【精品PPT課件】臨床寄生蟲學(xué)和寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)(免疫學(xué)、分子生物學(xué)診斷)

1、免疫學(xué)診斷技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù) 寄生蟲感染的免疫學(xué)及寄生蟲感染的免疫學(xué)及 分子生物學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù) 免疫學(xué)診免疫學(xué)診 斷技術(shù)斷技術(shù) 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)環(huán)卵沉淀試驗(yàn) 基本原理基本原理 常用方法常用方法 方法評價(jià)方法評價(jià) 適用范圍適用范圍 免疫酶染色試驗(yàn)免疫酶染色試驗(yàn) 染色試驗(yàn)染色試驗(yàn) 環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)環(huán)蚴沉淀試驗(yàn) 間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn) 間接熒光抗體試驗(yàn)間接熒光抗體試驗(yàn) 常規(guī)常規(guī)elisaelisa 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌a a蛋白蛋白elisaelisa 生物素生物素- -親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng)elisaeli

2、sa 酶標(biāo)記抗原對流免疫電泳酶標(biāo)記抗原對流免疫電泳 酶聯(lián)免疫印跡技術(shù)酶聯(lián)免疫印跡技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 寄生蟲感染的免疫學(xué)及寄生蟲感染的免疫學(xué)及 分子生物學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù) n免疫學(xué)診斷技術(shù) n現(xiàn)有的多種免疫學(xué)檢測技術(shù)均現(xiàn)有的多種免疫學(xué)檢測技術(shù)均 已被應(yīng)用于寄生蟲病的臨床診已被應(yīng)用于寄生蟲病的臨床診 斷或流行病學(xué)研究。本章僅介斷或流行病學(xué)研究。本章僅介 紹幾種寄生蟲病診斷特有的免紹幾種寄生蟲病診斷特有的免 疫檢測技術(shù)疫檢測技術(shù) 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)環(huán)卵沉淀試驗(yàn) n環(huán)卵沉淀試驗(yàn)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)(circumoval (circumoval precipitin test,coptp

3、recipitin test,copt) )由由oliveroliver gonzalez(1954)gonzalez(1954)最早用于曼氏血吸蟲最早用于曼氏血吸蟲 病的診斷病的診斷, ,獲得了較好的結(jié)果獲得了較好的結(jié)果, ,陽性率陽性率 達(dá)達(dá)100100, ,假陽性率為假陽性率為8.38.3。 n國內(nèi)亦于國內(nèi)亦于19581958年開始應(yīng)用該法診斷日年開始應(yīng)用該法診斷日 本血吸蟲病本血吸蟲病, ,取得了滿意效果。目前取得了滿意效果。目前 coptcopt仍是國內(nèi)診斷血吸蟲病最常用的仍是國內(nèi)診斷血吸蟲病最常用的 方法之一方法之一 n基本原理基本原理: :環(huán)卵沉淀試驗(yàn)為抗原機(jī)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)為抗原機(jī)

4、 體反應(yīng)的一種類型體反應(yīng)的一種類型, ,屬免疫沉淀反屬免疫沉淀反 應(yīng)。當(dāng)成熟血吸蟲卵內(nèi)毛蚴的分泌、應(yīng)。當(dāng)成熟血吸蟲卵內(nèi)毛蚴的分泌、 排泄物抗原經(jīng)卵殼微孔透出殼外與排泄物抗原經(jīng)卵殼微孔透出殼外與 血吸蟲病患者血清中相應(yīng)抗體結(jié)合血吸蟲病患者血清中相應(yīng)抗體結(jié)合 后后, ,在蟲卵周圍形成具有一定折光在蟲卵周圍形成具有一定折光 性的特異性的泡狀、指狀、帶狀或性的特異性的泡狀、指狀、帶狀或 片狀沉淀物片狀沉淀物, ,即為陽性反應(yīng)即為陽性反應(yīng) 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)基本原理基本原理 n免疫沉淀物的形成取決于蟲卵內(nèi)分免疫沉淀物的形成取決于蟲卵內(nèi)分 泌、排出物透過卵殼微孔的量泌、排出物透過卵殼微孔的量,以以

5、及血吸蟲病人血清中特異性抗體水及血吸蟲病人血清中特異性抗體水 平。在正常人血清中平。在正常人血清中,因無相應(yīng)的因無相應(yīng)的 抗體存在抗體存在,故蟲卵周圍不出現(xiàn)特異故蟲卵周圍不出現(xiàn)特異 性沉淀物性沉淀物,即為陰性即為陰性 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)基本原理環(huán)卵沉淀試驗(yàn)基本原理 n常規(guī)常規(guī)coptcopt需用熔化的石蠟劃蠟線、密封蓋片需用熔化的石蠟劃蠟線、密封蓋片, , 操作步驟繁瑣操作步驟繁瑣, ,不易于標(biāo)準(zhǔn)化不易于標(biāo)準(zhǔn)化, ,因此現(xiàn)有了許因此現(xiàn)有了許 多改進(jìn)方法多改進(jìn)方法, ,例如例如: : n 塑料管法塑料管法copt:copt:是應(yīng)用聚乙烯塑料管是應(yīng)用聚乙烯塑料管(2mm)(2mm) 采集血樣采集血樣,

6、,分離血清分離血清, ,并在管內(nèi)加入干卵孵育。并在管內(nèi)加入干卵孵育。 該法操作簡單、適于現(xiàn)場應(yīng)用該法操作簡單、適于現(xiàn)場應(yīng)用, ,但在大規(guī)模但在大規(guī)模 查病時(shí)難于達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化和操作規(guī)范化的要求。查病時(shí)難于達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化和操作規(guī)范化的要求。 本法也具有很高的敏感性和特異性本法也具有很高的敏感性和特異性 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)常用方法環(huán)卵沉淀試驗(yàn)常用方法 雙面膠紙條法環(huán)卵沉淀試驗(yàn)雙面膠紙條法環(huán)卵沉淀試驗(yàn) (dgs(dgscopt)copt) n是將雙面膠紙條制成特定的式樣作是將雙面膠紙條制成特定的式樣作 copt,copt,省卻常規(guī)法劃蠟線、蠟封片等繁省卻常規(guī)法劃蠟線、蠟封片等繁 瑣步驟瑣步驟, ,操作簡單較規(guī)范操

7、作簡單較規(guī)范, ,適于現(xiàn)場及適于現(xiàn)場及 臨床使用。但該法仍需實(shí)驗(yàn)者臨時(shí)加臨床使用。但該法仍需實(shí)驗(yàn)者臨時(shí)加 入蟲卵，使其難于達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化入蟲卵，使其難于達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化 npvfpvf抗原片法抗原片法: :以以pvfpvf膜為載體膜為載體, ,將于卵用將于卵用5 5 棉膠液粘附劑預(yù)置其上棉膠液粘附劑預(yù)置其上, ,試驗(yàn)時(shí)加入待檢者試驗(yàn)時(shí)加入待檢者 血清即可血清即可, ,操作方法極其簡便易行操作方法極其簡便易行, ,且抗原且抗原 片便于攜帶、郵寄、還可保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。片便于攜帶、郵寄、還可保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 由固定的實(shí)驗(yàn)人員統(tǒng)一滴加蟲卵由固定的實(shí)驗(yàn)人員統(tǒng)一滴加蟲卵, ,使卵數(shù)較使卵數(shù)較 一致一致, ,易達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化易

8、達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化, ,適于現(xiàn)場應(yīng)用。適于現(xiàn)場應(yīng)用。 n血凝板法血凝板法: :將血清及干卵加入血凝板孔中省將血清及干卵加入血凝板孔中省 卻了劃蠟線的步驟。卻了劃蠟線的步驟。 pvfpvf抗原片法及血凝板法抗原片法及血凝板法 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)環(huán)卵沉淀試驗(yàn) 組織內(nèi)環(huán)卵沉淀反應(yīng)組織內(nèi)環(huán)卵沉淀反應(yīng) n又稱卵內(nèi)沉淀反應(yīng)又稱卵內(nèi)沉淀反應(yīng)(intraoval (intraoval precipitin reaction,iopprecipitin reaction,iop),),是以血吸是以血吸 蟲病鼠肝組織制成的石蠟切片為抗原蟲病鼠肝組織制成的石蠟切片為抗原 與受檢者血清作用后與受檢者血清作用后, ,如在蟲卵內(nèi)、卵如在

9、蟲卵內(nèi)、卵 黃膜與毛蚴之間或在毛蚴的表面出現(xiàn)黃膜與毛蚴之間或在毛蚴的表面出現(xiàn) 泡狀、指狀或條帶狀有明顯折光性的泡狀、指狀或條帶狀有明顯折光性的 沉淀物即為陽性沉淀物即為陽性, ,其敏感性和特異性同其敏感性和特異性同 常規(guī)法常規(guī)法coptcopt試驗(yàn)無顯著性差異試驗(yàn)無顯著性差異 n是環(huán)卵沉淀反應(yīng)結(jié)合酶免疫測定技術(shù)的一是環(huán)卵沉淀反應(yīng)結(jié)合酶免疫測定技術(shù)的一 種改進(jìn)方法種改進(jìn)方法, ,其基本原理是先在酶標(biāo)反應(yīng)板其基本原理是先在酶標(biāo)反應(yīng)板 中進(jìn)行環(huán)卵沉淀試驗(yàn)中進(jìn)行環(huán)卵沉淀試驗(yàn), ,洗去待檢血清后加入洗去待檢血清后加入 酶標(biāo)記的羊抗人酶標(biāo)記的羊抗人iggigg孵育孵育, ,經(jīng)洗滌后加入聯(lián)經(jīng)洗滌后加入聯(lián) 苯

10、胺底物顯色。如蟲卵周圍及蟲卵內(nèi)有棕苯胺底物顯色。如蟲卵周圍及蟲卵內(nèi)有棕 色沉淀物即為陽性色沉淀物即為陽性, ,反之則為陰性。該法具反之則為陰性。該法具 有高度的敏感性有高度的敏感性, ,特異性可達(dá)特異性可達(dá)100100, ,平均環(huán)平均環(huán) 沉率顯著高于常規(guī)沉率顯著高于常規(guī)coptcopt試驗(yàn)法試驗(yàn)法, ,且總試驗(yàn)時(shí)且總試驗(yàn)時(shí) 間可縮短間可縮短2424小時(shí)出結(jié)果小時(shí)出結(jié)果 酶聯(lián)環(huán)卵沉淀反應(yīng)酶聯(lián)環(huán)卵沉淀反應(yīng) (enzyme(enzymelinked copt,flcopt)linked copt,flcopt) 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)方法評價(jià)方法評價(jià) ncoptcopt為血吸蟲病所特有的免疫學(xué)診斷

11、方法為血吸蟲病所特有的免疫學(xué)診斷方法, , 具有較高的敏感性具有較高的敏感性(94.1(94.198.698.6) )和特和特 異性異性(1.9(1.93.63.6) )。主要用于：。主要用于： n作為血吸蟲病的輔助診斷及病原治療的作為血吸蟲病的輔助診斷及病原治療的 依據(jù)依據(jù), ,對無血吸蟲病史人群和距末次治療對無血吸蟲病史人群和距末次治療3 3 年以上的血吸蟲病病人年以上的血吸蟲病病人, ,若環(huán)沉率在若環(huán)沉率在3 3或或3 3 以上者以上者, ,可結(jié)合臨床表現(xiàn)給予治療可結(jié)合臨床表現(xiàn)給予治療, ,目前目前 多將此治療標(biāo)準(zhǔn)降至多將此治療標(biāo)準(zhǔn)降至1 1的環(huán)沉率的環(huán)沉率 n作為血吸蟲病血清流行病學(xué)調(diào)

12、查及疫情監(jiān)測的作為血吸蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查及疫情監(jiān)測的 方法方法, ,在血吸蟲病流行區(qū)在血吸蟲病流行區(qū),copt,copt環(huán)沉率的消長情況環(huán)沉率的消長情況, , 能反映感染人群血清特異性抗體水平的動(dòng)態(tài)變化能反映感染人群血清特異性抗體水平的動(dòng)態(tài)變化, , 用以了解疫情趨勢用以了解疫情趨勢, ,特別在達(dá)到傳播控制和傳播特別在達(dá)到傳播控制和傳播 陰轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測地區(qū)陰轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測地區(qū), ,可用作監(jiān)測的方法之一可用作監(jiān)測的方法之一 n考核防治效果考核防治效果, ,經(jīng)有效藥物經(jīng)有效藥物( (吡喹酮吡喹酮) )治療后治療后1 1年年 病人病人coptcopt陰轉(zhuǎn)率達(dá)陰轉(zhuǎn)率達(dá) 27.127.1, ,治后治后2

13、 2年陰轉(zhuǎn)率年陰轉(zhuǎn)率4040 以上以上, ,治后治后4 4年病人血清年病人血清coptcopt的陰轉(zhuǎn)率的陰轉(zhuǎn)率8080以上以上 n適用范圍適用范圍 加吸蟲病的輔助診斷、療效考核、流加吸蟲病的輔助診斷、療效考核、流 行病學(xué)調(diào)查及疫情監(jiān)測行病學(xué)調(diào)查及疫情監(jiān)測 環(huán)卵沉淀試驗(yàn)方法評價(jià)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)方法評價(jià) n免疫酶技術(shù)主要是利用免疫反應(yīng)的高度特異免疫酶技術(shù)主要是利用免疫反應(yīng)的高度特異 性和酶促反應(yīng)高效性的特點(diǎn)性和酶促反應(yīng)高效性的特點(diǎn), ,在保持抗原抗在保持抗原抗 體免疫活性和酶的催化活性的基礎(chǔ)上體免疫活性和酶的催化活性的基礎(chǔ)上, ,將酶將酶 標(biāo)記于抗原或抗體之上標(biāo)記于抗原或抗體之上, ,使特異性免疫反應(yīng)

14、使特異性免疫反應(yīng) 同酶促反應(yīng)相結(jié)合同酶促反應(yīng)相結(jié)合, ,從而使測定方法達(dá)到高從而使測定方法達(dá)到高 度特異性和敏感性。免疫酶染色試驗(yàn)度特異性和敏感性。免疫酶染色試驗(yàn) (immunoenzvmaticstaining test,iest(immunoenzvmaticstaining test,iest) )是是 免疫酶檢測技術(shù)的一種。免疫酶檢測技術(shù)的一種。kamiyakamiya等等 (1981)(1981) 最早以組織內(nèi)蟲卵石蠟切片為抗原作最早以組織內(nèi)蟲卵石蠟切片為抗原作iestiest試試 驗(yàn)診斷日本血吸蟲病驗(yàn)診斷日本血吸蟲病, ,國內(nèi)首先用微絲蚴固國內(nèi)首先用微絲蚴固 相抗原作相抗原作ies

15、tiest診斷絲蟲病均取得滿意結(jié)果診斷絲蟲病均取得滿意結(jié)果 免疫酶染色試驗(yàn)免疫酶染色試驗(yàn) niestiest是以寄生蟲各個(gè)生活史時(shí)期是以寄生蟲各個(gè)生活史時(shí)期( (如成蟲、如成蟲、 幼蟲、蟲卵或原蟲滋養(yǎng)體等幼蟲、蟲卵或原蟲滋養(yǎng)體等) )制成的切片或制成的切片或 涂片作為固相抗原涂片作為固相抗原, ,與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體 特異性結(jié)合后特異性結(jié)合后, ,再與酶再與酶( (辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶hrp)hrp) 標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合 物物, ,加入相應(yīng)底物加入相應(yīng)底物( (二氨基聯(lián)苯胺二氨基聯(lián)苯胺,dab),dab)后酶

16、后酶 催化底物即出現(xiàn)顯色反應(yīng)催化底物即出現(xiàn)顯色反應(yīng), ,用光學(xué)顯微鏡觀用光學(xué)顯微鏡觀 察即可判斷結(jié)果。如無特異性抗體即不能形察即可判斷結(jié)果。如無特異性抗體即不能形 成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物, ,加入底物后加入底物后, ,因無酶的因無酶的 催化作用催化作用, ,而不能產(chǎn)生顏色反應(yīng)而不能產(chǎn)生顏色反應(yīng), ,則為陰性則為陰性 免疫酶染色試驗(yàn)免疫酶染色試驗(yàn)基本原理基本原理 niestiest用于診斷日本血吸蟲病時(shí)用于診斷日本血吸蟲病時(shí), ,以肝組織內(nèi)蟲卵以肝組織內(nèi)蟲卵 肉芽腫切片作固相抗原的診斷效果優(yōu)于成蟲切片肉芽腫切片作固相抗原的診斷效果優(yōu)于成蟲切片 抗原抗原, ,而蟲卵切片抗原則以冰凍切

17、片抗原優(yōu)于石而蟲卵切片抗原則以冰凍切片抗原優(yōu)于石 蠟切片抗原蠟切片抗原 n以肝組織蟲卵冰凍切片作以肝組織蟲卵冰凍切片作iestiest四次對比檢測血吸四次對比檢測血吸 蟲病人的陽性符合率達(dá)蟲病人的陽性符合率達(dá) 87.387.3-99-99, ,假陽性率假陽性率 1.31.3-5.2-5.2, ,僅同姜片蟲病和肺吸蟲病各有僅同姜片蟲病和肺吸蟲病各有4 4 的交叉反應(yīng)的交叉反應(yīng), ,病人治愈后病人治愈后3-103-10年的陰轉(zhuǎn)率達(dá)年的陰轉(zhuǎn)率達(dá)70.870.8 -93.7-93.7 n表明該法診斷血吸蟲病具有較高的敏感性、特異表明該法診斷血吸蟲病具有較高的敏感性、特異 性和重現(xiàn)性性和重現(xiàn)性, ,并有

18、一定的療效考核價(jià)值并有一定的療效考核價(jià)值 免疫酶染色試驗(yàn)免疫酶染色試驗(yàn)方法評價(jià)方法評價(jià) n以馬來絲蟲成蟲冰凍切片作以馬來絲蟲成蟲冰凍切片作iestiest檢測班氏微檢測班氏微 絲蚴血癥者陽性率達(dá)絲蚴血癥者陽性率達(dá)91.291.294.394.3, ,健康健康 人假陽性率為人假陽性率為2.62.64.44.4, ,且可用牛腹腔且可用牛腹腔 絲蟲成蟲切片抗原代替人絲蟲作絲蟲成蟲切片抗原代替人絲蟲作iestiest亦取得亦取得 相似的診斷效果相似的診斷效果 n以華枝睪吸蟲成蟲切片抗原作以華枝睪吸蟲成蟲切片抗原作iestiest診斷華支診斷華支 睪吸蟲病亦具有較高的敏感性和特異性睪吸蟲病亦具有較高的敏

19、感性和特異性 niestiest用于寄生蟲病的診斷具有敏感性高、特用于寄生蟲病的診斷具有敏感性高、特 異性強(qiáng)、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好的特點(diǎn)異性強(qiáng)、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好的特點(diǎn), ,且該法且該法 抗原用量少、簡便易行抗原用量少、簡便易行, ,抗原片置抗原片置2020以以 下可長期保存下可長期保存, ,光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果 免疫酶染色試驗(yàn)免疫酶染色試驗(yàn)方法評價(jià)方法評價(jià) n結(jié)果判定不必立即進(jìn)行結(jié)果判定不必立即進(jìn)行, ,可保存集中檢查可保存集中檢查, , 并可保留結(jié)果以利復(fù)查。但該法所用抗并可保留結(jié)果以利復(fù)查。但該法所用抗 原及操作方法尚需標(biāo)準(zhǔn)化。在實(shí)際應(yīng)用原及操作方法尚需標(biāo)準(zhǔn)化。在實(shí)際應(yīng)用 中中

20、, ,冰凍切片抗原優(yōu)于石蠟切片冰凍切片抗原優(yōu)于石蠟切片, ,但需注但需注 意冰凍切片在試驗(yàn)洗滌過程中易于脫片意冰凍切片在試驗(yàn)洗滌過程中易于脫片 等問題等問題 n適用范圍適用范圍: :用于血吸蟲病、絲蟲病、肝吸用于血吸蟲病、絲蟲病、肝吸 蟲病、豬囊尾蚴病、肺吸蟲病、旋毛蟲蟲病、豬囊尾蚴病、肺吸蟲病、旋毛蟲 病、弓形蟲病等的實(shí)驗(yàn)室診斷及流行病病、弓形蟲病等的實(shí)驗(yàn)室診斷及流行病 學(xué)調(diào)查學(xué)調(diào)查 免疫酶染色試驗(yàn)免疫酶染色試驗(yàn)方法評價(jià)方法評價(jià) 染色試驗(yàn)染色試驗(yàn) n染色試驗(yàn)染色試驗(yàn)(dye test,dt(dye test,dt) )由由sabinsabin和和 feldman(1948feldman(19

21、48年年) )創(chuàng)用創(chuàng)用, ,為弓形蟲病獨(dú)特的為弓形蟲病獨(dú)特的 免疫學(xué)診斷方法免疫學(xué)診斷方法 n基本原理基本原理: :新鮮活弓形蟲滋養(yǎng)體胞質(zhì)對堿性新鮮活弓形蟲滋養(yǎng)體胞質(zhì)對堿性 美藍(lán)染劑具有很強(qiáng)的親和力美藍(lán)染劑具有很強(qiáng)的親和力, ,能被其染成藍(lán)能被其染成藍(lán) 色。但當(dāng)弓形蟲受特異性抗體和輔助因子色。但當(dāng)弓形蟲受特異性抗體和輔助因子 (accessory factor,af(accessory factor,af) )協(xié)同作用后協(xié)同作用后, ,細(xì)胞變細(xì)胞變 性。胞膜破裂、胞質(zhì)外溢性。胞膜破裂、胞質(zhì)外溢, ,蟲體則不能著色。蟲體則不能著色。 afaf為正常人血清成份為正常人血清成份, ,其中含有補(bǔ)體、備

22、解其中含有補(bǔ)體、備解 素和素和mg2mg2 等 等 nafaf不耐熱不耐熱, ,故應(yīng)在采血后立即分離血清故應(yīng)在采血后立即分離血清 進(jìn)行篩選進(jìn)行篩選, ,2020保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆? ,將經(jīng)將經(jīng) 56560 0c30minc30min滅活的待檢血清同滋養(yǎng)體及滅活的待檢血清同滋養(yǎng)體及 輔助因子作用后加堿性美藍(lán)染液染色輔助因子作用后加堿性美藍(lán)染液染色 后后, ,如有如有5050或以上蟲體不著色者或以上蟲體不著色者, ,即即 可判為陽性?？墒箍膳袨殛栃??？墒?050蟲體不著色的蟲體不著色的 血清稀釋度即為血清陽性液度血清稀釋度即為血清陽性液度 染色試驗(yàn)原理染色試驗(yàn)原理 n該法敏感性高、特異性強(qiáng)該法敏感性

23、高、特異性強(qiáng), ,具有早期診斷價(jià)值具有早期診斷價(jià)值, ,一一 般在感染弓形蟲后般在感染弓形蟲后8 81010天天, ,人血清中即出現(xiàn)抗弓人血清中即出現(xiàn)抗弓 形蟲膜抗原的抗體形蟲膜抗原的抗體,dt,dt試驗(yàn)即出現(xiàn)陽性反應(yīng)試驗(yàn)即出現(xiàn)陽性反應(yīng) n血清陽性滴度血清陽性滴度1:81:8判為隱性感染判為隱性感染,1:256,1:256的為活動(dòng)性的為活動(dòng)性 感染感染,1:1024,1:1024為急性感染為急性感染 ndtdt試驗(yàn)除肉孢子蟲外與其它寄生蟲無交叉反應(yīng)。試驗(yàn)除肉孢子蟲外與其它寄生蟲無交叉反應(yīng)。 但該法所用輔助因子需從健康人血清中分離但該法所用輔助因子需從健康人血清中分離, ,并進(jìn)并進(jìn) 行篩選試驗(yàn)行

24、篩選試驗(yàn), ,符合要求方可使用符合要求方可使用, ,且效能難于一致且效能難于一致 n新鮮活蟲體作抗原有一定的實(shí)驗(yàn)室感染危險(xiǎn)性新鮮活蟲體作抗原有一定的實(shí)驗(yàn)室感染危險(xiǎn)性, ,故故 限制了該法的推廣及一般實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場應(yīng)用限制了該法的推廣及一般實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場應(yīng)用 n適用范圍適用范圍: :弓形蟲病的輔助診斷弓形蟲病的輔助診斷 染色試驗(yàn)方法評價(jià)染色試驗(yàn)方法評價(jià) n環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)(circumlarval (circumlarval precipitin test,cptprecipitin test,cpt) )為旋毛蟲病特為旋毛蟲病特 有的血清學(xué)試驗(yàn)。將分離的旋毛蟲幼有的血清學(xué)試驗(yàn)。將分離的旋毛

25、蟲幼 蟲與旋毛蟲病患者血清在體外共同孵蟲與旋毛蟲病患者血清在體外共同孵 育后育后, ,幼蟲分泌、排泄物幼蟲分泌、排泄物( (即抗原即抗原) )與與 特異性抗體結(jié)合特異性抗體結(jié)合, ,在幼蟲體表在幼蟲體表, ,特別是特別是 口及肛門部出現(xiàn)具有折光性的團(tuán)塊狀口及肛門部出現(xiàn)具有折光性的團(tuán)塊狀 或泡狀沉淀物或泡狀沉淀物, ,即為陽性即為陽性 環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)環(huán)蚴沉淀試驗(yàn) n本法具有較高的敏感性和特異性本法具有較高的敏感性和特異性, ,同旋毛蟲同旋毛蟲 病人的陽性符合率達(dá)病人的陽性符合率達(dá) 97.697.6100100, ,特異特異 性達(dá)性達(dá)100100 -與蛔蟲病、鉤蟲病、絲蟲病、鞭蟲病等無交叉與蛔蟲病、

26、鉤蟲病、絲蟲病、鞭蟲病等無交叉 反應(yīng)。感染后反應(yīng)。感染后3 3周或癥狀出現(xiàn)后周或癥狀出現(xiàn)后10102020天呈陽性天呈陽性 反應(yīng)反應(yīng) -由于該法活幼蟲抗原材料分離較繁瑣由于該法活幼蟲抗原材料分離較繁瑣, ,供應(yīng)及保供應(yīng)及保 存都有困難存都有困難, ,且實(shí)驗(yàn)者有感染的危險(xiǎn)且實(shí)驗(yàn)者有感染的危險(xiǎn), ,故限制了故限制了 它的推廣應(yīng)用它的推廣應(yīng)用 -用凍干幼蟲和干燥幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用凍干幼蟲和干燥幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn), ,效果滿意效果滿意, ,該該 法操作簡單法操作簡單, ,無需特殊儀器設(shè)備無需特殊儀器設(shè)備, ,適于基層應(yīng)用適于基層應(yīng)用 n適用范圍適用范圍: :用于旋毛蟲病的輔助診斷用于旋毛蟲病的輔助診斷 環(huán)蚴沉淀

27、試驗(yàn)方法評價(jià)環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)方法評價(jià) n間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(indirect haema- gglutination test，iha)簡稱間接血凝試 驗(yàn),本試驗(yàn)操作簡便快速、器材簡單、具有 較高的敏感性和一定的特異性。國外普遍用 于流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查。主要的 局限性在于抗原致敏血細(xì)胞的批間差異懸殊, 以致結(jié)果不穩(wěn)定,重復(fù)性欠佳 n近年來由于抗原純化技術(shù)和冰凍干燥技術(shù)等 的發(fā)展,在致敏血細(xì)胞的制備和保存方面有 了新的進(jìn)展,凍干的致敏血細(xì)胞逐步向商品 化方向發(fā)展,不僅方便現(xiàn)場使用并為血凝試 驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化提供了條件 間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)基本原理基本原理 n以人以人o o型紅細(xì)胞或綿羊紅細(xì)胞

28、為載體型紅細(xì)胞或綿羊紅細(xì)胞為載體, , 經(jīng)特殊處理后吸附上特異性抗原經(jīng)特殊處理后吸附上特異性抗原, ,此結(jié)此結(jié) 合有抗原的紅細(xì)胞叫做致敏紅細(xì)胞合有抗原的紅細(xì)胞叫做致敏紅細(xì)胞, ,在在 遇到相應(yīng)的抗體后發(fā)生特異性結(jié)合遇到相應(yīng)的抗體后發(fā)生特異性結(jié)合, ,致致 使紅細(xì)胞發(fā)生交聯(lián)而凝集成肉眼可見使紅細(xì)胞發(fā)生交聯(lián)而凝集成肉眼可見 的團(tuán)塊的團(tuán)塊, ,即為陽性即為陽性 n無特異性抗體存在則紅細(xì)胞不發(fā)生凝無特異性抗體存在則紅細(xì)胞不發(fā)生凝 集而均勻地沉積于板底，是為陰性集而均勻地沉積于板底，是為陰性 n將特異性抗體吸附于紅細(xì)胞表面將特異性抗體吸附于紅細(xì)胞表面, ,制備致敏制備致敏 紅細(xì)胞來檢測特異性抗原則稱之為

29、反向間接紅細(xì)胞來檢測特異性抗原則稱之為反向間接 血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)(reverse indirect (reverse indirect haemagglutinationhaemagglutination test) test) n用已知抗原或抗體預(yù)先與待測標(biāo)本作用用已知抗原或抗體預(yù)先與待測標(biāo)本作用, ,以以 中和相應(yīng)的抗體或抗原中和相應(yīng)的抗體或抗原, ,再加入相應(yīng)的致敏再加入相應(yīng)的致敏 紅細(xì)胞紅細(xì)胞, ,由于與致敏紅細(xì)胞相應(yīng)的抗原或抗由于與致敏紅細(xì)胞相應(yīng)的抗原或抗 體已被中和體已被中和, ,無法交聯(lián)以致紅細(xì)胞不能發(fā)生無法交聯(lián)以致紅細(xì)胞不能發(fā)生 凝集凝集, ,即為陽性即為陽性, ,此稱為間接血

30、凝抑制試驗(yàn)此稱為間接血凝抑制試驗(yàn) (indirect haemagglutination(indirect haemagglutination inhibition inhibition test) test) 間接血凝試驗(yàn)基本原理間接血凝試驗(yàn)基本原理 n間接血凝試驗(yàn)方法簡單間接血凝試驗(yàn)方法簡單, ,取材方便取材方便, ,以紅細(xì)以紅細(xì) 胞為載體胞為載體, ,大小均勻大小均勻, ,性能穩(wěn)定性能穩(wěn)定, ,可用人的可用人的 “o”o”型紅細(xì)胞或綿羊紅細(xì)胞型紅細(xì)胞或綿羊紅細(xì)胞, ,紅色起到指紅色起到指 示劑作用示劑作用, ,便于肉眼觀察。肉眼判斷結(jié)果便于肉眼觀察。肉眼判斷結(jié)果, , 不需特殊儀器設(shè)備不

31、需特殊儀器設(shè)備, ,且具有較高的敏感性和且具有較高的敏感性和 特異性特異性 n診斷日本血吸蟲病診斷日本血吸蟲病, ,陽性率達(dá)陽性率達(dá)929298.798.7, , 非疫區(qū)正常人群的假陽性率非疫區(qū)正常人群的假陽性率0 02.52.5 n肝吸蟲病檢測陽性符合率達(dá)肝吸蟲病檢測陽性符合率達(dá)68689898 n豬囊尾蚴病的診斷豬囊尾蚴病的診斷, ,陽性率為陽性率為89.689.69090, , 假陽性率假陽性率1.51.51010 間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)方法評價(jià)方法評價(jià) n對于弓形蟲病的診斷與染色試驗(yàn)的陽性符合對于弓形蟲病的診斷與染色試驗(yàn)的陽性符合 率為率為9090左右左右; ;對瘧疾的診斷效果不夠穩(wěn)

32、定對瘧疾的診斷效果不夠穩(wěn)定, , 原因之一是沒有好的純化的抗原。本法用于原因之一是沒有好的純化的抗原。本法用于 寄生蟲病的普查過篩及流行病學(xué)調(diào)查寄生蟲病的普查過篩及流行病學(xué)調(diào)查, ,是一種是一種 極為簡便、快速、實(shí)用的有效方法。不足之極為簡便、快速、實(shí)用的有效方法。不足之 處是有發(fā)生非特異性凝集的現(xiàn)象處是有發(fā)生非特異性凝集的現(xiàn)象, ,應(yīng)注意鑒別應(yīng)注意鑒別 和消除和消除 n適用范圍適用范圍 n用于血吸蟲病、弓形蟲病、利什曼原蟲病、鉤蟲用于血吸蟲病、弓形蟲病、利什曼原蟲病、鉤蟲 病、棘球蚴病、旋毛蟲病、肺吸蟲病、阿米巴病、病、棘球蚴病、旋毛蟲病、肺吸蟲病、阿米巴病、 瘧疾的免疫學(xué)輔助診斷和流行病學(xué)

33、調(diào)查瘧疾的免疫學(xué)輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查 間接血凝試驗(yàn)方法評價(jià)間接血凝試驗(yàn)方法評價(jià) 間接熒光抗體試驗(yàn)間接熒光抗體試驗(yàn) n間接熒光抗體試驗(yàn)間接熒光抗體試驗(yàn)(indirect fluorescent (indirect fluorescent antibody testantibody test，ifa)ifa)是一種實(shí)用的免疫標(biāo)是一種實(shí)用的免疫標(biāo) 記技術(shù)之一記技術(shù)之一, ,它具有免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與它具有免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與 熒光技術(shù)的敏感性熒光技術(shù)的敏感性 n基本原理基本原理 將熒光素如異硫氰酸熒光黃將熒光素如異硫氰酸熒光黃 (fluorescein isothiacyanate,fitc(fl

34、uorescein isothiacyanate,fitc) )與抗與抗 免疫球蛋白抗體免疫球蛋白抗體( (如羊抗人如羊抗人iggigg) )結(jié)合制成熒結(jié)合制成熒 光素標(biāo)記第二抗體。當(dāng)固相抗原與待測血清光素標(biāo)記第二抗體。當(dāng)固相抗原與待測血清 中的抗體特異結(jié)合后中的抗體特異結(jié)合后, ,再用該熒光素標(biāo)記的再用該熒光素標(biāo)記的 第二抗體與之共同孵育第二抗體與之共同孵育, ,便可形成免疫熒光便可形成免疫熒光 復(fù)合物復(fù)合物, ,在熒光顯微鏡下可見黃綠色熒光在熒光顯微鏡下可見黃綠色熒光, ,即即 為陽性。若無黃綠色熒光現(xiàn)象即為陰性為陽性。若無黃綠色熒光現(xiàn)象即為陰性 nifaifa操作簡便操作簡便, ,具有高

35、度的特異性、敏感性和重具有高度的特異性、敏感性和重 現(xiàn)性現(xiàn)性, ,可直接在細(xì)胞水平或亞細(xì)胞水平上檢測、可直接在細(xì)胞水平或亞細(xì)胞水平上檢測、 鑒定和定位抗原、抗體或免疫復(fù)合物、因而其鑒定和定位抗原、抗體或免疫復(fù)合物、因而其 應(yīng)用極廣應(yīng)用極廣, ,不僅用于疾病的免疫診斷不僅用于疾病的免疫診斷, ,還用于組還用于組 織細(xì)胞內(nèi)特異性抗原的檢查與定位織細(xì)胞內(nèi)特異性抗原的檢查與定位, ,以及分子生以及分子生 物學(xué)研究中基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測和鑒定物學(xué)研究中基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測和鑒定 n是診斷瘧疾最常用的方法是診斷瘧疾最常用的方法, ,敏感性高、特異性強(qiáng)敏感性高、特異性強(qiáng), , 重現(xiàn)性好重現(xiàn)性好, ,抗原制備簡便

36、抗原制備簡便, ,全蟲抗原性能穩(wěn)定全蟲抗原性能穩(wěn)定 n以裂殖體的抗原性最好以裂殖體的抗原性最好, ,大滋養(yǎng)體次之大滋養(yǎng)體次之, ,小滋養(yǎng)小滋養(yǎng) 體最差?？乖潭▌┮远嗑奂兹┘案栺R林體最差?？乖潭▌┮远嗑奂兹┘案栺R林 固定效果最好固定效果最好, ,熒光強(qiáng)度最大熒光強(qiáng)度最大, ,丙酮及自然干燥丙酮及自然干燥 次之次之, ,甲醇固定效果最差甲醇固定效果最差 間接熒光抗體試驗(yàn)間接熒光抗體試驗(yàn)方法評價(jià)方法評價(jià) n瘧疾病人的陽性符合率達(dá)瘧疾病人的陽性符合率達(dá)9090以上以上, ,正常人假陽性正常人假陽性 率為率為l l2 2, ,瘧疾病人經(jīng)治療后瘧疾病人經(jīng)治療后3 36 6個(gè)月個(gè)月ifaifa檢

37、測檢測 滴度迅速下降滴度迅速下降,1,1年后陰轉(zhuǎn)年后陰轉(zhuǎn), ,固有療效考核價(jià)值固有療效考核價(jià)值 n弓形蟲滋養(yǎng)體弓形蟲滋養(yǎng)體( (速殖子速殖子) )為抗原片作為抗原片作ifaifa診斷弓形蟲診斷弓形蟲 病的效果與染色試驗(yàn)相似病的效果與染色試驗(yàn)相似, ,敏感性低于敏感性低于elisaelisa和和iestiest 法法 n杜氏利什曼原蟲杜氏利什曼原蟲前鞭毛體作抗原進(jìn)行前鞭毛體作抗原進(jìn)行ifaifa檢測黑熱檢測黑熱 病患者血清抗體病患者血清抗體, ,陽性率達(dá)陽性率達(dá)100100, ,抗體滴度最低為抗體滴度最低為 1:320,1:320,最高可達(dá)最高可達(dá)1:5120,1:5120,其它疾病和健康人的血

38、清其它疾病和健康人的血清 滴度很少超過滴度很少超過1:20,1:20,但病人治愈后抗體的陰轉(zhuǎn)率很但病人治愈后抗體的陰轉(zhuǎn)率很 低低, ,治愈治愈2020年后的抗體陽性率仍高達(dá)年后的抗體陽性率仍高達(dá)28.928.9, ,對黑熱對黑熱 病無療效考核價(jià)值病無療效考核價(jià)值 間接熒光抗體試驗(yàn)方法評價(jià)間接熒光抗體試驗(yàn)方法評價(jià) n阿米巴肝膿腫阿米巴肝膿腫: :陽性檢出率達(dá)陽性檢出率達(dá)9595100100, ,而對而對 腸阿米巴病的檢出率懸殊很大腸阿米巴病的檢出率懸殊很大, ,從從5050到到9090不不 等等, ,不宜作腸阿米巴病的輔助診斷不宜作腸阿米巴病的輔助診斷 n血吸蟲病的診斷血吸蟲病的診斷:ifat:

39、ifat的敏感性與的敏感性與elisaelisa、iestiest等等 相仿相仿, ,但高于但高于coptcopt法。本法的不足之處是需要熒法。本法的不足之處是需要熒 光顯微鏡光顯微鏡, ,結(jié)果判斷帶有一定的主觀性結(jié)果判斷帶有一定的主觀性, ,且有非特且有非特 異性熒光干擾異性熒光干擾, ,并有熒光衰減現(xiàn)象并有熒光衰減現(xiàn)象, ,結(jié)果不能久存結(jié)果不能久存, , 實(shí)驗(yàn)完畢必需立刻鏡檢實(shí)驗(yàn)完畢必需立刻鏡檢 n適用范圍適用范圍: :用于瘧疾、弓形蟲病、利什曼原蟲病、用于瘧疾、弓形蟲病、利什曼原蟲病、 卡氏肺孢子蟲肺炎、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲病、細(xì)粒棘卡氏肺孢子蟲肺炎、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲病、細(xì)粒棘 球蚴病、絲蟲病、

40、華支睪吸蟲病及血吸蟲病的免球蚴病、絲蟲病、華支睪吸蟲病及血吸蟲病的免 疫學(xué)診斷疫學(xué)診斷 間接熒光抗體試驗(yàn)方法評價(jià)間接熒光抗體試驗(yàn)方法評價(jià) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) n酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種免疫標(biāo)記測定技酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種免疫標(biāo)記測定技 術(shù)。系術(shù)。系19711971年創(chuàng)用，最初把抗體或抗原吸年創(chuàng)用，最初把抗體或抗原吸 附于聚苯乙烯管壁上制成固相免疫吸附劑，附于聚苯乙烯管壁上制成固相免疫吸附劑， 用以測定抗原或抗體，為用以測定抗原或抗體，為elisaelisa奠定了基礎(chǔ)，奠定了基礎(chǔ)， 后用塑料微孔板使后用塑料微孔板使elisaelisa技術(shù)迅速得到推廣技術(shù)迅速得到推廣 和應(yīng)用。此項(xiàng)技術(shù)

41、具有高度的敏感性和特和應(yīng)用。此項(xiàng)技術(shù)具有高度的敏感性和特 異性，目前已廣泛用于細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、異性，目前已廣泛用于細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、 寄生蟲學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、免疫病理學(xué)、血液寄生蟲學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、免疫病理學(xué)、血液 學(xué)以及分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域，學(xué)以及分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域， 并已涌現(xiàn)出了許多改進(jìn)的、派生的及綜合并已涌現(xiàn)出了許多改進(jìn)的、派生的及綜合 的技術(shù)方法。的技術(shù)方法。 n根據(jù)酶具有強(qiáng)大的催化活性和高度特異的特根據(jù)酶具有強(qiáng)大的催化活性和高度特異的特 點(diǎn)點(diǎn), ,在不破壞酶活性和抗原抗體免疫學(xué)特性在不破壞酶活性和抗原抗體免疫學(xué)特性 的前提下的前提下, ,通過化學(xué)交聯(lián)或免疫學(xué)方法通過化學(xué)交聯(lián)或

42、免疫學(xué)方法, ,將酶將酶 分子聯(lián)結(jié)到抗體或抗原分子上分子聯(lián)結(jié)到抗體或抗原分子上, ,然后與特異然后與特異 性抗原或抗體反應(yīng)性抗原或抗體反應(yīng), ,形成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物形成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物 n結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶在遇到其相應(yīng)的底結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶在遇到其相應(yīng)的底 物時(shí)物時(shí), ,催化其水解催化其水解, ,產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生氧化還原反應(yīng), ,生成生成 肉眼可見的顏色變化肉眼可見的顏色變化, ,用微量比色計(jì)檢測結(jié)用微量比色計(jì)檢測結(jié) 果果, ,或目視方法比較判斷。由于酶降解底物或目視方法比較判斷。由于酶降解底物 的量與其呈現(xiàn)的色澤濃度成正比的量與其呈現(xiàn)的色澤濃度成正比, ,故可間接故可間接 反映被

43、測抗原或抗體的量。因此反映被測抗原或抗體的量。因此,elisa,elisa可以可以 定性定性, ,還可定量檢測抗原或抗體。還可定量檢測抗原或抗體。elisaelisa的基的基 本反應(yīng)類型有三種本反應(yīng)類型有三種 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)常規(guī)常規(guī)elisaelisa基本原理基本原理 n間接法間接法- -包被抗原包被抗原+ +待測抗體待測抗體+ +酶標(biāo)記抗球蛋白抗體酶標(biāo)記抗球蛋白抗體, , 底物顯色底物顯色, ,即即agagababab2ab2酶酶+ +底物底物, ,檢測抗體檢測抗體 n夾心法夾心法- -包被單克隆抗體包被單克隆抗體(mcab(mcab)+)+待測抗原待測抗原(ag)+(ag

44、)+特特 異性抗體異性抗體(ab1)+(ab1)+酶標(biāo)抗球蛋白抗體酶標(biāo)抗球蛋白抗體(ab(ab- -酶酶),),雙抗體雙抗體 捕獲抗原檢測抗原法捕獲抗原檢測抗原法 n競爭抑制法競爭抑制法- -小分子抗原或半抗原檢測小分子抗原或半抗原檢測, ,將特異性抗將特異性抗 體吸附于酶標(biāo)板上體吸附于酶標(biāo)板上, ,酶標(biāo)記抗原與待測抗原混合后酶標(biāo)記抗原與待測抗原混合后 再加入反應(yīng)板中孵育再加入反應(yīng)板中孵育, ,經(jīng)洗滌加入底物進(jìn)行顯色反經(jīng)洗滌加入底物進(jìn)行顯色反 應(yīng)。待測抗原與酶標(biāo)記抗原以均等的機(jī)會(huì)競爭結(jié)合應(yīng)。待測抗原與酶標(biāo)記抗原以均等的機(jī)會(huì)競爭結(jié)合 固相抗體。因此固相抗體。因此, ,顯色深淺與結(jié)合到固相抗體上的

45、顯色深淺與結(jié)合到固相抗體上的 酶標(biāo)記抗原量成正比酶標(biāo)記抗原量成正比, ,則與待測抗原的量成反比。則與待測抗原的量成反比。 同樣同樣, ,也可包被抗原也可包被抗原, ,將酶標(biāo)抗體與待測抗原同時(shí)加將酶標(biāo)抗體與待測抗原同時(shí)加 到酶標(biāo)反應(yīng)中到酶標(biāo)反應(yīng)中, ,固相抗原同待測抗原竟?fàn)幗Y(jié)合酶標(biāo)固相抗原同待測抗原竟?fàn)幗Y(jié)合酶標(biāo) 抗體抗體, ,經(jīng)洗滌后經(jīng)洗滌后, ,待測抗原待測抗原- -酶標(biāo)抗體復(fù)合物及未結(jié)酶標(biāo)抗體復(fù)合物及未結(jié) 合酶標(biāo)抗體被洗脫。因此合酶標(biāo)抗體被洗脫。因此, ,酶標(biāo)顯色反應(yīng)深淺與待酶標(biāo)顯色反應(yīng)深淺與待 測抗原的濃度成反比測抗原的濃度成反比 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理 n方法評價(jià)方法評

46、價(jià):elisa:elisa是免疫學(xué)試驗(yàn)中應(yīng)用最普遍、適是免疫學(xué)試驗(yàn)中應(yīng)用最普遍、適 用范圍最廣的一種免疫酶標(biāo)記檢測技術(shù)，已廣泛用范圍最廣的一種免疫酶標(biāo)記檢測技術(shù)，已廣泛 用于多種寄生蟲感染的免疫診斷、血清流行病學(xué)用于多種寄生蟲感染的免疫診斷、血清流行病學(xué) 調(diào)查、寄生蟲病的療效考核及防治效果的監(jiān)測。調(diào)查、寄生蟲病的療效考核及防治效果的監(jiān)測。 檢測的標(biāo)本也多種多樣檢測的標(biāo)本也多種多樣, ,可以是待檢者血清、積液可以是待檢者血清、積液 ( (如胸腔積液如胸腔積液) )、腦脊液、乳汁、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、尿液、唾液 n檢測內(nèi)容可為抗體、抗原或免疫復(fù)合物。該檢測檢測內(nèi)容可為抗體、抗原或免疫復(fù)合物。

47、該檢測 技術(shù)已實(shí)現(xiàn)試劑標(biāo)準(zhǔn)化、操作規(guī)范化和自動(dòng)化技術(shù)已實(shí)現(xiàn)試劑標(biāo)準(zhǔn)化、操作規(guī)范化和自動(dòng)化, ,適適 于批量樣本的檢測。最常用的反應(yīng)類型是間接法于批量樣本的檢測。最常用的反應(yīng)類型是間接法 和雙抗體夾心法和雙抗體夾心法 n適用范圍適用范圍: :該法用于血吸蟲病、瘧疾、衛(wèi)氏并殖吸該法用于血吸蟲病、瘧疾、衛(wèi)氏并殖吸 蟲病、弓形蟲病、棘球蚴病、肝吸蟲病、豬囊尾蟲病、弓形蟲病、棘球蚴病、肝吸蟲病、豬囊尾 蚴病、姜片蟲病、利什曼原蟲病等免疫診斷蚴病、姜片蟲病、利什曼原蟲病等免疫診斷 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法與適用范圍酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法與適用范圍 n參照核酸研究中的斑點(diǎn)雜交法結(jié)合參照核酸研究中的斑點(diǎn)雜交法結(jié)合e

48、lisaelisa試驗(yàn)改良試驗(yàn)改良 而成。以硝酸纖維素而成。以硝酸纖維素(nc)(nc)薄膜為載體薄膜為載體, ,這種多孔膜這種多孔膜 可作為多種顆粒性抗原及可溶性抗原固相載體可作為多種顆粒性抗原及可溶性抗原固相載體, ,在在 單克隆抗體鑒定中應(yīng)用較多單克隆抗體鑒定中應(yīng)用較多, ,此法敏感性很高此法敏感性很高, ,檢檢 測測鼠免疫球蛋白可達(dá)微微克鼠免疫球蛋白可達(dá)微微克(ng(ng) )級水平級水平 n基本原理基本原理:elisa:elisa基本相似基本相似, ,只是以硝酸纖維素薄膜只是以硝酸纖維素薄膜 為固相載體代替酶標(biāo)反應(yīng)板以吸附抗原或抗體為固相載體代替酶標(biāo)反應(yīng)板以吸附抗原或抗體, ,用用

49、酶催化作用后可形成不溶性有色沉淀的底物酶催化作用后可形成不溶性有色沉淀的底物( (如如 dab)dab)代替鄰苯二胺代替鄰苯二胺(opd)(opd)或四甲基聯(lián)苯胺或四甲基聯(lián)苯胺(tmb)(tmb)等等 底物。底物。結(jié)果以能在結(jié)果以能在ncnc膜上呈現(xiàn)有色斑點(diǎn)膜上呈現(xiàn)有色斑點(diǎn), ,而陰性對而陰性對 照無色者為陽性反應(yīng)。本法可吸附抗原以檢測特照無色者為陽性反應(yīng)。本法可吸附抗原以檢測特 異性抗體異性抗體, ,也可吸附特異性抗體也可吸附特異性抗體( (如單克隆抗如單克隆抗 體體,mcab,mcab) )夾心法檢測特異性抗原夾心法檢測特異性抗原 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(dot-elis

50、a)hawkes(dot-elisa)hawkes n方法評價(jià)方法評價(jià): :dotdotelisaelisa法是預(yù)先將抗原或抗法是預(yù)先將抗原或抗 體點(diǎn)涂于體點(diǎn)涂于 ncnc膜上膜上, ,便于保存和攜帶便于保存和攜帶, ,操作簡操作簡 便、反應(yīng)快速、肉眼判斷結(jié)果、直觀且可便、反應(yīng)快速、肉眼判斷結(jié)果、直觀且可 保留結(jié)果以利復(fù)查保留結(jié)果以利復(fù)查, ,適于現(xiàn)場應(yīng)用。研究資適于現(xiàn)場應(yīng)用。研究資 料表明料表明, ,該法對絲蟲病、弓形蟲病、瘧疾等該法對絲蟲病、弓形蟲病、瘧疾等 的診斷都有很高的敏感性和特異性的診斷都有很高的敏感性和特異性 n適用范圍適用范圍: :本法用于血吸蟲病、瘧疾、衛(wèi)氏本法用于血吸蟲病、

51、瘧疾、衛(wèi)氏 并殖吸蟲病、弓形蟲病、棘球蚴病、肝吸并殖吸蟲病、弓形蟲病、棘球蚴病、肝吸 蟲病、豬囊尾蚴病、利什曼原蟲病等免疫蟲病、豬囊尾蚴病、利什曼原蟲病等免疫 診斷診斷 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 方法評價(jià)及適用范圍方法評價(jià)及適用范圍 n基本原理基本原理: :金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁a a蛋白蛋白(spa)(spa) 能和人及多種哺乳動(dòng)物的能和人及多種哺乳動(dòng)物的iggigg的的fcfc端結(jié)合端結(jié)合, ,可可 以此取代第二抗體制成酶標(biāo)記以此取代第二抗體制成酶標(biāo)記a a蛋白蛋白, ,用于抗用于抗 體或抗原的檢測。基本原理、操作及結(jié)果判體或抗原的檢測?；驹?、操作及結(jié)

52、果判 定同常規(guī)定同常規(guī)elisaelisa法法 n方法評價(jià)方法評價(jià): :僅以酶標(biāo)僅以酶標(biāo)spaspa代替酶標(biāo)第二抗體作代替酶標(biāo)第二抗體作 為酶結(jié)合物為酶結(jié)合物, ,該法的突出優(yōu)點(diǎn)是受檢的該法的突出優(yōu)點(diǎn)是受檢的iggigg無無 動(dòng)物種、屬的限制動(dòng)物種、屬的限制, ,適用范圍廣、試劑穩(wěn)定適用范圍廣、試劑穩(wěn)定 可靠可靠, ,適于多種寄生蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷和現(xiàn)適于多種寄生蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷和現(xiàn) 場流行病學(xué)調(diào)查。場流行病學(xué)調(diào)查。 n適用范圍適用范圍: :用于血吸蟲病、肺吸蟲病、姜片用于血吸蟲病、肺吸蟲病、姜片 蟲病、棘球蚴病、豬囊尾蚴病、瘧疾、弓形蟲病、棘球蚴病、豬囊尾蚴病、瘧疾、弓形 蟲病等的輔助診斷蟲病

53、等的輔助診斷 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌a a蛋白蛋白elisa(spaelisa(spaelisa)elisa) n基本原理基本原理: :生物素生物素(biotin)(biotin)與親和素與親和素 (avidin(avidin) )具有極強(qiáng)的親和力且親和素為四具有極強(qiáng)的親和力且親和素為四 價(jià)分子價(jià)分子, ,即一個(gè)親和素分子可以和四個(gè)生物即一個(gè)親和素分子可以和四個(gè)生物 素分子結(jié)合素分子結(jié)合, ,所形成的復(fù)合物非常穩(wěn)定。生所形成的復(fù)合物非常穩(wěn)定。生 物素可偶聯(lián)蛋白質(zhì)和核酸物素可偶聯(lián)蛋白質(zhì)和核酸, ,已不影響原有的已不影響原有的 生物學(xué)活性。首先制備酶標(biāo)記生物素、生生物學(xué)活性。首先制備酶標(biāo)記生

54、物素、生 物素偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體物素偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體, ,即生物素化第即生物素化第 二抗體二抗體(ab2-b),(ab2-b),再按一定比例將親和素和再按一定比例將親和素和 酶標(biāo)生物素混合孵育酶標(biāo)生物素混合孵育, ,形成親和素形成親和素- -生物素生物素- - 過氧化物酶復(fù)合物過氧化物酶復(fù)合物(avidin-biotin-(avidin-biotin- perokidase complex,abcperokidase complex,abc),),使親和素結(jié)合使親和素結(jié)合 位點(diǎn)過剩位點(diǎn)過剩 生物素生物素- -親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng)elisa(abc-elisa)elisa(abc-elis

55、a) n尚未飽和的結(jié)合位點(diǎn)與第二抗體上的生尚未飽和的結(jié)合位點(diǎn)與第二抗體上的生 物素結(jié)合物素結(jié)合, ,借助第二抗體與抗原借助第二抗體與抗原- -抗體復(fù)抗體復(fù) 合物橋聯(lián)合物橋聯(lián), ,從而形成從而形成ag-ab-(ab2ag-ab-(ab2b)-abcb)-abc 復(fù)合物復(fù)合物, ,遇相應(yīng)底物呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。也可遇相應(yīng)底物呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。也可 包被抗體包被抗體( (多為單克隆抗體多為單克隆抗體,mcab,mcab),),加待加待 測抗原測抗原, ,與生物素化抗體與生物素化抗體( (針對待測抗原針對待測抗原 的多抗的多抗) )再加再加abc,abc,如有特異性抗原存在即如有特異性抗原存在即 可形成可形成m

56、cab-ag-(ab-b)-abcmcab-ag-(ab-b)-abc復(fù)合物復(fù)合物, ,催化催化 底物呈現(xiàn)有色反應(yīng)底物呈現(xiàn)有色反應(yīng) 生物素生物素- -親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng) elisa(abc-elisa)elisa(abc-elisa) n方法評價(jià)方法評價(jià): :該法由于該法由于abcabc的引入增加了免疫的引入增加了免疫 反應(yīng)系統(tǒng)中酶分子的數(shù)量，提高了反應(yīng)系統(tǒng)中酶分子的數(shù)量，提高了elisaelisa反反 應(yīng)的敏感性。加上該法抗原抗體的特異應(yīng)的敏感性。加上該法抗原抗體的特異 性及方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。使該法廣性及方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。使該法廣 泛用于寄生蟲病的診斷和流行病調(diào)查中。泛用于寄生

57、蟲病的診斷和流行病調(diào)查中。 但過高的敏感性有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)但過高的敏感性有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性反應(yīng) n適用范圍適用范圍: :用于血吸蟲病、瘧疾、絲蟲病、用于血吸蟲病、瘧疾、絲蟲病、 弓形蟲病、利什曼原蟲病、棘球蚴病、豬弓形蟲病、利什曼原蟲病、棘球蚴病、豬 囊尾蚴病等的輔助診斷囊尾蚴病等的輔助診斷 生物素生物素- -親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng) 方法評價(jià)及適用范圍方法評價(jià)及適用范圍 n基本原理基本原理: :酶標(biāo)記抗原對流免疫電泳酶標(biāo)記抗原對流免疫電泳 (enzyme-linked antigen counter-(enzyme-linked antigen counter- immunoelec-trop

58、horesis,elacieimmunoelec-trophoresis,elacie) )是免疫酶是免疫酶 技術(shù)與對流免疫電泳技術(shù)相結(jié)合的一種免疫技術(shù)與對流免疫電泳技術(shù)相結(jié)合的一種免疫 檢測方法檢測方法, ,將酶標(biāo)記抗原和待測抗體置相對將酶標(biāo)記抗原和待測抗體置相對 應(yīng)的瓊脂板孔中應(yīng)的瓊脂板孔中, ,在電場力的作用下在電場力的作用下, ,兩者相兩者相 向運(yùn)動(dòng)向運(yùn)動(dòng), ,相遇后形成酶標(biāo)抗原相遇后形成酶標(biāo)抗原- -抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物, , 加入相應(yīng)底物后出現(xiàn)顏色反應(yīng)加入相應(yīng)底物后出現(xiàn)顏色反應(yīng), ,目測判讀結(jié)目測判讀結(jié) 果果, ,或用掃描儀記錄分析結(jié)果?；蛴脪呙鑳x記錄分析結(jié)果。 酶標(biāo)記抗原對流免疫

59、電泳酶標(biāo)記抗原對流免疫電泳 酶標(biāo)記抗原對流免疫電泳酶標(biāo)記抗原對流免疫電泳 n該法使肉眼不能鑒別的微細(xì)沉淀線經(jīng)酶促該法使肉眼不能鑒別的微細(xì)沉淀線經(jīng)酶促 反應(yīng)呈現(xiàn)肉眼可見的有色沉淀反應(yīng)呈現(xiàn)肉眼可見的有色沉淀, ,提高了對流提高了對流 免疫電泳的敏感性免疫電泳的敏感性 n評價(jià)與應(yīng)用評價(jià)與應(yīng)用: :由于該法需要一系列的電泳裝由于該法需要一系列的電泳裝 置，操作尚需規(guī)范化、試劑亦需標(biāo)準(zhǔn)化，置，操作尚需規(guī)范化、試劑亦需標(biāo)準(zhǔn)化， 而限制了該法的應(yīng)用。該技術(shù)可用于血吸而限制了該法的應(yīng)用。該技術(shù)可用于血吸 蟲病的輔助診斷蟲病的輔助診斷 n酶聯(lián)免疫印跡酶聯(lián)免疫印跡(enzyme-linked (enzyme-li

60、nked immunoblotting technique,elibimmunoblotting technique,elib) )又稱又稱 western blotwestern blot，是由十一烷基硫酸鈉聚丙，是由十一烷基硫酸鈉聚丙 烯酰胺凝膠電泳烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate (sodium dodecyl sulfate polyacrylaide gel electro-phoresispolyacrylaide gel electro-phoresis， sds-page)sds-page)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳及酶聯(lián)免疫吸、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳及酶聯(lián)免疫吸 附