色譜聯(lián)用技術(shù)及應(yīng)用

1、()色譜聯(lián)用分析技術(shù)概述1聯(lián)用技術(shù)的必要性每種分析方法都有其特長(zhǎng)和局限性。局限性來(lái)自兩個(gè)方面：在線聯(lián)用不僅能取長(zhǎng)補(bǔ)短，而且還具有協(xié)同作用，獲得兩種技術(shù)單獨(dú)使用時(shí)所不具備的某些功能。2實(shí)現(xiàn)在線聯(lián)用的關(guān)鍵硬件接口 (hardwere interface)用于協(xié)調(diào)聯(lián)用的兩種儀器的輸出和輸入之間的矛 盾，使兩種儀器連接成一個(gè)整體。3色譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀色譜：分離光譜:結(jié)構(gòu)鑒定兩者聯(lián)用，不僅可以對(duì)混合物中的各未知組分進(jìn)行定性，也可用 于定量分析。GC-MS, GC-FTIR, LC-MS, LC-FTIR, LC-NMR(-)氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用GOMS1 氣相色譜與“四譜”工作條件的適應(yīng)性方法操作特氣相

2、色譜質(zhì)譜紅外紫外核磁共振氣相是是不希望否否靈敏度（毫微克）是是否取決于樣品否掃描時(shí)間匹配是是否是連續(xù)流動(dòng)是是否否否溫度匹配是否否否工作氣壓是否是是是傅里葉變換紅外；傅里葉變換核磁共振2、氣質(zhì)聯(lián)用接口噴射式分子分離器，適合于填充柱色譜； 工作氣壓不匹配是實(shí)現(xiàn)GC-MS聯(lián)用的主要困難。GC柱的輸出為，而MS離子源在小于的條件下工作。接口的作用是將GC流出的載氣氣壓降低到MS能夠接受的 程度，并將樣品送入MS離子源接口的類型O直接連接，適合于毛細(xì)管色譜。卜噴射式分子分離器的結(jié)構(gòu)T *試樣分子接真空泵。載氣分子作用：降低氣壓；濃縮樣品。3儀器結(jié)構(gòu)GC-MS組成：GC：填充柱毛細(xì)管柱均可MS :常用四極

3、桿質(zhì)譜儀近來(lái)還有離子阱和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀接口:填充柱須用分子分離器毛細(xì)管柱一一直接插入質(zhì)譜儀的離子源數(shù)據(jù)系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)r葉爾囲口色譜四極桿質(zhì)譜儀4.氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)提供的信息 GC-MS-Computer 的工作過(guò)程:0總離子流圖(TIC)質(zhì)譜儀檢測(cè)到的所有離子信號(hào)(不分其質(zhì)荷比)的總和對(duì) 時(shí)間t作圖相當(dāng)于氣相色譜圖。沒(méi)有組分通過(guò)時(shí)為基線；當(dāng)組分流 岀時(shí)，即出現(xiàn)峰。記錄方法：o TIC檢測(cè)器；。計(jì)算機(jī)采集和存儲(chǔ)連續(xù)、重復(fù)掃描的信息，然后進(jìn) 行數(shù)據(jù)處理1625000On i 7 i p: i? r一 raT-i1114一 A1920(2510 : 00 15 - 00 20. 00w 1-axA

4、rZX AXa r某種天然蠟質(zhì)衍生物的GC-MS總離子流圖(2)每個(gè)組分的質(zhì)譜圖4080120160200240 280 320 360 400m/z可從質(zhì)譜圖獲得組分的分子量和分子結(jié)構(gòu)信息。譜庫(kù)檢索根據(jù)NIST, INCOS, PEM三種算法，將未知物圖譜與譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，匹配度越高，可信度越高（3）質(zhì)量色譜圖（提取離子流圖）以的離子強(qiáng)度（而不是總的離子流強(qiáng)度）對(duì)時(shí)間t （或掃描號(hào)）作圖。是計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到的圖。優(yōu)點(diǎn)：可在復(fù)雜混合物的TIC圖中,迅速找到所需檢測(cè)的化合物或同系物。（用于尋找cTI類成分）:0|nJ fl舸舸sO舸的阿ffiLO目質(zhì)量色譜圖II111V西回回I0S3

5、總離子流圖（用于尋找微量成分）5GC_MS的應(yīng)用凡是能用氣相色譜分析的試樣，均適合于GC-MS分析，如O環(huán)境污染物的分析。香精、香料的成分分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)O中草藥的揮發(fā)性成分鑒定O藥物及其他化工產(chǎn)品的分析O毒物、毒品及違禁藥物的鑒定和檢測(cè)等等。(1) GC-MS定性分析分析條件的設(shè)定GC條件：同普通GC，掃描速度，燈MS條件：掃描方式，掃描范絲電流，倍增器電壓等定性分析進(jìn)樣，電離，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，譜圖檢索（2） GC-MS定量分析GC MS定量分析依據(jù)用總離子色譜圖定量用質(zhì)量色譜圖（提取離子色譜圖）定量用選擇離子 色譜圖定量（SIM,選擇離子監(jiān)測(cè)）GGMS定量分析方法外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法有機(jī)氯農(nóng)藥的GC

6、 MS總離子流圖41X0(X1030000002000000IOCOOOO12(4) 8-BHC.環(huán)氧化氯(10) a-氯化短(13)異狄氏劑(16)內(nèi)氮甲橋蔡酮 仃9)內(nèi)氮甲橋荼醛鑒定結(jié)果(2) 3-BHC.庚氯(8) Y氯化烽(11) 4,4 DDE(14)硫丹H(17)硫丹硫酸酯ao213100 4.00 5.00 6.00峰號(hào)No.保留吋間min化合物名稱分子最相對(duì)含量(%)Ml (%)139. 84茨烯 Camphene1365.16901410. 52石竹烯 Caryophyllene20411. 19992011.98大根香葉烯 D Gcmacrcne- D20417.31962

7、112. 23檀紫三烯 Santolina triene13616. 85932513. 133, 7二甲基-1, 3, 7-辛三烯1365.4190（三）液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)LOMS、實(shí)現(xiàn)LC-MS的困難1. LC流動(dòng)相對(duì)MS工作條件的影響 lml溶劑氣化生成500-1300ml的蒸氣。而質(zhì)譜儀只能接受10 ml/min氣體流量有時(shí)流動(dòng)相中含難以揮發(fā)的緩沖鹽2質(zhì)譜離子源溫度、電離方式不適宜液相色譜所分析的樣品。八接口系統(tǒng)1.脫溶劑2使被測(cè)物電離1.粒子束接口 (ParticleBeam, PB)根據(jù)流體力學(xué)原理，利用樣品與溶劑動(dòng)量的不同將它們分開 形成氣溶膠一脫溶劑一動(dòng)量分離得到的譜圖與電子

8、轟擊質(zhì)譜圖非常相似，可利用標(biāo)準(zhǔn) 譜圖檢索 現(xiàn)較少使用/ V6PB18013715116519480El.1372,電噴霧電離（ESI,接口 +軟電離技術(shù)）Charged DropletsAnalyte IonsSolve nt Ion ClustersEvaporationRayl eigh Limi t ReachedSalts/Ion pairsNeutrals電噴霧電離，Electrospray流出液在高電場(chǎng)下形成帶電噴霧，在電場(chǎng)力作用下穿過(guò)氣簾 氣簾 的作用：霧化；蒸發(fā)溶劑；阻止中性溶劑分子特點(diǎn)：是LC- MS的基本配置接口 是一種軟電離方式，適合穩(wěn)定性差、極性 大分子量大的物質(zhì) 的電

9、離。主要生成準(zhǔn)分子離子（M+H +、MH| 、M+Na +等），生物大分析產(chǎn)生多電荷離子。靈敏度高 不適用于非極性化合物的分析A不能進(jìn)行譜庫(kù)檢索對(duì)于大分子化合物，電噴霧產(chǎn)生 多電荷離子，相對(duì)分子質(zhì)量Mr 計(jì)算方法如下：選相鄰峰，電荷弘Z7+1加 I=(MF + H+l)/(W+1)m2=(Mr + n) In893.2942.7998. 11840.6060.I ML*131.1I 十朋2質(zhì)荷比(m/z)電荷數(shù)M相對(duì)分子質(zhì)量(MJ1 542. 041116 951.401 413. 591216 950. 951 304. 931316 950. 941 211.801416 951. 111

10、 131. 121516 951.621 060. 461616 951.26998. 111716 950. 67942. 751816 951. 30893. 151916 950. 71848. 572016 951.25808.212116 951. 14771.92216 950. 721平均16 951.09標(biāo)準(zhǔn)偏差S 10. 305012.11413. 6800吶 10001 10012U091 3001 4001 500mA適用于非極性化合物的分析分子量約為12200的細(xì)胞色素的ESI質(zhì)譜圖10Cytochrome CM.W.=12,200500700900 m11001303

11、大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI)噴霧電離主要 生成溶劑 離子樣品分子 與溶劑離 子反應(yīng)生 成離子簇離子去簇 后送到質(zhì) 譜計(jì)中特點(diǎn):熱噴霧（100-120 C）,化學(xué)電離；適用于弱極性和熱穩(wěn)定化合物分析 化學(xué)電離，軟電離技 術(shù)，產(chǎn)生的碎片很少適用于弱極性、分子 量小（2000D&）和熱穩(wěn)定化合物分析靈敏度高 ESI的補(bǔ)充技術(shù)毛細(xì)管有幾千伏高壓電離液滴中的離子蒸發(fā)原理屬于液相電離應(yīng)用*適合的LC流速為0. 20. 3ml/min*極性和離子化合物*可產(chǎn)生多電荷離子放電針類似于化學(xué)電離屬于氣相電離0. 22ml/min極性

12、較小的化合物 產(chǎn)生單電荷離子、質(zhì)量分析器對(duì)于給定的直流DC和射頻電壓 RF，特定質(zhì)荷比的離子在軸向 穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)，其他質(zhì)荷比的離子 則與電極碰撞湮滅。將DC和 RF以固定的斜率變化，實(shí)現(xiàn)質(zhì) 譜掃描功能。LC-MS （四極桿）聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖Z離了階質(zhì)iffll特定加/z離子在阱內(nèi)定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn),改變I 端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測(cè)器；離子阱的結(jié)構(gòu)示意圖【離子束注入2離子閘門.端電極5 壞形電極6.至電子倍增器7.雙曲線rA)LrI具有相同動(dòng)能、不同質(zhì)量的離子，其飛行速度不同而分離。如果固定離子飛行距離，則不同質(zhì)量離子的飛行時(shí)間不同，質(zhì)量小的漂移時(shí)間試樣 分子流M牡卜y負(fù)沐中憶爲(wèi)壓抽

13、真空離子飛行時(shí)間短而首先到達(dá)檢測(cè)器。、液質(zhì)聯(lián)用的應(yīng)用醫(yī)藥臨床：藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué).雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析.疾病診斷生物化學(xué):肽、蛋白質(zhì)、寡核昔酸、糖環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤/食品/水分析食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物蛋白質(zhì)、致 癌物化學(xué)：有機(jī)合成物丹參中四種丹參酮的1 c-ms-ms oxtanshinone IIA11dihydrota nshinorletanshinoneSIcryptotanshi noneAj*! ” . . - - I .-ILI一-I0 0I0TIC Spectrum of Four Diterpenoids of Radix Salviae

14、Miltiorrhizae口、一rhi 1 qqe z z X S Hcn29000w r 和（四）咼效液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)LC-NMR、HPLC與NMR的比較及聯(lián)用的困難NMRHPLC靈敏度jug ngmg溶劑普通克代溶劑連續(xù)流動(dòng)間歇分析對(duì)象有機(jī)物，生化物質(zhì)，高分子化合物樣品狀態(tài)液態(tài)操作溫度 掃描時(shí)間基本上是室溫 大體相同操作方式1、問(wèn)題的解決主要取決于核磁共振技術(shù)的提高和發(fā)展(1)靈敏度O高頻儀器的使用NMR的信噪比與磁場(chǎng)強(qiáng)度的平方成正比，800 MHz (18. 79T)與100 MHz (2. 35T)儀器相比，信噪比增大約 64倍。O操作參數(shù)的影響HPLC的峰寬峰寬(體積)W

15、NMR檢測(cè)線圈長(zhǎng)度。合適的LC柱的負(fù)載量 內(nèi)徑4. 61UU1色譜柱，合適的 負(fù)載量為lOOjigo采用停流技術(shù)增加檢測(cè)的有效時(shí)間。(2) 溶劑峰的抑制一關(guān)鍵技術(shù)使用克代溶劑使用脈沖序列等乙J溶劑峰采用WET序列進(jìn)行溶劑峰抑制的實(shí)例、聯(lián)用方式實(shí)驗(yàn)布局泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測(cè)器組成 的LC系統(tǒng), 通過(guò)一條2-2. 5ni的特制毛細(xì)管連接到NMR液相探頭 上，探頭底部有閥控制NMR測(cè)定方式。q圖1 HPLC-NMR的實(shí)驗(yàn)布局s 2 HPLC-NMR朕相探頭剖面圖液相探頭帶有一個(gè)流 動(dòng)腔；射頻發(fā)射線圈垂 直固定在流動(dòng)腔的玻璃 管上；接受線圈平行于玻璃 管；流動(dòng)腔不能旋轉(zhuǎn)，NMR 測(cè)定分辨率較差。

16、聯(lián)用模弍。連續(xù)流動(dòng)模式LC的載液帶著試樣組分連續(xù)不斷流入NMR的流動(dòng) 腔，NMR儀器用溶劑峰抑制技術(shù)采集NMR譜圖，得到化學(xué)位移LC 保留時(shí)間的假二維譜。得到的譜圖分辨率和信噪比差。停流技術(shù)（時(shí)間切割譜）當(dāng)色譜峰的最高點(diǎn)到達(dá)流動(dòng)腔的檢測(cè) 位 置時(shí)，關(guān)閉液相探頭底部的進(jìn)口閥，同時(shí)LC的泵停止工作，NMR 進(jìn)行采樣直到獲得滿意的譜圖。峰存儲(chǔ)模式(peak parking )實(shí)際上是一種離線模式。由LC流出的峰存儲(chǔ)在毛細(xì)管回路中，然 后通過(guò)適當(dāng)?shù)拈y系統(tǒng)依次送入N M R探頭 中進(jìn)行NMR測(cè)定，LC分析過(guò)程不中斷。體系中有三個(gè)閥z 12個(gè)存儲(chǔ)峰的毛細(xì)管 回路，整個(gè)過(guò)程由計(jì)算機(jī)控制。AVANCE/習(xí)CO

17、M3(JHPIInjColumn7Tr 20/AnalogSignaJKt ED:J4agneti.二土oopsLC42/2f67 AL?Split HerNMR少叫】8霊H 7DelertorDirect Line Wasteffraction&1朕砒軸MS三種聯(lián)用模式的比較卜流動(dòng)模式：靈敏度和信噪比差，適合于測(cè)定富核，女口舊、呼、3中和富集的13cx 15n；對(duì)舊最小檢測(cè)量(16 次累加)為 lOpig (500MHz) , 3(Tg (300MHz)；T亭流模式:有較好的靈敏度，可測(cè)舊、y “N等。最小檢測(cè)量】H 為 1 ug；峰存儲(chǔ)模式：與停流模式類似。應(yīng)用實(shí)例通過(guò)尿樣分析研究代謝產(chǎn)物

18、A測(cè)定條件：C1 柱，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(210240nm)；梯度洗提A重 水，B 乙月青2-45%進(jìn)樣量和流量流動(dòng)模式70piL, 0. 5mL/min停流模式 100 L, ImL/min停流模式還可測(cè)定二維譜(五)色譜-傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用(GC-FTIR)1. GCFTIR 概述MS一般難于區(qū)分同分異構(gòu)體，單憑MS確定有機(jī)物結(jié)構(gòu) 有時(shí)很困難，甚至不可能。a實(shí)現(xiàn)GC-IR的困難除了工作氣壓匹配之外，其余工作條件的差異很大。尤其是 散射型紅外光譜儀，掃描速度和靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于色譜。A FTIR的出現(xiàn)大大促進(jìn)了 GC-IR的發(fā)展。FTIR具有光通量 大、信噪比好、掃描速度快等優(yōu)點(diǎn)，與GC的匹配性大 大提 咼。2. GCFTTR 系 統(tǒng)GC-FT系統(tǒng)的示意圖MirrorLight-pipeAssemblyGC trsnsfer line 尸示意圖接口 一光管用硼硅玻璃制成；兩端裝有KEr鹽窗，紅外干涉光可以通過(guò);內(nèi)壁鍍金，有高的反射率，紅外干涉光在其中多次反射,增加光程以提高靈敏度可加熱，保證GC流出物不在此冷凝、聚集適當(dāng)?shù)娜莘e，以獲得最佳分辨率和靈敏度光管的體積等于或小于色譜峰平均半寬體積，即Vi/V光管時(shí)，能獲得最佳分辨率和靈敏度。光管的規(guī)格:23(id.) X600400(l)mni適合于填充柱1 (i. d. ) X 100-400(l)min適合于毛細(xì)管柱尾吹裝置：