 鑒定誘導(dǎo)巨噬細胞向tam轉(zhuǎn)化的新的細胞因子我們已知在il-4、il-8、il-10、il-13、tgf-b、類固醇和pge2的刺激下，巨噬細胞轉(zhuǎn)向tam。很多報道也是應(yīng)用這些因子處理巨噬細胞來研究tam的功能。除了這些常見因子，是否還有其他細胞因子可以起到同樣的作用呢？將正常 結(jié)腸細胞的培養(yǎng)液和結(jié)腸癌細胞的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)正常巨噬細胞，根據(jù)tam具有低表達carboxypeptidase m、cd51、tnf-a，而持續(xù)性高表達il-

33、1、il-6的特性，檢測結(jié)腸癌細胞的培養(yǎng)液是否可以誘導(dǎo)巨噬細胞向tam的轉(zhuǎn)化。如上述所建立的分泌蛋白親和富集方法分別收集正常結(jié)腸細胞的培養(yǎng)液和結(jié)腸癌細胞的培養(yǎng)液，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法（itraq、icat、silac）比較正常細胞和相應(yīng)的結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)基中的分泌蛋白，那些在癌癥組表達上調(diào)的分泌蛋白，很可能就是促進巨噬細胞向tam轉(zhuǎn)換的新的誘導(dǎo)因子，或者是結(jié)腸癌特有的誘導(dǎo)因子。將所得的候選誘導(dǎo)因子加入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)巨噬細胞，同樣的通過檢測巨噬細胞的cd51、tnfa、il-1、il-6等的表達水平，來驗證它們是否具有促進巨噬細胞向tam轉(zhuǎn)化的功能。5.2 正常巨噬細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞的蛋

34、白質(zhì)組動態(tài)研究在二元和三元細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，用不同濃度的腫瘤細胞培養(yǎng)上清處理正常巨噬細胞ana-1，選擇不同處理時間點，采用形態(tài)學(xué)分析、流式細胞術(shù)、elisa等手段動態(tài)觀察腫瘤細胞分泌蛋白質(zhì)群對巨噬細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞的影響，采用silac或itraq定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法以及結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的富集（包括抗酪氨酸磷酸化抗體的免疫沉淀和tio2富集磷酸化肽段），動態(tài)分析巨噬細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞過程中，巨噬細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子表達水平和翻譯后修飾（如磷酸化）的動態(tài)變化，經(jīng)過string和pathway studio生物信息學(xué)分析，構(gòu)建可能存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)。5.3 腫瘤分泌功能蛋白質(zhì)組

35、對正常巨噬細胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制研究采用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)方法和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究策略，基于rnai、基因過表達和基因重組蛋白質(zhì)分子的處理，建立腫瘤細胞分泌的蛋白質(zhì)分子群與ana-1細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)群之間的聯(lián)系，構(gòu)建腫瘤分泌蛋白調(diào)控巨噬細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)，闡明腫瘤分泌功能蛋白質(zhì)群對巨噬細胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制。5.4 通過靶向干預(yù)誘導(dǎo)tams表型改變通過激動和拮抗干預(yù)測定tams可能的靶通路或靶蛋白的響應(yīng)，探索是否可將tams的表型體外轉(zhuǎn)化為相對正常的巨噬細胞表型。主要評價指標包括：組織蛋白酶的分泌、細胞內(nèi)il-12和il-10表達情況、分泌細胞因子的模式（應(yīng)用

36、luminex和蛋白印記隊列技術(shù)）。 課題承擔單位：暨南大學(xué)課題參加單位：中國科學(xué)院北京基因組研究所、復(fù)旦大學(xué)課題負責人：何慶瑜科研骨干：婁曉敏、王媛、梁春敏、孫益紅經(jīng)費比例：23% 課題 2. 結(jié)腸癌及其相關(guān)成纖維細胞的分泌蛋白質(zhì)組與腫瘤發(fā)展的相關(guān)性研究課題背景腫瘤相關(guān)成纖維細胞taf是腫瘤微環(huán)境中分布較廣而且表型改變了的成纖維細胞。與正常成纖維細胞相比，taf處于活化狀態(tài)，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長方式、增殖活性、運動能力以及分泌特性等方面均發(fā)生了顯著變化。已有的研究表明，taf作為主要的一類基質(zhì)細胞，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中與腫瘤細胞間發(fā)生相互作用、相互影響。在誘導(dǎo)正常成纖維細胞向taf轉(zhuǎn)化的過程中，

37、細胞因子扮演了一個重要的角色。腫瘤細胞通過分泌一些細胞因子誘導(dǎo)普通成纖維細胞及前體細胞向taf的轉(zhuǎn)變，并促進taf的增殖；新形成的taf所分泌的一些細胞因子在腫瘤的生長、血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細胞對taf的作用主要通過細胞因子實現(xiàn)，諸如transforming growth factor (tgf-b)，platelet-derived growth factor（pdgf），extracellular matrix metalloproteinase inducer（emmprin）。例如，tgf- b刺激成纖維細胞，上調(diào)smooth muscle actin（sm

38、a）的表達，促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化為taf；pdgf與成纖維細胞的pdgf受體結(jié)合，促進了有絲分裂相關(guān)基因和化學(xué)趨化因子的表達，造成了成纖維細胞的增生紊亂；而emmprin是腫瘤細胞的表面含量豐富的粘附因子，分泌的emmprin刺激周圍成纖維細胞，加大基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，mmps）的分泌，進一步降解ecm中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，從而促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。實體腫瘤處于一個低氧、低ph、ros等應(yīng)激因子的微環(huán)境中，這些因子在促進腫瘤的血管生成及轉(zhuǎn)移過程中行使了重大功能，近年來的研究顯示這類應(yīng)激因子可能還改變了除腫瘤細胞之外的基質(zhì)細

39、胞。結(jié)腸癌的免疫組化結(jié)果顯示，在 侵襲性結(jié)腸癌組織邊緣的基質(zhì)細胞中，成纖維細胞內(nèi)針對低氧、低ph、ros的應(yīng)激蛋白hif-、ldh5、tp表達量都明顯上調(diào)，并且其增殖異?；罨?。模擬腫瘤微環(huán)境（低氧、低ph）的體外培養(yǎng)體系結(jié)果表明，成纖維細胞能夠低氧培養(yǎng)條件下增殖，并且其分泌的細胞因子cathepsin-l、vegf顯著升高，細胞的惡性程度增加。在低ph（如乳酸處理）培養(yǎng)的條件下，正常的成纖維細胞其增殖速度表現(xiàn)出對乳酸劑量依賴性增加。這些特性與taf的表征非常類似，腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)激因子可能參與正常成纖維細胞向taf的轉(zhuǎn)變，但是這些應(yīng)激因素如何促進成纖維細胞的轉(zhuǎn)變尚無定論。taf能夠誘發(fā)腫瘤形成

40、，在腫瘤發(fā)生的階段起了重要的作用。正常的成纖維細胞可以抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞分化，使其惡性表型消失，對于維持上皮細胞的穩(wěn)態(tài)有重要作用。相反，taf誘導(dǎo)和促進上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變，當taf與腫瘤細胞共培養(yǎng)時，能明顯地刺激腫瘤細胞生長。有證據(jù)表明，taf分泌stromal-cell derived factor-1（sdf-1）、vascular endothelial growth factor（vegf）、fabroblast growth factor（fgf）等細胞因子，它們作用于腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞表面的受體，促進腫瘤生長及增加血管生成，進而提高腫瘤的惡性程度。taf分泌的趨化因子

41、還引發(fā)巨噬細胞浸潤至腫瘤組織。實體腫瘤細胞及taf所分泌的細胞因子在taf的形成、腫瘤發(fā)生和生長、血管生成、腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的作用已逐漸被人們所認識，然而，目前關(guān)于腫瘤細胞與taf之間關(guān)系的研究仍存在以下問題：1）目前仍缺乏一個系統(tǒng)的、全面的針對腫瘤細胞及taf分泌蛋白質(zhì)譜圖的研究；2）腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)激因子，如缺氧、酸性等，對taf及正常成纖維細胞分泌蛋白的差異調(diào)控，及由此介導(dǎo)的對腫瘤生長侵襲等重要功能的影響，還是一個相對空白的研究領(lǐng)域；3）由于大部分分泌蛋白質(zhì)的濃度極低，蛋白質(zhì)組分析技術(shù)在檢測靈敏度上顯得力不從心；4）盡管腫瘤細胞分泌蛋白質(zhì)對成纖維細胞的影響已有所研究，taf分泌

42、蛋白質(zhì)對腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制研究卻鮮見于文獻。 研究目標本課題的研究目標是構(gòu)建一個腫瘤細胞與taf相互作用的體外培養(yǎng)模型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法鑒定腫瘤細胞及taf的分泌蛋白質(zhì)譜，并結(jié)合定量蛋白 質(zhì)組學(xué)的手段監(jiān)測腫瘤細胞及其微環(huán)境因子誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)化為taf過程中蛋白質(zhì)和信號通路的變化，以及taf（或taf分泌蛋白）作用下腫瘤細胞的生物學(xué)特性與分泌蛋白質(zhì)變化，最終為揭示taf與腫瘤細胞之間的相互關(guān)系與作用機制提供系統(tǒng)性的解釋，為腫瘤治療提供新思路、開辟新途徑。 研究小鼠taf及正常成纖維細胞的分離和培養(yǎng)我們將從aom-dss或apcmin小鼠結(jié)腸癌模型的腫瘤組織中分離taf，從c57正常小

43、鼠的腸粘膜組織中分離正常成纖維細胞。利用差數(shù)貼壁法及對胰酶敏感度不一致的特性將上皮細胞與成纖維細胞分離，并結(jié)合taf特征標志物vimentin、prolyl 4-hydroxylase及-sma來篩選并建立taf原代細胞系。后續(xù)實驗的細胞代齡控制在20代以人正常成纖維細胞系和taf細胞系我們將選取正常的人結(jié)腸來源的成纖維細胞系ccd-18co，并用tgfb1刺激誘導(dǎo)其形成腫瘤相關(guān)的成纖維細胞。1.3 結(jié)腸癌細胞與taf的共培養(yǎng)我們將選取人結(jié)腸癌細胞caco-2與鼠結(jié)腸癌細胞系ct26用于以下實驗的研究，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并篩選一個帶有熒光標簽的腫瘤細胞系，便于共培養(yǎng)后細胞的分選及對腫瘤細胞行為變化的

44、實時觀察，從而建立一個快速檢測體系。正常及腫瘤相關(guān)的成纖維細胞系如上所述。采用transwell系統(tǒng)來進行兩種細胞共培養(yǎng)。取對數(shù)生長期生長良好的正常成纖維細胞或taf，接種到雙層共同培養(yǎng)板的下層；取對數(shù)生長期生長良好的結(jié)腸癌細胞，接種到雙層共培養(yǎng)板上層，待兩種細胞完全貼壁后將上層套皿放入接種有下層細胞的6孔板中，在無血清培養(yǎng)基條件下進行培養(yǎng)。對照組則為同一種細胞以對應(yīng)相同數(shù)量接種于上下層，由此建立細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。除此之外，我們將分析各種細胞在conditioned medium 培養(yǎng)條件下的生物行為學(xué)變化，并利用三元培養(yǎng)體系的方法來模擬微環(huán)境中結(jié)腸癌與taf及tam之間的關(guān)系。1.4 低氧及低

45、ph細胞培養(yǎng)模型的建立 細胞的缺氧處理：將細胞培養(yǎng)在37，并臵于可以控制氧氣濃度的hypoxia chamber中，模擬實體瘤微環(huán)境的氧濃度進行培養(yǎng)。細胞酸性環(huán)境處理：在培養(yǎng)基中添加不同濃度的乳酸來模擬腫瘤微環(huán)境中的低ph濃度梯度。2. 分泌蛋白質(zhì)研究方法2.1 分泌糖蛋白質(zhì)的富集凝集素（lectin） 是一類糖結(jié)合蛋白，能通過專一地識別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合，它們與糖鏈的結(jié)合是非共價且可逆的，糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲之后，通常用特定的單糖通過競爭結(jié)合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。我們擬采用多種凝集素（multilectin affinity）或連續(xù)凝集素親和層析（

46、serial lectin affinity chromatography，slac）處理分泌蛋白質(zhì)。2.2 taf分泌蛋白質(zhì)的富集根據(jù)目前的文獻報道，taf的分泌蛋白質(zhì)的種類很多，但是濃度極低，在冷三氯醋酸體系中難于獲得沉淀。因此，我們考慮采用三種方法富集分泌蛋白質(zhì)。1）陰離子樹脂法：在收集的條件培養(yǎng)液中加入陰離子交換的磁珠顆粒，然后在高鹽條件下洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)；2）肝素樹脂法：肝素親和技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于細胞因子和趨化因子的純化，我們將利用這個技術(shù)試圖部分富集分泌蛋白質(zhì)；3）mmp親和法：根據(jù)taf可能分泌較多的mmp蛋白質(zhì)的特點，制備timp-1親和樹脂來富集分泌蛋白質(zhì)中的mmp家族成員。

47、2.3 多肽的親和富集采用bruker公司的clinprot磁珠等方法富集taf分泌的多肽，在質(zhì)譜鑒定過程中引入de novo分析提高肽段的鑒定準確率。在確定有意義的肽段之后，再利用mrm技術(shù)開展定量檢測分析。2.4 定量分泌蛋白質(zhì)測定技術(shù)為了分析結(jié)腸癌細胞、成纖維細胞系及腫瘤相關(guān)成纖維細胞系（taf）在單獨培養(yǎng)條件下分泌蛋白的差異，我們將采用itraq 的策略來分析各種細胞在單獨培養(yǎng)條件下分泌蛋白差異表達譜，構(gòu)建一個差異譜圖數(shù)據(jù)庫，為分析共培養(yǎng)后各自表達譜的變化奠定基礎(chǔ)。對于某些已經(jīng)鑒定的差異蛋白質(zhì)采用多反應(yīng)監(jiān)測（mrm）方法進行較大規(guī)模的定量分析。 3. 結(jié)腸癌和taf的分泌蛋白質(zhì)組研究3

48、.1 建立結(jié)腸癌細胞分泌蛋白質(zhì)譜分別在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ct26或caco-2，待其生長至80%匯合度時,再轉(zhuǎn)無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48、72小時收集條件培養(yǎng)基，去除完整細胞及細胞碎片，富集分泌蛋白質(zhì)，然后利用lc-ms/ms鑒定蛋白質(zhì)，獲得小鼠或人結(jié)腸癌腫瘤細胞的分泌蛋白質(zhì)譜。3.2 正常成纖維細胞和taf細胞的分泌蛋白質(zhì)的比較分析采取相似的細胞處理方法，將小鼠正常結(jié)腸或結(jié)腸癌組織上分離的成纖維細胞或taf，正常的人結(jié)腸成纖維細胞系ccd-18co或轉(zhuǎn)化的ccd-18co分別培養(yǎng)，并測定它們的分泌蛋白質(zhì)組。同時，采用itraq方法標記各自的分泌蛋白質(zhì)，然后利用三重四極桿

49、質(zhì)譜儀分析小鼠或人正常成纖維細胞與其對應(yīng)的taf的差異分泌蛋白質(zhì)。3.3 缺氧、低ph條件下成纖維細胞分泌蛋白質(zhì)組比較分析我們將分別收集低氧、低ph值培養(yǎng)條件下正常成纖維細胞及taf的分泌蛋白，利用itraq標記技術(shù)進行差異蛋白組分析。4. 結(jié)腸癌與taf共培養(yǎng)體系的蛋白質(zhì)組分析在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞與taf通過旁分泌相互影響，共同進化。在這個過程中分泌的細胞因子的變化在一定程度上介導(dǎo)它們之間的交流和反饋，檢測共培養(yǎng)前后條件培養(yǎng)基中分泌蛋白的變化能間接的反應(yīng)它們之間的通訊，并在一定程度上模擬其在腫瘤微環(huán)境中的相互調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。利用transwell二元共培養(yǎng)體系，采用silac方法分別完全標記不

50、同細胞，利用蛋白親和層析技術(shù)從條件培養(yǎng)基中富集分泌蛋白并進行l(wèi)c-ms/ms質(zhì)譜鑒定，結(jié)合生物信息學(xué)分析共培養(yǎng)條件下分泌蛋白譜圖與前期單種細胞分泌蛋白譜圖的差異，從而得到共培養(yǎng)前后變化的蛋白譜圖。4.1 建立結(jié)腸癌與taf共培養(yǎng)體系的分泌蛋白質(zhì)組譜在transwell 共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)ct26和小鼠結(jié)腸癌的taf或caco-2和轉(zhuǎn)化的ccd-18co，分別在24、48、72小時收集條件培養(yǎng)基，并按照前述方法鑒定它們的分泌蛋白質(zhì)，建立二元共培養(yǎng)系統(tǒng)中的分泌蛋白質(zhì)譜。4.2 結(jié)腸癌與taf共培養(yǎng)體系的比較分泌蛋白質(zhì)組 我們將利用silac技術(shù)分析transwell 二元共培養(yǎng)體系中單種細胞與共培養(yǎng)

51、后培養(yǎng)基分泌蛋白成分的變化，并比較條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)的方法中各實驗組前后分泌蛋白組的變化。為了進一步準確地分析差異分泌蛋白的來源，分別將結(jié)腸癌細胞臵于taf分泌的條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將taf臵于結(jié)腸癌細胞分泌的條件培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，對照組則為細胞本身的條件培養(yǎng)基進行處理，通過往條件培養(yǎng)基中加入用于silac標記的特異氨基酸，培養(yǎng)一段時間后，收集培養(yǎng)基中的分泌蛋白并比較培養(yǎng)前后分泌蛋白組分的變化，整合transwell 體系的結(jié)果，最終分析出共培養(yǎng)條件下各種細胞系分泌蛋白的變化。結(jié)合兩部分的實驗數(shù)據(jù)，從而進一步分析共培養(yǎng)后不同細胞系分泌蛋白的動態(tài)變化。4.3 缺氧或低ph條件下結(jié)腸癌與正常成纖維細

52、胞共培養(yǎng)的比較分泌蛋白質(zhì)組采用缺氧或低ph處理方法，用含胎牛血清培養(yǎng)基二元共培養(yǎng)ct26和taf或coca-2和轉(zhuǎn)化的ccd-18co，然后將培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)至無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并在不同時間點上收集條件培養(yǎng)基。采用itraq方法分別標記處理和非處理條件下的分泌蛋白質(zhì)，定量比較它們之間的差別。5. 結(jié)腸癌細胞或taf分泌蛋白質(zhì)對結(jié)腸癌細胞或成纖維細胞的功能影響5.1 篩選誘導(dǎo)正常成纖維細胞向taf轉(zhuǎn)變的應(yīng)答分子和功能研究為了篩選發(fā)現(xiàn)正常成纖維細胞向taf的轉(zhuǎn)化，我們將分別收集單獨培養(yǎng)的小鼠ct26或人caco-2細胞的條件培養(yǎng)基，然后在這些培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠結(jié)腸成纖維細胞或轉(zhuǎn)化的ccd-18co，

53、檢驗結(jié)腸癌細胞分泌蛋白質(zhì)對成纖維細胞的細胞行為和功能的影響，如形態(tài)、增殖、凋亡等；同理，我們也將收集taf的條件培養(yǎng)基、結(jié)腸癌和taf共培養(yǎng)的培養(yǎng)基來考察它們對正常成纖維細胞的影響。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合上述的分泌蛋白質(zhì)譜和差異分泌蛋白質(zhì)比較，通過生物信息學(xué)分析，篩選出可能與成纖維細胞向taf轉(zhuǎn)化相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)，從而尋找腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中潛在參與誘導(dǎo)taf形成的關(guān)鍵因子。采用分子生物學(xué)的方法在哺乳類細胞中克隆表達和純化相應(yīng)的重組蛋白質(zhì)。在正常成纖維細胞培養(yǎng)基中加入特異的重組分泌蛋白質(zhì)，能夠進一步考察成纖維細胞的taf轉(zhuǎn)化的分子機制。5.2 比較應(yīng)激因素和腫瘤分泌蛋白質(zhì)對成纖維細胞的taf轉(zhuǎn)化的

54、影響據(jù)報道由于腫瘤微環(huán)境的改變，在應(yīng)激因子，如缺氧、低ph等刺激的條件 下，正常成纖維細胞可能向taf轉(zhuǎn)變。我們將在缺氧或低ph條件下觀察正常成纖維細胞的形態(tài)和功能變化，并測定處理前后成纖維細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的差異變化。結(jié)合上述結(jié)腸癌細胞的分泌蛋白質(zhì)或癌細胞與taf二元共培養(yǎng)的分泌蛋白質(zhì)對正常成纖維細胞的形態(tài)和功能變化。將這兩種不同處理方法所造成的成纖維細胞功能和蛋白質(zhì)豐度改變進行比較，可望在一定程度上闡明應(yīng)激因素條件下腫瘤細胞對taf形成的調(diào)控機制。5.3 典型taf分泌蛋白質(zhì)對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響為了篩選并驗證taf分泌的細胞因子對腫瘤細胞的影響，我們將首先收集單獨培養(yǎng)小鼠taf和人ta

55、f克隆的條件培養(yǎng)基，用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)ct26或caco-2，并觀察刺激前后結(jié)腸癌細胞的惡性程度的改變，如侵襲能力、劃痕愈合能力、增值速率等。 然后，用結(jié)腸癌與taf二元共培養(yǎng)的條件培養(yǎng)液來刺激ct26或caco-2的生長。在此基礎(chǔ)上，進一步利用生物信息學(xué)和已知的taf分泌蛋白質(zhì)組，篩選taf分泌蛋白質(zhì)中可能誘導(dǎo)癌細胞惡變的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。將候選的關(guān)鍵taf分泌蛋白質(zhì)在哺乳細胞中表達并純化，用這些重組蛋白質(zhì)刺激結(jié)腸癌細胞，從而分析taf中調(diào)控腫瘤細胞生物學(xué)行為的分子機制。 課題承擔單位：復(fù)旦大學(xué)課題參加單位：暨南大學(xué)、四川大學(xué)課題負責人：施前科研骨干：張麗軍、晏光榮、夏晴、仝愛平經(jīng)費比例：23% 課

56、題3. 腫瘤微環(huán)境分泌蛋白質(zhì)介導(dǎo)的上皮細胞癌變的機制研究課題背景在結(jié)腸、乳腺、胃和胰腺癌等實體腫瘤中，非腫瘤細胞占有較大比例，而其中正常上皮細胞數(shù)量最多。在任何上皮來源實體腫瘤發(fā)生的早期，惡性上皮都被大量的正常上皮細胞所包圍，惡性上皮細胞需要在與正常上皮持續(xù)的信號傳遞過程中逐步獲得競爭優(yōu)勢，進而發(fā)展成為實體腫瘤；另外，正常上皮細胞可在惡性微環(huán)境的誘導(dǎo)下發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變，不但喪失對周圍惡性上皮細胞的抑制作用，成為 腫瘤相關(guān)的上皮細胞tae，而且參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，成為腫瘤組織的重要組成部分。因此，正常上皮細胞對腫瘤微環(huán)境及實體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有相當大的影響，是腫瘤微環(huán)境中不可或缺的一環(huán)，有重

57、要的研究價值。在癌癥發(fā)展早期原位癌和重度非典型增生階段，正常上皮細胞對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有明顯的抑制作用。它們通過與惡性上皮細胞間的接觸，如緊密連接、粘合連接、間隙連接等，以及旁分泌途徑抑制惡性上皮的增生、維持組織正常狀態(tài)。當在癌基因/抑癌基因發(fā)生異?；蛘吣[瘤惡性微環(huán)境的影響下，如微環(huán)境中hgf水平升高，作為緊密連接調(diào)節(jié)復(fù)合物的par3/par6/apkc復(fù)合體發(fā)生異常，不但破壞了緊密連接的正常形態(tài)，而且可以通過gsk3b通路調(diào)節(jié)細胞凋亡。正常上皮細胞在腫瘤微環(huán)境中的生物學(xué)性狀與功能并不是一成不變的，在惡性微環(huán)境的刺激誘導(dǎo)下，它們可以發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，喪失其正常的腫瘤抑制功能。現(xiàn)已廣泛證明在皮膚癌、肺

58、癌、乳腺癌、口腔上皮癌、食管癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤中，癌旁正常上皮細胞中可以檢測到與癌組織惡性上皮相類似的基因突變，如雜合性缺失（loh）、tp53突變等，這成為多發(fā)性腫瘤與腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)潛在原因。然而關(guān)于這一現(xiàn)象的解釋目前眾說紛紜，其中有大量實驗證據(jù)支持“微環(huán)境假說”，即癌上皮細胞可以釋放某種信號到組織微環(huán)境中，而這種信號可以導(dǎo)致周邊正常細胞，包括正常上皮細胞發(fā)生癌相關(guān)基因突變或者表觀遺傳學(xué)的改變。體外實驗表明，將正常上皮細胞與惡性上皮細胞共培養(yǎng)可以導(dǎo)致正常上皮細胞增殖能力與侵襲能力的升高，以及mmp-9分泌增多，從而使惡性上皮細胞自身的侵襲能力增加。但是，究竟是哪一些微環(huán)境因子促使了正常上皮細胞的畸變尚無定論。在正常上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中，相較于惡性癌上皮細胞，基質(zhì)細胞，尤其是成纖維細胞，發(fā)揮更為重要的作用。大量試驗表明，將無致瘤性的正常上皮