工業(yè)微生物育種

1、工業(yè)微生物育種簡介劉春波-12生工2-摘要：本文綜述了工業(yè)微生物遺傳育種的歷史地位，介紹了遺傳育種的方法和機理，并對其前景進行了展望。微生物遺傳育種，所謂微生物遺傳育種，即菌種改良，是運用遺傳學原理和技術(shù)對某種具有特定生產(chǎn)目的的菌株進行改造，去除不良性質(zhì)，增加有益新性狀，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量的一種育種方法1，使我們獲得所需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的菌種，其目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。關(guān)鍵詞：工業(yè)微生物；遺傳育種；方法；機理工業(yè)微生物菌株選育在工業(yè)發(fā)酵中占有重要地位。用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物菌種，最好具有以下特征：1.在遺傳上必須是穩(wěn)定的。2.易于產(chǎn)生許多營養(yǎng)細胞、孢子或其它繁殖體3

2、.必須是純種，不應(yīng)帶有其它雜菌及噬菌體。4.種子的生長必須旺盛、迅速。5.產(chǎn)生所需要的產(chǎn)物時間短。6.比較容易分離純化。7.有自身保護機制，抵抗雜菌污染能力強。8.能保持較長的良好經(jīng)濟能力。9.菌株對誘變處理較敏感，從而提高產(chǎn)量潛力高2。1 歷史地位菌種選育技術(shù)的廣泛應(yīng)用為我們提供了各種類型的突變菌株，使得在食品工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護、化工能源、礦產(chǎn)開發(fā)等領(lǐng)域產(chǎn)生眾多新的產(chǎn)品，促使傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)改造和新型產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)生，同時使諸如抗生素、有機酸、維生素、色素、生物堿、激素以及其它生物活性物質(zhì)等產(chǎn)品的產(chǎn)量成倍甚至成千萬倍地增長，并且產(chǎn)品的質(zhì)量也不斷的提高。與此同時鏈霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等

3、抗生素也大規(guī)模的生產(chǎn)起來；在代謝控制育種的推動下使得產(chǎn)氨基酸、核苷酸、有機酸等次生代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株大批投入生產(chǎn)；由基因工程構(gòu)建的工程菌株使得微生物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力迅速提高，而且生產(chǎn)出微生物本生不能生產(chǎn)的外源蛋白質(zhì)，如胰島素、生長激素、單克隆抗體和細胞因子等等。由此可見工業(yè)微生物遺傳育種技術(shù)是工業(yè)發(fā)酵工程的核心技術(shù)，在其作用下人們獲得了許多的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，為生產(chǎn)實踐發(fā)展起了強大的推動作用。2 機理及方法2.1 自然選育就是不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育。這類突變沒有人工參與并非是沒有原因的，一般認為自然突變有兩種原因引起，即多因素低劑量效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。

4、所謂多因素低劑量效應(yīng)，是指在自然環(huán)境中存在著低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低劑量的誘變物質(zhì)和微生物自身代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)等作用引起的突變?；プ儺悩?gòu)效應(yīng)是指四種堿基第六位上的酮基或氨基的瞬間變構(gòu)，會引起堿基的錯配3。自然突變可能會產(chǎn)生兩種截然不同的結(jié)果，一種是菌種退化而導(dǎo)致目標產(chǎn)量或質(zhì)量下降；另一種是對生產(chǎn)有益的突變。為了保證生產(chǎn)水平的穩(wěn)定和提高，應(yīng)經(jīng)常地進行生產(chǎn)菌種自然選育，以淘汰退化的，選出優(yōu)良的菌種。在工業(yè)生產(chǎn)上，由于各種條件因素的影響，自然突變是經(jīng)常發(fā)生的，也造成了生產(chǎn)水平的波動，所以技術(shù)人員很注意從高生產(chǎn)水平的批次中，分離高生產(chǎn)能力的菌種再用于生產(chǎn)。同時也可利用自發(fā)突變而出現(xiàn)的菌種性

5、狀的變化，去選育優(yōu)良的菌株，如在味精發(fā)酵被噬菌體污染過程中，所選出的抗噬菌體菌株。自然選育是一種簡單易行的選育方法，可以達到純化菌種，防止菌種退化，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)量的目的。但是自然選育的效率低，因此經(jīng)常要與誘變育種交替使用，以提高育種效率。酒精發(fā)酵是最早應(yīng)用微生物遺傳學原理于微生物育種實踐，推廣了自然選育的純系良種，扭轉(zhuǎn)了酒精生產(chǎn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。這是最早應(yīng)用微生物遺傳學原理，進行育種實踐，提高發(fā)酵水平的一個實例4。這樣低的突變率導(dǎo)致自然選育耗時長，工作量大，影響了育種工作效率，在這種情況下，出現(xiàn)了誘變育種技術(shù)。2.2 誘變育種微生物的誘變育種，是以人工誘變手段誘變微生物基因突變，改變遺傳結(jié)構(gòu)和

6、功能，通過篩選，從多種多樣的變異體中篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株，并且找出發(fā)揮這個變株最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，使其在最合適的環(huán)境下合成有效產(chǎn)物2。誘變育種和其他育種方法相比，具有速度快、收益大、方法簡單等優(yōu)點，是當前菌種選育的一種主要方法，在生產(chǎn)中使用的十分普遍。但是誘變育種缺乏定向性，因此誘變突變必須與大規(guī)模的篩選工作相配合才能收到良好的效果。目前，人們用于誘變育種的誘變因素有物理因素和化學因素，前者包括紫外線、激光、X-射線、-射線和中子等；后者主要是烷化劑(包括EMS，EI，NEU，NMU，DES，MNNG，NTG等)，天然堿基類似物，亞硝酸和氯化鋰等。在物理誘變因素中，紫外線比較有效、

7、適用、安全，其他幾種射線都是電離性質(zhì)的，具有穿透力，使用時有一定的危險性，化學誘變劑的突變率通常要比電離輻射的高，并且十分經(jīng)濟，但這些物質(zhì)大多是致癌劑，使用時必須十分謹慎1。目前，多種誘變劑的誘變效果、作用時間、方法都已基本確定，人們可以有目的、有選擇地使用各種誘變劑以達到預(yù)期的育種效果。誘變育種也可采用復(fù)合誘變，即兩種或多種誘變劑的先后使用同種誘變劑的重復(fù)作用；兩種或多種誘變劑的同時使用。普遍認為復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，如果兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用，復(fù)合誘變較單一誘變效果好。雖然復(fù)合因子較單一因子誘變效果有很大優(yōu)勢，但因為目前大多微生物，尤其是抗生素產(chǎn)生菌的遺傳背景不清楚，往往對誘變劑

8、，特別是復(fù)合誘變劑的選擇使用，帶有很大的盲目性6。通過誘變處理，在微生物群體中，會出現(xiàn)各種突變型個體，但從產(chǎn)量變異的角度來講，其中絕大多數(shù)都是負變株。要從中把極個別的、產(chǎn)量提高較顯著的正變株篩選出來，可能要比沙里淘金還難。因此突變株的分離和篩選是誘變育種的關(guān)鍵，體現(xiàn)了突變不定向性和篩選定向性。為了獲得我們所需的突變株，使得突變株的新表型得以表達，淘汰原養(yǎng)型或負變株，必須設(shè)計一個良好的篩選培養(yǎng)基和確定合適的培養(yǎng)條件。篩選的步驟主要分初篩和復(fù)篩，初篩以量為主，選留較多有生產(chǎn)潛力的菌株，復(fù)篩以質(zhì)為主，對少量潛力大的菌株的代謝產(chǎn)物量進行精確測定7。篩選的方法依據(jù)目的物不同而異，常用的方法有濃度梯度法、

9、影印平板法、生長譜法、瓊脂平板活性圈法、紙片法、夾層培養(yǎng)法、循環(huán)篩選法以及與電腦化、智能化的高效篩選技術(shù)相結(jié)合的現(xiàn)代方法。2.3 雜交育種雜交是指在細胞水平上進行的一種遺傳重組方式。雜交育種是利用兩個或多個遺傳性狀差異較大的菌株，通過有性雜交、準性雜交、原生質(zhì)體融合和遺傳轉(zhuǎn)化等方式，而導(dǎo)致其菌株間的基因的重組，把親代的優(yōu)良性狀集中在后代中的一種育種技術(shù)。通過雜交育種可以實現(xiàn)不同的遺傳性狀的菌株間雜交，使遺傳物質(zhì)進行交換和重新組合，改變親株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，擴大變異范圍，獲得新的品種。同時不僅可克服因長期誘變造成的菌株活力下降，代謝緩慢等缺陷，也可以提高對誘變劑的敏感性，降低對誘變劑的“疲勞”效應(yīng)

10、2,8。本小節(jié)將從有性雜交、準性雜交和原生質(zhì)體融合三種常見的育種技術(shù)來介紹雜交育種。2.3.1 有性雜交有性雜交是指不同遺傳型的兩性細胞間發(fā)生的接合和隨之進行的染色體重組，進而產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。凡能產(chǎn)生有性孢子的真菌，原則上都能像高等動、植物雜交預(yù)育種相似的有性雜交方法來進行育種7。一般方法是把來自不同親本、不同性別的單倍體細胞通過離心等方式使之密集地接觸，就有更多的機會出現(xiàn)種種雙倍體的有性雜交后代。在這些雙倍體雜交子代中，通過篩選，就可以得到優(yōu)良性狀的雜種。2.3.2 準性雜交準性雜交是在無性細胞中所有的非減數(shù)分裂導(dǎo)致DNA重組的過程，微生物雜交僅轉(zhuǎn)移部分基因，然后形成部分重組

11、子，最終實現(xiàn)染色體交換和基因重組，在原核和真核生物中均有存在。準性雜交的方式主要有結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)，其局限性在于等位基因的不親合性。2.3.3 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合就是把兩個不同親本菌株的細胞壁，分別經(jīng)酶解作用去除，而得到球狀的原生質(zhì)體，然后將兩種不同的原生質(zhì)體置于高滲溶液中，由聚乙二醇（PEG）助融，促使兩者高度密集發(fā)生細胞融合，進而導(dǎo)致基因重組，就可由此再生細胞中獲得雜交重組菌株9。原生質(zhì)體融合技術(shù)具有許多常規(guī)雜交方法無法比擬的獨到之處10:由于去除了細胞壁，原生質(zhì)體膜易于融合，即使沒有接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等遺傳系統(tǒng)，也能發(fā)生基因組的融合重組；融合沒有極性，相互融合的是整個胞質(zhì)與細胞核，使

12、遺傳物質(zhì)的傳遞更為完善；重組頻率高，易于得到雜種；存在著兩株以上親株同時參與融合并形成融合子的可能11；較易打破分類界限，實現(xiàn)種間或更遠緣的基因交流12；同基因工程方法相比，不必對試驗菌株進行詳細的遺傳學研究，也不需要高精尖的儀器設(shè)備和貴的材料費用等。由于以上優(yōu)點，迄今，這項技術(shù)不僅在基礎(chǔ)研究方面，而且在實際應(yīng)用上，均取得了引人注目的成績。隨著生物學研究手段的不斷創(chuàng)新，該技術(shù)的基本實驗方法逐步完善。經(jīng)過多年的實際應(yīng)用，證明微生物原生質(zhì)體融合確是一項十分有用的育種技術(shù)13。通過原生質(zhì)體融合改良工業(yè)微生物菌株的遺傳本質(zhì)是培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強的良種的一種行之有效的手段，可以與誘變育種等結(jié)合使用，

13、同時還需要不斷積累有關(guān)基礎(chǔ)資料，克服育種盲目性，以期達到工業(yè)生產(chǎn)的新需求。1960年法國的Barsi14研究小組在培養(yǎng)兩種不同動物細胞混合時發(fā)現(xiàn)了自發(fā)融合現(xiàn)象，同時日本的Dkada15發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘發(fā)內(nèi)艾氏腹水病細胞彼此融合， 從而開始了細胞融合的探索。1974 年匈牙利的Fereczy16采用離心力誘導(dǎo)的方法實現(xiàn)了白地霉(Creotrichumcandidum)營養(yǎng)缺陷型突變株原生質(zhì)體的融合; 隨后人們相繼用NaCl、KCl Ca( NO3) 2 等作為誘變劑進行融合， 但融合率比較低; 1978 年國際工業(yè)微生物遺傳學討論會提出了原生質(zhì)體的融合問題， 使這一技術(shù)迅速擴展到了育種領(lǐng)域; 1

14、979 年匈牙利的Pesti17首先提出了運用融合育種技術(shù)提高青霉素的產(chǎn)量， 從而開創(chuàng)了原生質(zhì)體融合技術(shù)在工業(yè)微生物育種實際工作中的應(yīng)用。原生質(zhì)體融合育種基本步驟為：標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證原生質(zhì)體制備等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏生產(chǎn)性能篩選。3 展望工業(yè)微生物遺傳育種在基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)工程和酶工程等現(xiàn)代生物技術(shù)的支持下，創(chuàng)造出許許多多的設(shè)計技巧、科技含量高、目的性強、勞動強度低、效果顯著的育種方法，為人類獲得穩(wěn)定性好、高產(chǎn)、新種類的工程菌株和開發(fā)新藥和工業(yè)產(chǎn)品，以及提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量提供了有

15、力的保障。我們有理由相信微生物遺傳育種學將得到更加全面的縱橫發(fā)展，將為生產(chǎn)實踐提供更多的優(yōu)良菌株，將在食品工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護、化工能源、礦產(chǎn)開發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。參考文獻1 陳三鳳，現(xiàn)代微生物遺傳學2談?wù)勀銓I(yè)微生物育種的看法2008，08.3 賀淹才.基因工程技術(shù)指南M.北京:科學出版社,1998, 924 施巧琴,吳松剛.工業(yè)微生物育種學M.2 版,北京:科學出版社,2003: 2- 36 黃大肪,林敏.農(nóng)業(yè)微生物基因工程北京：科學出版社，2001.7 吳乃虎.基因工程原理M.北京: 科學出版社（第二版）8 沈祖嘉,沈仁權(quán).分子遺傳學M上海：復(fù)旦大學，19889 施巧琴,

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