蛋白質(zhì)相互作用教學(xué)提綱

1、蛋白質(zhì)相互作用精品文檔蛋白質(zhì)相互作用的概述一、為什么要研究蛋白質(zhì)相互作用二、蛋白質(zhì)相互作用親和力： Kd=AB/AB三、蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用A 、利用抗原和抗體的相互作用： Western blot ，免疫共沉淀，染色質(zhì)沉淀 ，抗體篩庫B、 利用已知的相互作用建立 tag ：GST pull down ， Biotin Avidin 結(jié)合 ， C、直接利用蛋白質(zhì)的相互作用：蛋白質(zhì)親和層析，酵母雙雜交，phage display ， Bait 蛋白質(zhì)篩表達庫，蛋白質(zhì)組四、相互作用的生物學(xué)意義：蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)。五、生物學(xué)功能的研究： 獲得功能或失去功能I、一些常用蛋白質(zhì)相互

2、作用技術(shù)? Traditional co-purification （chromatography co-purification and co-sedimentation）? Affinity chromatography ： GST pull down ， Epitope-tag? （co-）Immunoprecipitation? Western 和 Far-Western blotSurface Plasmon ResonanceTwo-Hybrid SystemFluorescence Resonance Energy Transfer （FRET）（實驗過程及原理，注意事項，優(yōu)缺點

3、）III 、研究實例討論 一、酵母雙雜交系統(tǒng) 作用：發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)；鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用；確定蛋白質(zhì)相互作用的功能基團 具體過程：見書本優(yōu)點：是酵母細(xì)胞的 in vivo 相互作用；只需要 cDNA ，簡單；弱的相互作用也能檢測到 缺點：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用；酵母的翻譯后修飾不盡相同，尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾；自身激活報告基因；基因 庫德要求比較高，單向 1/3 是 in frame蛋白質(zhì)毒性；第三者 Z 插足介導(dǎo)的相互作用；假陽性 酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報道基

4、因的啟 動子，啟動報道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達，如果檢測到報道基因的表達產(chǎn)物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之 間沒有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列 化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜 交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。（1）原理：將編碼某一蛋白 X 的 DNA 序列與 DNA 結(jié)合域 BD 的編碼序列融合形成一個雜交體，將編碼另一蛋白 Y 的 DNA 序列與 DNA 激活域 AD 的編碼序列融合形成另一個雜交體，當(dāng)兩個雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有 DNA 結(jié)合位點的報告基因），若 X和 Y 沒有相 互作用，則單獨不能激活報告基因

5、的轉(zhuǎn)錄；若 X和 Y可相互作用，則使 BD和AD 靠近形成一個有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報告基因的轉(zhuǎn) 錄。因此可通過檢測報告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì) X 和 Y 的相互作用。（2）應(yīng)用范圍1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質(zhì)作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨 基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD 基因構(gòu)建成 “誘餌”表達質(zhì)粒，將某一器官或組織的 cDNA 文庫與 AD 基因構(gòu)建成“獵物 ”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的 cDNA 序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。1）二、噬茵

6、體展示技術(shù)2）收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除精品文檔3）在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的 DNA 序列，當(dāng)噬菌體生長時，表面就表達出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過柱，柱 上若含目的蛋白， 就會與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，這被稱為噬菌體展示技術(shù)。此技術(shù)也主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅有高通 量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇 性的篩選復(fù)雜混合物、在篩選過程中通過適當(dāng)改變條件可以直接評價相互結(jié)合的特異性 等優(yōu)點。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細(xì)胞 系的 cDNA 文庫，并分離出了人上皮生長因子信號傳導(dǎo)途 徑中的信號分子。4）5）三、等離子共振技術(shù)6）

7、7） 表面等離子共振技術(shù) （Surface Plasmon Resonance， SPR）已成為蛋白質(zhì)相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上 “誘餌蛋白 ”，當(dāng)待測蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。SPR技術(shù)的優(yōu)點是 不需標(biāo)記物或染料，反應(yīng)過程可實時監(jiān)控。測定快速且安全，還可用于檢測 蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。8）9）四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)10） （fluorescence resonance energy transfer ， FRET ） FRET ： 優(yōu)點：體內(nèi)測定兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用；敏感度高；溶

8、解度好？；大分子的主要構(gòu)象變化能測定；定量和定性測定相互作用。 缺點：只能測定熒光基團大小為（ 20-100?）的分子；儀器設(shè)備很貴；需要熒光標(biāo)記FRET 可用于研究活細(xì)胞生理條件下研究蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)間相互作用?；驹恚涸趦蓚€不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體 Donor ）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定 的重疊，當(dāng)這兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于100 ?），就可觀察到熒光能量由供體向受體共振轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種基團的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光。其中以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GF

9、P） 及其突變體的應(yīng)用最為廣泛。特點：a 反映在當(dāng)時活細(xì)胞生理條件下蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)間相互作用的動態(tài)變化過程 ;b 兩個熒光集團間的合適距離為 20100 ?（2 10nm）;c 需用熒光或 GFP 標(biāo)記測試蛋白。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET ）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用 ; 與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂 類、 DNA 和 RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（ GFP）的發(fā)展， FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細(xì)胞內(nèi)分子的動態(tài)性質(zhì)。提出 了一種定量測量 FRET 效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發(fā)射

10、譜消除光 譜間的串?dāng)_。該方法簡單快速，可實時定量 測量 FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于GFP 的供體受體對。FRET 就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm）時，將光子能從一個受激發(fā)的熒光團（供體）轉(zhuǎn)移到另一個熒光團（受體）。當(dāng)它們足夠接近時，用CFP 的吸收波長激發(fā)， CFP 的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至 YFP 的發(fā)色基團上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是 YFP 的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的 6次方成反比， 對空間位置的改變非常靈敏。例如要研究兩種蛋白質(zhì) a和 b間的相互作用，可以根據(jù)

11、FRET 原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分 組成： CFP （ cyan fluorescent protein ）、蛋白質(zhì) b、 YFP（yellow fluorescent protein） 。用 CFP 吸收波長 433nm 作為激發(fā)波長，實驗靈巧設(shè) 計，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì) a與 b沒有發(fā)生相互作用時， CFP與 YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射波長為476nm的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì) a與 b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì) b受蛋白質(zhì) a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使 CFP與 YFP充分靠近發(fā)生熒光共 振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是 YFP 的發(fā)射波長為 527nm的熒

12、光 （圖1）。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表 達，這樣就可以在活細(xì)胞生理條件下研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用。五、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除 精品文檔 蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來新的思路。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個主要的內(nèi)容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量 變，微型化，集 成化，高通量化的抗體芯片就是一個非常好的研究工具，他也是芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。 這些抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應(yīng)用上發(fā)展， 比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)應(yīng)用再眼就的各個領(lǐng)域里。六、免疫共沉淀技術(shù)免疫共沉淀主要是用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)

13、相互作用的一種技術(shù)，其基本原理是，在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再 加入與抗體特 異結(jié)合的結(jié)合于 Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白 A（SPA） ，若細(xì)胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣 一種復(fù)合物： “目的蛋白 興趣蛋白 抗興趣蛋白抗體 |Pansobin ，”因為 SPA|Pansobin 比較大，這樣復(fù)合物在離心時就被分離出 來。經(jīng)變性聚丙烯酰胺 凝膠電泳，復(fù)合物四組分又被分開。然后經(jīng)Western blotting 法，用抗體檢測目的蛋白是什么，是否為預(yù)測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì) 胞內(nèi)天然與興趣蛋白結(jié)合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的蛋白 可信度

14、高。（1）原理 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì) X 的抗體免疫沉淀 X ，那么與 X 在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y 也能沉淀下來。 這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔 缺點：一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中 間起橋梁作用；二是必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇 最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性,三是可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用七、pull-down 技術(shù) 蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型相互作用

15、和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見，最好通過免疫共沉淀（Co- IP）、 Pull-down 技術(shù)或 Far-western法研究。 Pull-down 技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素-、 PolyHis- 或 GST-），從細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過 Pull-down 技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間 的相互作用 關(guān)系，從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關(guān)系。1）原理細(xì)菌表達的谷胱甘肽 s轉(zhuǎn)移酶（ GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST 融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)

16、谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀 GST 融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn) 抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用時，可以啟用 GST 沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。兩種應(yīng)用：1 ）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用2 ）證實探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用生物學(xué)意義是一切：1）通過改變 蛋白質(zhì)的相互作用 ，分析由蛋白質(zhì)相互作用改變而產(chǎn)生的生物學(xué)現(xiàn)象。如通過酵母雙雜交或蛋白質(zhì)組分析 ，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用的生物學(xué)意義。人們?nèi)菀追傅腻e誤是：研究一大堆的蛋白相互作用，卻不知道這些相互作用有什么生物學(xué)意義。2）通過 改

17、變生物學(xué)現(xiàn)象 ，分析其中相關(guān)的蛋白質(zhì)以及相互作用。如小分子化合物抑制了某一生物學(xué)活動，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)變化的蛋白質(zhì)，再分 析蛋白質(zhì)的功能和作用。人們?nèi)菀追傅腻e誤是：找到了平行變化的不相關(guān)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)相互作用的親和力是技術(shù)的基礎(chǔ)。Kd=AB/AB 。Kd越小，親和力越好。抗體的親和力為 10-8 -10-10 M是好,10-6M 是弱 蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用：發(fā)現(xiàn)新的相互作用和相互作用蛋白利用抗原和抗體的相互作用的技術(shù)：1）Westrern blot ：變性抗原，主要用于檢測蛋白的存在與否2）免疫共沉淀 ：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用 AbPr1Pr2：免疫共沉淀。Pr1Ab Pr2：非特

18、異性結(jié)合3）染色質(zhì)沉淀 ：用抗體沉淀抗原得到與抗原結(jié)合的 DNA，用 PCR鑒定 DNA ，從而證明蛋白質(zhì)和特定 DNA 間的相互作用。4）過時的抗體篩選 ：cDNA 表達庫，抗體結(jié)合表達的蛋白質(zhì)，從而得到基因。有了質(zhì)譜和 PCR 后過時。利用已知的相互作用建立 tag：收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除精品文檔1）GST pull down ：已知蛋白質(zhì)和 GST融合，與細(xì)胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白 質(zhì)。 GST tag2）Biotin-Avidin 結(jié)合 ：生物素標(biāo)記已知蛋白質(zhì)，通過 Avidin 結(jié)合生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，從而得到與生物素標(biāo)

19、記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu) 點是 biotin avidin 的結(jié)合是最牢靠的；缺點是細(xì)胞內(nèi)結(jié)合biotin 的蛋白質(zhì)很多。3）其它各種 tag。例子？生物素 -親和素系統(tǒng)（ biotin-avidin system ，BAS ） 是以生物素和親和素具有的獨特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，結(jié)合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分 子生物活性物質(zhì)，它們的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級放大效應(yīng)。自20世紀(jì)70年代， BAS開始應(yīng)用于免疫化學(xué)領(lǐng)域以來，利用BAS可被熒光索、酶、放射性核素等材料標(biāo)記的特點而發(fā)展和建立了許多新的檢測方法和技術(shù)，尤其是與免疫標(biāo)記技術(shù)的有機結(jié)合，極 大地提高了測定的靈敏度。直接利用蛋白質(zhì)的相互作用

20、：1）蛋白質(zhì)親和層析 ：用蛋白質(zhì)當(dāng)親和層析的親和基團。要有大量的蛋白質(zhì)2）酵母雙雜交 ：優(yōu)點是簡單；缺點是不能得到修飾調(diào)控型的相互作用蛋白質(zhì)。還有衍生的酵母三雜交以及單雜交。3）噬菌體展示 ： Physically 固定蛋白質(zhì)，結(jié)合 phage，洗脫，擴增 phage，再結(jié)合；循環(huán)4）快成化石的 Bait 蛋白質(zhì)篩表達庫 ：bait 蛋白質(zhì)用同位素、 GST、等標(biāo)記，再篩庫。5）一網(wǎng)打盡的 蛋白質(zhì)組：這是檢測和鑒定蛋白質(zhì)的方法。由于檢測和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質(zhì)間的相互作用都可以被用于發(fā) 現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和新的相互作用。缺點是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質(zhì)太多常常超出人們的辨別能力和研究能力。技術(shù)成

21、果的鑒定：蛋白質(zhì)相互作用的 生物學(xué)功能 是蛋白質(zhì)相互作用的意義1）相互作用的證實 ：不同的發(fā)現(xiàn)互相作用的技術(shù)都可以用來被驗證相互作用的蛋白質(zhì)。如GST pull down 發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，用免疫共沉淀或酵母雙雜交驗證 。 越接近生理狀態(tài)的證實越好。驗證方法和發(fā)現(xiàn)方法的差別越大驗證結(jié)果也越可靠。采用的方法多，結(jié)果也越可靠。2）相互作用的生物學(xué)功能 ：有重要生物學(xué)功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。 有運氣的成分 。如果從重 要功能蛋白質(zhì)出發(fā)，從重要生物學(xué)現(xiàn)象出發(fā)，“運氣”會越好。生物學(xué)功能的研究：技術(shù)成果的大小 相互作用的生物學(xué)功能研究基本上可以歸為兩類：獲得功能或失去功能

22、。獲得功能 ：轉(zhuǎn)基因表達，使得原本不表達該蛋白質(zhì)的細(xì)胞表達了蛋白質(zhì)，從而和已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，細(xì)胞有新的功能。常用的 方法有細(xì)胞內(nèi) 轉(zhuǎn)基因過表達蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)基因老鼠 。失去功能 ：抑制蛋白質(zhì)的表達或用 dominant negative 突變體，使原有的蛋白質(zhì)缺失或失活，細(xì)胞功能的喪失。常用的方法有： RNA 干擾 使蛋白質(zhì)不表達、 蛋白質(zhì)部分功能片斷的影響 、 基因敲除的細(xì)胞、基因敲除的老鼠。一、一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)： 蛋白質(zhì)相互作用的 親和力 是技術(shù)的基礎(chǔ)。Kd=AB/AB 。Kd越小，親和力越好。抗體的親和力為10-8 -10-10 M是好,10-6M 是弱。1、蛋白質(zhì)相互作用

23、的目的是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用：生化方法 （ co-purification 提純，親和色譜法， GST pull down ,IP ， WB, Far-Western ）Surface plasmon resonance表面等離子體諧振、遺傳分析、 酵母雙雜交、 Fluorescence resonance energy transfer： FRET 熒光共振能量轉(zhuǎn)移、2、注釋： 表面等離子體諧振 （Surface Plasmon Resonance, SPR） 生化分析儀，是基于物理光學(xué)現(xiàn)象和生物傳感技術(shù)的新型生化分析系統(tǒng)。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FPET）：當(dāng)生色團被光照時，被照射激

24、發(fā)的分子可以通過散發(fā)能量來返回到基態(tài)1-3。光能可被生色團在 10-15 秒內(nèi)吸收而在 10-9 秒內(nèi)在發(fā)射出來。然而，也有可能被激發(fā)分子并不發(fā)光而將能量傳遞給別的生色團或是另外的熒光素，這些熒光素可以在 相同的時間量級內(nèi)發(fā)熒光，這后一種現(xiàn)象稱為 FPET.應(yīng)用 ：是比較分子間距離與分子直徑的有效工具，廣泛用于研究各種涉及分子間距離變化的生物現(xiàn)象，可以定量測量兩個發(fā)光基團之間 的距離，在蛋白質(zhì)空間構(gòu)象、蛋白與蛋白間相互作用、核酸與蛋白間相互作用得到廣泛應(yīng)用。3、生化方法的具體實驗：1） GST pull down , 見 ppt252）IP 和 CoIP ：上網(wǎng)查收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理

25、員刪除精品文檔3) Far-Western:a. 不是用抗體直接與膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，而是用另一個蛋白質(zhì)通過相互作用與膜上蛋白質(zhì)作用。b.直接標(biāo)記另一個蛋白質(zhì)或用抗另一個蛋白質(zhì)的抗體做 Western blot 。c.因為是蛋白質(zhì)相互作用， Far-Western 常常會包含一步蛋白質(zhì)復(fù)性的過程。4) SPR：用來監(jiān)控生物特定表面在金屬層的相互作用，通過測量這個相互作用引起的溶液濃度的變化。具體過程？BLAcore SPR 的優(yōu)點：不用標(biāo)記；實時測量4、遺傳方法：例子：有 A ：小量表達；有 B：無表達；有 C：無表達有 A 和 B ：表達增加； 有 A 和 C：小量表達；有 B 和 C：無表達

26、有 A、 B、C：高表達結(jié)論： 在A、B和 C的蛋白質(zhì)復(fù)合體中， A是和基因調(diào)控區(qū)結(jié)合并有小的轉(zhuǎn)錄活性； B可以和 A結(jié)合促進 A的轉(zhuǎn)錄活性； C本身不能直 接促進 A 的活性，所以不大可能和 A 有直接相互作用，但能通過 B 的介導(dǎo)進一步促進轉(zhuǎn)錄。二、研究實例討論：1、G2/M 期阻斷的實驗測定方法：根據(jù) DNA 的含量變化2、親和層吸：對磷酸化蛋白質(zhì)有特異性的結(jié)合(PY 蛋白)3、質(zhì)譜鑒定蛋白4、磷酸化蛋白質(zhì)的驗證5、蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的驗證： Loss of function and gain of function6、進一步尋找相互作用蛋白質(zhì)7、細(xì)胞內(nèi)的定位和細(xì)胞器，與細(xì)胞器的動態(tài)相互作

27、用8、根據(jù)已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的特點，提出功能模型9、模型的驗證10、得到研究結(jié)論12 生化方法 ( Biochemical approaches )1.1 共純化、共沉淀 Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation)在不同基質(zhì)上進行色譜層析1.2 蛋白質(zhì)親和層析( Affinity chromatography ) 將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose)，當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被

28、吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條 件而回收下來。GST pull down ：為了更有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純話的蛋白以融合蛋白的形式表達，即將”誘餌“蛋白與一種易于 純化的配體蛋白融合。例如與 GST融合的蛋白再經(jīng)過 GSH的色譜柱時，就可以通過 GST和 GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)載有細(xì)胞抽提 物經(jīng)過柱時，就可以得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的目標(biāo)蛋白了。Epitope-tag ： 表位附加標(biāo)記技術(shù) 就是將附加的抗原融合到目的蛋白以檢測目的蛋白的表達，同時還可以通過親和層析法來純化目 的蛋白。 缺點 ：表位附加標(biāo)記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。以上兩種

29、方法都要共同的缺點：假陽性。實驗所檢測到的相互作用可能時由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋 白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的；有時會檢測到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。因此實驗 結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗證。1.3 免疫共沉淀( Immunoprecipitation ) 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋 白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認(rèn)為影響；可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。缺點：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時候為直接相互作用的兩種蛋

30、白。另外靈敏度不如親和色譜高。收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除精品文檔1.4 Far-Western又叫做親和印記。將PAGE 膠上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測哪種蛋白能與標(biāo)記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作 用，最后顯影缺點是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復(fù)性。3 表面等離子共振 ( Surface plasmon resonance ) 該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘 餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃 度成線性關(guān)系，由此

31、可以檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點：需要專門的等離子表面共振檢測儀器。芯片比較昂貴，如果重復(fù)使用可能導(dǎo)致結(jié)果不好。4 遺傳學(xué)方法 ( Genetic approaches )3.1 基因外抑制子 基因外抑制子是通過一個基因的突變來彌補原有基因的突變。比如相互作用的蛋白A 和 B，如果 A 發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時 B 如果再發(fā)生彌補性突變就可以使兩者的相互作用恢復(fù)，那么B就是 A 的基因外抑制子。 缺點：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費時。3.2 合成致死篩選 指兩個基因同時發(fā)生突變會產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個基因單獨發(fā)生突變

32、時則無致死效應(yīng)。用于分析兩個具有相同重要蛋白之間的相互作用。5 酵母雙雜交 ( Two-hybrid ) 原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘 餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細(xì)胞中表達，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從 而激活報告基因。優(yōu)點是是酵母細(xì)胞內(nèi)的 in vivo 相互作用，只需要 cDNA ，簡單，弱的相互作用也能檢測到。缺點：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白或者有其他蛋白插足介導(dǎo)或者自身激活報告基因會造成假陽性。融合蛋白會影響蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功 能；不利于核外蛋白研究，會導(dǎo)

33、致假隱性。另外還有酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾；對基因庫的要求比較 高，單向 1/3 是 in frame ；蛋白質(zhì)毒性等。6 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) ( Fluorescence resonance energy transfer)收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除精品文檔指兩個熒光法色基團在足夠近（ 100 埃）時，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對某些刺 激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測大分子的構(gòu)象變化，能夠定性 定量的檢測相互作用的強度。缺點：此項技術(shù)要求發(fā)色基團的距離

34、100 埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合 GFP 給蛋白標(biāo)記。此外還有交聯(lián)技術(shù)（ cross linKing ），蛋白質(zhì)探針技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)（ 相互作用。Phage display）以及生物信息學(xué)的方法來檢測蛋白質(zhì)之間2.2 酵母雙雜交2.2.1 構(gòu)建 pBD-A 與 pAD-I 兩種重組表達質(zhì)粒，這樣使得待研究蛋白可融合 GAL4 激活結(jié)構(gòu)域；2.2.2 pBD-A與 pAD-I 兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化 酵母細(xì)胞。分別設(shè)置如下對照組：pBD / pAD ；pBD-A / pAD ；pBD / pAD-I ；表達 GAL4 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和2.2.3 藍白斑法驗證 LacZ 基因的表達情況。說明:

35、 如果蛋白 A和蛋白 I能夠相互作用，那么 GAL4 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和 GAL4 激活結(jié)構(gòu)域就會相互作用，從而激活lacZ報道基因的表A 和蛋白 I 有相互作用。達。如果設(shè)置的實驗組長出藍色克隆而對照組沒有的話基本上可證明蛋白概述3）研究蛋白質(zhì)相互作用的意義：細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)穩(wěn)定相互作用 -protein complex瞬時相互作用 -enzyme-substrate蛋白質(zhì)相互作用如無相應(yīng)功能是沒有研究意義的！蛋白質(zhì)相互作用 生物學(xué)功能4）蛋白質(zhì)相互作用的親和力 -一切蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ)AB A B Kd=AB/AB （ Kd: dissociation constant ） 收集于網(wǎng)

36、絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除精品文檔5）蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用1、利用抗原和抗體的相互作用Western blot ：變性抗原，主要用于檢測蛋白質(zhì)的存在與否。 免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。Ab Pr1 Pr2：免疫共沉淀 Pr1Ab Pr2：非特異性結(jié)合 染色質(zhì)沉淀：用抗體沉淀抗原得到與抗原結(jié)合的 DNA ，用PCR鑒定DNA ，從而證明蛋白質(zhì)和特定 DNA 間的相互作用2、利用已知的相互作用建立 tagGST pull down ：已知蛋白質(zhì)和 GST 融合，與細(xì)胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)， 即 GST tag。Bi

37、otin Avidin 結(jié)合： Biotin 標(biāo)記已知蛋白質(zhì)，通過 Avidin 結(jié)合 biotin 標(biāo)記的蛋白質(zhì)，從而得到與 biotin 標(biāo)記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu) 點是 biotin avidin 的結(jié)合是最牢靠的；缺點是細(xì)胞內(nèi)結(jié)合biotin 的蛋白質(zhì)很多。3、直接利用蛋白質(zhì)的相互作用 蛋白質(zhì)親和層析：用蛋白質(zhì)當(dāng)親和層析的親和基團。要有大量的蛋白質(zhì)。 酵母雙雜交：優(yōu)點是簡單；缺點是不能得到修飾調(diào)控型的相互作用蛋白質(zhì)。還有衍生的酵母三雜交以及單雜交。 phage display： Physically 固定蛋白質(zhì)，結(jié)合 phage，洗脫，擴增 phage，再結(jié)合；這樣做好幾輪。Bait

38、蛋白質(zhì)篩表達庫： bait 蛋白質(zhì)用同位素、 GST 、等標(biāo)記，再篩庫。 蛋白質(zhì)組：這是檢測和鑒定蛋白質(zhì)的方法。不管用什么方法，只要你能得到結(jié)合的蛋白質(zhì)，理論上蛋白質(zhì)組都可以分析。但由于檢測 和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質(zhì)間的相互作用都可以被用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和新的相互作用。缺點是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質(zhì)太多 常常超出人們的辨別能力和研究能力。11）發(fā)現(xiàn)相互作用的生物學(xué)意義 相互作用的證實：不同的發(fā)現(xiàn)相互作用的技術(shù)都可以被用來驗證相互作用的蛋白質(zhì)。 相互作用的生物學(xué)功能：有重要生物學(xué)功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。12）生物學(xué)功能的研究功能的獲得 ：轉(zhuǎn)基因表達，使得

39、原本不表達該蛋白質(zhì)的細(xì)胞表達了蛋白質(zhì)，從而和已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，細(xì)胞有了新的功 能。常用技術(shù)：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因過表達蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)基因老鼠功能的失去 ：抑制蛋白質(zhì)的表達或用 dominant negative 突變體，使原有的蛋白質(zhì)缺失或失活，細(xì)胞功能的喪失。 常用技術(shù)： RNA 干擾使蛋白質(zhì)不表達、蛋白質(zhì)部分功能片斷的影響、基因敲除的細(xì)胞、基因敲除的老鼠一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)5）生化方法Traditional co-purificationAffinity chromatography（GST pull down）ImmunoprecipitationWestern and Far-Wes

40、tern blota. GST pull down已知蛋白質(zhì)和 GST 融合，與細(xì)胞或組織的 “蛋白質(zhì)湯 ”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。 GST tag 。收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除精品文檔已知蛋白GST（谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶）GST 的結(jié)合較弱！b. 免疫共沉淀免疫沉淀：通過抗原與抗體的結(jié)合得到所要的蛋白質(zhì) 免疫共沉淀：通過抗原與抗體的結(jié)合，得到與該已知蛋白有相互作用的蛋白質(zhì) 優(yōu)點為：（ 1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；（ 3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。

41、缺點為：（ 1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；（2） 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3） 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具 有冒險性。收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系管理員刪除精品文檔c. 蛋白質(zhì)分析技術(shù)：SDSPAGE ：蛋白質(zhì)按分子大小分離。Western Blot ：顯示特異蛋白質(zhì)的技術(shù)。 基本原理：采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過 PAGE 分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（ PVDF 膜全面優(yōu)于 nitrocellulose 膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保 持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，