分子診斷學(xué)復(fù)習(xí)

1、名詞解釋LDNA測丿込 基因是遺傳信息的物理和功能單位，含有產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核昔酸序列，即一段 DA序乙 蛋口質(zhì)組（proteome）:源于蛋白質(zhì)（protein ）與 基因組（genome）兩個詞的雜合，意指一種基因組所表達的全套蛋口質(zhì)”，即包括 一種細胞或一個組織乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。L蛋口質(zhì)組學(xué)（proteomics）:蛋白質(zhì)組學(xué)就是對機體或組織或細胞的所有蛋白質(zhì)進行鑒定和結(jié)構(gòu)功能分析的一個研究領(lǐng)域。基因：是一段攜帶功能產(chǎn)物信息的DA片段，是控制某種性狀的遺傳單位。4基因組（genome）:是指一個細胞或生物體的一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)。L基因組學(xué)（Ge

2、no mics）:指對所有基因進行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜，核苜酸序列分析，基因定位和基因功能 分析的一門科學(xué)。L基因擴增：定義:指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象，基因擴增是基因表達增加的一種重要機制。7. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR :利用DA聚合酶催化一對引物間的特定DNA片段在體外進行快速、大量擴增的方法，也稱無細胞克隆技術(shù)。8. 增色效應(yīng):DNA變性后,雙螺旋解體，堿基堆積不復(fù)存在，螺旋內(nèi)部的堿基暴露，致變性后的DNA對260nm紫外光的吸光 率明顯增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。9. 熔解溫度：將DNA解鏈達到50%或0D260達到最大值的50%寸的溫度，稱為解鏈溫度或熔解溫度。10

3、. 澳化乙錠（ethidium bromide , EB）是一種熒光染料,可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)岀紅色熒光。11. 寶虬與靶基因片段兩側(cè)互補的寡核苜酸，其本質(zhì)是單鏈DNA它決定擴增產(chǎn)物的特異性和長度。12. 短產(chǎn)物片段：的長度嚴(yán)格限定在 2個引物鏈的5 端之間，是需要擴增的特定片段，以指數(shù)形式擴增（2n） o13. 長產(chǎn)物片段：比兩引物限定區(qū)更長的延伸產(chǎn)物,是以原始模板DNA為模板的擴增反應(yīng)產(chǎn)物，以倍數(shù)形式擴增（2n）。14. 加端PCR （add-PCR）:即讓擴增產(chǎn)物的5-末端帶上一段特殊的、滿足需要的DNA順序的PCR15. 原位PCR （ In Situ PCR

4、:在組織細胞內(nèi)進行PCR擴增，通過摻入標(biāo)記基團直接顯色或結(jié)合原位雜交進行檢測，可檢測岀該特異序列在細 胞中的存在量和存在部位。16. 逆轉(zhuǎn)錄PCR （ RT-PCR原理：先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以mRNA為模板合成互補的cDNA再用后者為模板進行PCR反應(yīng)。vs17. 反向PCR （reverse ORinverse PCR）:是用一對反向的引物來擴增兩引物以外的（即對某 一對引物間）、未知的DNA片段，個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。18. 不對稱PCR （ asymmetric PCR ）原理：最初的10-15個循環(huán)中的主要產(chǎn)物是雙鏈DA但是，當(dāng)?shù)蜐舛鹊囊镖拗菩砸铮┍缓谋M后，以

5、后的循環(huán)只產(chǎn)生高濃度引物的延伸產(chǎn)物，結(jié)果便產(chǎn)生大量單鏈DNA （ ssDNA）19. 多重PCR （ multiple PCR ）（檢測一組特定基因序列的存在或缺失）原理和方法：在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，擴增同一模板的多個區(qū)域（相同或不同基因的多個部位）。如果其中某一區(qū)段缺失，則電泳圖譜上該區(qū)帶就會消失。20 巢式PCR （ nested PCR ）定義及原理：用兩對 PCR引物擴增完整的DNA片段，以提高檢測的靈敏度和特異性。H 標(biāo)記引物的PCR（ Labelled primers PCR , LP-PCR）:利用同位素、熒光素等對PCR引物進行標(biāo)記，以便直觀檢測目的基因。22. 實時熒

6、光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號監(jiān)測整個PCR過程，獲得在線描述PCR過程的動力學(xué)曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知核酸進行定量分析。23. 絕對定量（測定X的分子數(shù)量）：即用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來精確推算待測的起始模板拷貝數(shù),又稱外標(biāo)法24. 相對定量（測定不冋樣木中X的比率）：在一定樣本中,靶分子相對于參照樣木中該分子的量的變化程度，又稱內(nèi)標(biāo)法。25. 循環(huán)閾值（Ct ）:在PCR擴增過程中,熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，是FQ-PCR定量的理論基礎(chǔ)。26. 熒光共振能量傳遞（FRET）:某熒光標(biāo)記基團在激發(fā)光刺激下生成某波長的發(fā)射光,當(dāng)另一屏蔽基團

7、與其距離合適時，其發(fā)射光將會被屏蔽基團所吸收，并轉(zhuǎn)化為其它波長的發(fā)射光或熱能，稱之為FRET27. 熒光淬滅：任何引起熒光強度降低甚至消滅的現(xiàn)象。能夠引起該現(xiàn)象的物質(zhì)即熒光淬滅劑。28. 連接酶鏈反應(yīng)（LCR原理：以DNA連接酶將某一 DNA鏈的5 -P與另一相鄰鏈的3 -0H連接為基礎(chǔ)的循環(huán)反應(yīng)。29. 核酸雜交:不同來源、具有互補序列的單鏈核酸分子，在一定條件下、按堿基配對原則退火形成雙鏈的過程。30. 核酸雜交技術(shù)：是一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。它基于核酸朵交的原理，利用帶標(biāo)記的核酸探針分子去檢測具有同源序列的特定DNA或 RNA分子（靶序列），實現(xiàn)對靶序列的定性或/和定量分析。31. 核

8、酸變性：某些理化因素導(dǎo)致DNA雙鏈間的氫鍵斷裂成為單鏈的過程，稱 DNA變性。32. 探針（probe）:核酸雜交技術(shù)中,兩條單鏈之一是待測序列（DNA或RNA,另外一條單鏈則是帶有可檢測標(biāo)志的、與待測序列存在同源性的特異核酸序列，即探針。33. 核酸探針（probes）:是指能與待測的靶核酸序列互補朵交、序列己知、并且?guī)в锌蓹z測標(biāo)記的核酸片段。34. CDNA探針:從己構(gòu)建的cDNA文庫中篩選和分離的靶基因探針。35. 寡核苜酸探針-oligonucleotide probe :根據(jù)己知基因序列合成的、與靶基因互補的DNA片段（DA探針）。36. 核酸分子雜交：不同來源的單鏈核酸分子在合適的

9、條件下,根據(jù)堿基互補原則形成雙鏈雜交體的過程。37. 熒光原位雜交（fluorescenee in situ hybridization, FISH） _ :是_種利用熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術(shù)。麗：它通過熒光標(biāo)記的探針與待測標(biāo)木的核酸進行原位雜交，在熒光顯微鏡下對雜交信號的大小、數(shù)目、定位和分布等進行分析，從而對染 色體或基因異常的細胞、組織標(biāo)本進行檢測和診斷。3&分子診斷：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法,直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否正常，從而對疾病作岀診斷的方法。39. DNA多態(tài)性：在人類基因組中,平均約200對堿基可發(fā)生一對變異（稱為中性突變），導(dǎo)致個體間核昔

10、酸序列的差異。限制性片段長度多態(tài)性：不少 DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段。40. 單基因病：指一種潰傳病的發(fā)牛只受一對等位基因的控制,他們的潰傳方式遵循孟德爾分離定律。41. PCR擴增阻礙突變系統(tǒng)（PCR-ARMS）:由于Taq DNA聚合酶缺乏3 5的外切酶活性，不能糾正引物3端的錯配，因此對于Taq酶的擴增反應(yīng)，要求3端必須完全正確配對，以到達高效擴增。42. 寡核廿酸連接實驗（OLA）:設(shè)計兩個寡核甘酸相鄰的探針（約20個核苗酸）其相鄰接的位點正好是已知的突變位點，探針與靶序列雜交后頭尾相接（5- 3方向）。如果探針和靶序列完全互補，D

11、NA連接酶就會把二探針通過磷酸二酯鍵共價連接起來，如果探針相鄰之處或接近相鄰之處有一個堿基錯配，則連接效率大大降低，連接阻遏43. 溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳仃GGE/DGGE）隨著溫度的逐漸升高時，DNA分子會呈階梯式逐步發(fā)生解鏈。部分解鏈的雙鏈DNA分子表現(xiàn)岀一種復(fù)雜的分枝構(gòu)像，得其電泳遷移率大大下降。2、DA分子的解鏈程度決定于該分子的解鏈溫度（Tnj），而Tm有強烈的序列依賴性。3、一段DNA片段往往含多個長約50 - 300bp不等的“解鏈區(qū)域”，只有較低 Tm的“解鏈區(qū)域的變異才能被可靠地檢測到。44. 變性高效液相色譜法（DHPLC） : 1、DHPLC勺分離系統(tǒng)：碳-1

12、8烷坯和無孔PS-DVB微球體組成電中性、疏水性的固定相，TEAA作為“橋分子”使一總被吸附在固定相上，不同濃度的乙氤為流動相為2、DHPLC檢測突變的原理：當(dāng)柱溫50 C時為非變性分離；當(dāng)70C 柱溫50C時為部分變性分離。當(dāng)柱溫70 C時為完全變性分離。45. 錯配接合蛋口質(zhì)截短測試法（PTT）:以擴增產(chǎn)物為模板從頭合成蛋白質(zhì)從而篩尋該基因的終止密碼，包括三個主要步驟：1、提取基因組DNA及PCRT增靶基因，或提取RNA通過RT- PCR得到靶基因。2、以PCR產(chǎn)物為模板轉(zhuǎn)錄岀RNA然后翻譯成蛋口質(zhì)。3、采用SDS-PAGE分析所合成的蛋白質(zhì)，通過觀察遷移率的變化，區(qū)分基因變異而產(chǎn)生的截短

13、產(chǎn)物與正常的全長蛋口產(chǎn)物46. 脈沖電場凝膠電泳原理：1、PFGE采用一種正交的交變脈沖電場，在進行瓊脂糖凝膠電泳時，其方向、脈沖時間和電壓大小可交替改變。一場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間改變形狀和遷移方向，分子越大，分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換所需時間就越長，轉(zhuǎn)變遷移方向的時間也就越長。3、對于不同大小的DNA大分子，其改變泳動方向所需的時間不等，遷移速度的快慢也就不等，因此就可以按 DNA分子量大小使其分離開來47. 分子影像探針：分子影像中采用的分子探針是一類標(biāo)記有示蹤劑,能參與體內(nèi)自然的生理生化活動的特殊分子。4&生物芯片技術(shù)：采用平而微細加工技術(shù),將大量生物樣品有序地固化于支持物的表面，組

14、成高度密集的二維生物樣品微陣列（生物芯片），而生物芯片技術(shù)是指通過平而微細加工技術(shù)在芯片表而構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、核酸、蛋口質(zhì)及其它生物組分的 快速、敏感、高通量的檢測分析的技術(shù)。49. 基因芯片：有序地、高密度地排列著大量的基因片段的玻璃片或纖維膜等載體。50. 基因芯片技術(shù)：將大量探針分子固定于支持物上,熒光標(biāo)記的樣品分子按堿基互補原則與探針進行雜交，通過檢測每個雜交信號強度及分 布、進而獲取關(guān)于樣品分子的數(shù)量和序列信息，是有利于高通量研究基因表達、突變等的革命性技術(shù)。51. 蛋口質(zhì)芯片：采用原位合成、機械點樣或共價結(jié)合的等方法將各種多肽/蛋白（酶、抗原、抗體等）固定于

15、固相介質(zhì)上形成的蛋白質(zhì)分子點陣，即蛋白質(zhì)芯片，又稱蛋白質(zhì)微陣列。52. 質(zhì)粒（plasmid）:質(zhì)粒是生物體細胞內(nèi)攜帶的染色體外的核酸分子,能進行自主復(fù)制。53. 鏗座壬基因組中存在的不依賴同源性而能移動的獨立的DNA序列，稱為轉(zhuǎn)座子（transposon）,又可稱為轉(zhuǎn)座元件。54. 單順反子：即一種基因編碼一種多肽鏈或RNA鏈，每個基因轉(zhuǎn)錄有各自的調(diào)節(jié)元件。55. 斷裂基因：是指基因的外顯子是不連續(xù)排列的,被內(nèi)含子隔開，但按順序鑲嵌在DNA上。斷裂基因兩端起始和終止于外顯子，外顯子和內(nèi)含子交替岀現(xiàn)。56. 基因家族-指由某一祖先基因經(jīng)過重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因，其核苗酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

16、具有一定程度的同源性。57. 端粒（telomere ）:真核細胞的染色體3末端特殊的核蛋口結(jié)構(gòu)。議性和復(fù)制分離：有害突變基因常僅影響部分mtDNA野生型與突變型同時存在，即為異質(zhì)性；復(fù)制時隨機分離導(dǎo)致多態(tài)性不同，即復(fù)制分離。58. 閾值效應(yīng)：當(dāng)突變的mtDNA達到一定比例，使線粒體總能量供應(yīng)下降到不能維持最低正常功能時，才引起臨床癥狀。59. 重組DA技術(shù)，又稱分子克隆、基因工程技術(shù)：指在基因水平上,將目的DNA在體外重組于能自我復(fù)制的載體DNA分子上，然后將重組DNA導(dǎo)入宿主細胞中進行增生，以獲得大量的目的DNA片段，或以此為基礎(chǔ)，通過基因的誘導(dǎo)表達，得到大量相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過程。60.

17、轉(zhuǎn)化（transformation ）:把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA引入受體細胞的過程。61. 轉(zhuǎn)染（transfection ）:將重組噬菌體DNA直接引入受體細胞的過程。62. 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction ）:若重組噬菌體DNA被包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為運載體，將頭部重組DNA 導(dǎo)入受體細胞中的過程。63主縱子：是指數(shù)個功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)以及下游的轉(zhuǎn)錄中止信號所構(gòu)成的基因表達單 位，所轉(zhuǎn)錄的RNA多為順反子。64. 順反子（cisron）:在反式構(gòu)型中不能互補的各突變型所占有的那部分DNA片段。65. 啟動子

18、：是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列。66. 壇強&位于真核基因中遠離轉(zhuǎn)錄起始點能明顯增強啟動子效率的特殊DNA序列。67. 基因表畧是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，合成特定的蛋白質(zhì)，進而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功 能和生物學(xué)效應(yīng)的全過程。68. 分子克?。涸隗w外對DNA分子按照既定目的和方案進行人工重組,將重組分子導(dǎo)入合適宿主，使其在宿主中擴增和繁殖，以獲得該DNA 分子的大量拷貝。69. 載宜能在連接酶的作用下和外源DNA片段連接并運送DNA分子進入受體細胞的DNA分子。70. 感染：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包

19、裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆 粒，才能感染適當(dāng)?shù)募毎⒃诩毎麅?nèi)擴增。71. 退火：指將溫度降至引物的TM值左右或以下，引物與DNA模板互補區(qū)域結(jié)合形成雜交鏈。72. 基因診斷：以DNA或RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、結(jié)構(gòu)缺陷或表達異常，對人體的狀態(tài)和疾病做岀診斷的方 法和過程。73. 限制性片段長度的多態(tài)性（RFLP）:個體之間DNA的核苛酸序列存在差異,稱為DNA多態(tài)性。若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化，稱RFLPo74. SSCP:單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測是一種基于DNA構(gòu)象差別來檢測點突變的方法。相同長度的單鏈DNA如果堿基序列不同，

20、形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。75. 基因文庫（gene bank）:利用限制性內(nèi)切酶將基因組DA切成片段，每一 DNA片段都與一個載體分子拼接成重組DA將所有的重組DNA分子都弓I入到宿主細胞并進行擴增，得到分子克隆的混合體，這樣一個混合體稱為基因文庫1. DNA測序2.蛋白質(zhì)組（proteome） 3.蛋口質(zhì)組學(xué)（proteomics） 4.基因組（genome） 5.基因組學(xué)（Genomics） 6.基因擴增7.聚合酶鏈反 應(yīng)（PCR 8.增色效應(yīng)9.熔解溫度10.漠化乙錠（ethidium bromide , EB） 11.引物12.短產(chǎn)物片段13.長產(chǎn)物片段14.加端

21、PCR （ add-PCR）15.原位 PCR （ In Situ PCR ） 16.逆轉(zhuǎn)錄 PCR （ RT-PCR 原理 17.反向 PCR （reverse OR in verse PCR） 18.不對稱 PCR （ asymmetric PCR ）原理 19.多重 PCR （ multiple PCR ） 20.巢式 PCR （n ested PCR ）定義及原 21.標(biāo)記 引物的 PCR （ Labelled primers PCR , LP- PCR22.實時熒光定量PCR23.絕對定量（測定X的分子數(shù)量）24.相對定量（即測定 不同樣木中X的比率）25.循環(huán)閾值（Ct） 26.熒

22、光共振能 量傳遞（FRET） 27.熒光淬滅28.連接酶鏈反應(yīng)（LCR原理29.核酸雜交30.核酸雜交技術(shù)31.核酸變性32.探針（probe） 33.核酸探針（probes） 34. cDNA探針35.寡核tf酸探針-oligonucleotide probe36.核酸分子朵交37.熒光原位朵交（fluotescenee in situ hybridization, FISH） 38.分子診斷39. DNA多態(tài)性40.單基因病41. PCR擴增阻礙突變系統(tǒng)（PCR-ARMS） 42.寡核苗酸連接實驗（0LA） 43.溫度梯度凝膠電泳和變性梯 度凝膠電泳 （TGGE/DGGE） 44.變性高效

23、液相色譜法（DHPLC） 45.錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法（PTT） 46.脈沖電場凝膠電泳原理47.分子影像探針48.生物芯片技術(shù)49.基因芯片50.基因芯片技術(shù)51.蛋白質(zhì)芯片52 質(zhì)粒（plasmid） 53.轉(zhuǎn)座子54.單順反 子55.斷裂基因56.基因家族57.端粒（telomere ）58.閾值效應(yīng)59.重組DNA技術(shù)，又稱分子克隆、基因工程技術(shù)60.轉(zhuǎn)化（transformation ） 61.轉(zhuǎn)染（transfection ） 62.轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction ） 63.操縱子 64.順反子（cisron） 65.啟動子 66.增強 子 67. 基因表達68.分子克隆69.載

24、體70.感染71.退火72.基因診斷74. SSCP73.限制性片段長度的多態(tài)性（RFLP） 75.基因文 庫（gene bank ）問答題一、病毒、原核、真核基因組的特點病毒：（1）病毒基因組小，結(jié)構(gòu)簡單。（2）不同病毒基因組可以是不同結(jié)構(gòu)的核酸。（3）基因組相關(guān)基因常從即排列呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單元。（4）病毒基因組的編碼序列大于90%o （ 5）基因有連續(xù)和間斷的。（6）有基因重疊現(xiàn)象。原核： （1）基因組通常由一條環(huán)狀DNA分子組成。（2）基因組中只有1個復(fù)制起始點。（3）基因操縱子結(jié)構(gòu)。（4）編碼序列一般不重疊。（5）基因是連續(xù)的，無內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后不需要剪切。（6）編碼區(qū)在基因組中所占的比例遠遠

25、大于真核基因組，但小于病毒基因組。非編碼區(qū)主要是一些調(diào)控序列。（7）基因組中很少有重復(fù)序列。（8）細菌基因組中存在有可移動的DNA序列，包扌舌插入序列和轉(zhuǎn)座子。（9）具有編碼同工酶的基因。（10 ）在DA分子中具有多種功能的識別區(qū)域。真核：（1）每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目。（2）基因組遠遠大于原核生物基因組，具有許多復(fù)制起始點。（3）真核基因都由一個結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。（4）真核生物含有大量重復(fù)序列。（5）真核生物基因組內(nèi)非編碼序列占90%以上。（6）真核基因是斷裂基因。（7）功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族。（8）真核生物基因組中葉存在有一些可移動的遺傳因素

26、。二、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶 功能：識別特意序列切割 工具酶：多聚核苗酸激酶功 能：是多聚核昔酸5DNA連接酶DNADNA連接DNA片段，使切口封合末端轉(zhuǎn)移酶-末端磷酸化使3疑基加尾聚合酶I合成DNA填補3-末端堿性 磷酸酶切除末端磷酸基逆轉(zhuǎn)錄酶 合成橫cDNA良好載體條件：1必須有自身的復(fù)制子。 2.載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位，即多克隆位點，以供外源DNA插入。3.載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子。4.載體分子必須有足夠的容量。5.可通過特定的方法導(dǎo)入細胞。6.對于表達載體還應(yīng)具備與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、前導(dǎo)順

27、序、增強子、加尾信號等DNA調(diào)控原件。三、SANGE雙脫氧鏈終止法的原理 在DNA合成時，利用ddNTP與dNTP競爭摻入到新生的DNA鏈上，致鏈延伸反應(yīng)終止。在模板指導(dǎo)和測序引 物引導(dǎo)下，按堿基配對原則，聚合酶不斷將dNTPs加到引物的3，-0H末端,使引物延長，合成岀新的互補的DNA鏈。如果加入ddNTPs,由于雙脫氧核糖的3位置上缺少一個0H故不能與后續(xù)的的5端 和不同3端的引物延伸鏈的長短不一的混合物。分辨率的變dNTP形成磷酸二酯鍵，最后每個反應(yīng)體系中可合成一系列具有相同 各反應(yīng)體系的系列產(chǎn)物的3 末端分別是其相應(yīng)的核苗酸。通過高性聚丙烯酰胺凝膠電泳（可區(qū)分一個核苗酸之差）分離和放射

28、自顯影檢測后，從凝膠底部到頂部按55 3方向讀出新合 成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列。四、核酸分子雜交的原理具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下（適宜的溫度計離子強度等）堿基互補配對結(jié)合，重新形成雙鏈；這一過程中，核酸分子經(jīng) 歷了變性和復(fù)性的變化，以及在復(fù)性過程中分子間鍵的形成和斷裂。雜交的雙方是待測核酸和己知序列。2.五、影響雜交的因素 核酸分子木身：1.核酸分子的大?。悍肿釉酱?，擴散速度越慢，單鏈分子間發(fā)現(xiàn)互補序列的幾率就越小，復(fù)性速度越慢。核酸濃度：越大，復(fù)性速度越快。因為互補鏈相互碰撞的機會越大。3.核酸序列的復(fù)雜性序列越簡單，越容易相互識別，復(fù)性就越快。反之，序列越復(fù)雜，

29、復(fù)性就越慢。外在因 1.溫度：DNA/DNA雜交：適宜溫度為Tm - （ 20-25 C），與寡核昔酸探針朵交：適宜溫度為 Tm -5 Co 2.離子強度：低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加，高濃度的鹽使堿基 錯配的朵交體更穩(wěn)定。（3）甲酰胺：甲酰胺能降低核酸的Tm值和雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定。4.非特異性朵交反應(yīng)：雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附。六、探針的種類和優(yōu)缺點1.基因組DNA探針：從基因組文庫里篩選得到一個特定的基因或基因片段的克隆后，大量擴增、純化，切取插入片 段，分離純化為探針。真核基因組含有內(nèi)含子序列；因此，其用于檢測基

30、因表達時，雜交效率低。2. CDNA探針：通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過擴增重組質(zhì)粒而使cDNA得到大量的擴增。提取質(zhì)粒后純化作為探針使用。是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。3.RNA探針：采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針。4.寡核苗酸探針：根據(jù)己知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核昔酸片段作為探針，極其方便。七、探針的標(biāo)記法1.全段標(biāo)記之缺口平移法：原理:用 DA酶I在DA雙鏈上隨機切開若干切口，切口處形成3 -0H末端。大腸桿菌DNA聚合酶I從切口處開始作用，以另一條DNA鏈為模板，以dNTPs為原料，在水解核昔酸的同時沿切口

31、進行修復(fù)，標(biāo)記的核昔酸便隨之參入新鏈中，故稱：切口平行推移。利用大腸桿菌DYA聚合酶I同時具有的53核酸外切酶活性和53聚合酶活性，將預(yù)先用同位素或非同位素修飾的dNTP摻入到新合成的DNA探針中去。2.全段標(biāo)記之隨機引物法：隨即引物是人工合成的、含有各種可能排列順序的六核tF酸片段（46）的混合物?？梢耘c任何核酸片段朵交，以此作為聚合酶反應(yīng)的弓I物。將這些引物與變性的DNA單鏈結(jié)合后，以4種dNTP （其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dTP為底物，合成與探針DNA互補的切帶有標(biāo)記物的DNA探針。3.聚合酶鏈反應(yīng) WCR標(biāo)記DNA探針：在PCR反應(yīng)底物中，將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP,這樣標(biāo)記

32、的 dNTP就在PCR反DNA鏈上。4.RNA探針的標(biāo)記:RXA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄法制備，一邊合成一邊標(biāo)記。5.寡核苗酸鏈探針的標(biāo)記：可以通過在寡核苜酸合成時加入特定標(biāo)記的核苗酸來實現(xiàn)，也可以通過DNA探針的末端標(biāo)記法對其3或5末端進行標(biāo)記。6.末端標(biāo)記法：只是將DNA片段的一端進行標(biāo)記。八、PCR引物設(shè)計的基本要求1.序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列，這樣可減少非特異結(jié)合。2.引物長度以18-38nt為宜，多為20-24o 3. ATGC最好隨機分布，避免5個以上的卩票吟或咗噪核苛酸的成串排列，尤其 3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或Co 4.G+C占50-60% :G+C太少擴增效果不佳，G

33、+C過多易岀現(xiàn)非特異條帶。5.兩引物間要有匹配的GC含量和相似的退火溫度。6.引物內(nèi)部避免有互補序列形成二級結(jié)構(gòu)。7.引物3端為關(guān)鍵堿基，其第1, 2個堿基要嚴(yán)格配對，否則PCR失敗或擴增效率和特異性降低。8.5 -端無嚴(yán)格限制，其堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態(tài)，因此可在其外設(shè)計附加序列（如引入限制性內(nèi)切酶位點，便于對擴增產(chǎn)物的分析和克?。疃嗫杉?0個堿 基而對PCR反應(yīng)無影響。九、PCR的反應(yīng)條件10 X 擴增緩沖液：10ul Mg2+: 1. 5mmol/L 4 種 dNTP 混合物：各 200umol/L引物：各 10 lOOpmol模板DA 0. 12ugTaq DNA聚合酶

34、：2. 5u加雙或三蒸水：總體積100ul十、Ct與模板DNA濃度的關(guān)系Ct與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)成反比：即起始模板DA量越多，熒光達到域值所需的循環(huán)數(shù)（ Ct ）越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系：通過己知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作岀標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品Ct值，就可以計算岀樣品中所含的模板量。十一、外標(biāo)法原理用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得待測樣品的Ct值即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算岀其起始拷貝數(shù)?！巴狻币粯?biāo)準(zhǔn)品與待測品雖然在相同反應(yīng)條件下進行，但是，它們不在同一反應(yīng)管！ 十二、探針法實時熒光定量 PCR的特點1.特異性強：具有引物和探針的雙重特異性。2.重復(fù)性好：同一標(biāo)本的Ct值相同。3.敏感性