臨床生化檢驗(yàn)應(yīng)用工程師基礎(chǔ)知識(shí)培訓(xùn)

1、臨床生化檢驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)培訓(xùn)一、 生化基礎(chǔ)知識(shí)1.1生化診斷試劑盒為由一定的化學(xué)品或者酶類組成的多成分混合試劑（Reagent），最終以水溶液的方式與待測(cè)物發(fā)生一系列化學(xué)或者生化反應(yīng)，通過生成物或反應(yīng)物中某物質(zhì)的吸光度變化，測(cè)量待檢測(cè)物中某種特定物質(zhì)的含量。1.2生化診斷試劑用于檢測(cè)樣本，包括：人體血清（主要）、血漿及尿液中的各種酶類和代謝產(chǎn)物，用于預(yù)測(cè)，診斷以及治療監(jiān)測(cè)，協(xié)助臨床醫(yī)生診治疾病提供數(shù)據(jù)參考。1.3按功能分為：肝功、血脂、腎功、心肌、代謝、免疫&風(fēng)濕、離子&其他。1.4試劑性能評(píng)價(jià)指標(biāo)：1 試劑外觀2批間差3準(zhǔn)確度4精密度5線性（靈敏度）6抗干擾能力（特異性）7穩(wěn)定性1.5試劑檢測(cè)原

2、理（朗伯比爾定律）：A=Kbc 式中，A 為吸光度;K 為吸收系數(shù)，是與入射輻射的波長及吸收物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)的常數(shù) ;b為液層厚度，單位為cm;c 為吸收物質(zhì)的濃度。當(dāng)濃度的單位為 mol/L時(shí)，K 的單位為L/molcm，稱為摩爾吸收系數(shù)，通常用 表示。摩爾吸收系數(shù) 表示物質(zhì)對(duì)某一波長的輻射的吸收特性。愈大，表示物質(zhì)對(duì)某波長輻射的吸收力愈強(qiáng)，因而分光光度法測(cè)定的靈敏度就愈高.1.6理論值與實(shí)測(cè)值偏差的解釋：實(shí)測(cè)值偏離了朗伯比爾定律。偏離 Lambert-Beer定律的因素：1復(fù)合光對(duì)Beer 定律的偏離：吸收定律要求入射光為單色光，而分光光度計(jì)單色光的純度主要決定于色散元件及光路設(shè)計(jì)，即使高精

3、度的儀器，也得不到純單色光，而是波長寬度的復(fù)合光，其結(jié)果導(dǎo)致偏離Lambert Beer 定律。2 雜散光的影響：雜散光(stray light) 是進(jìn)入檢測(cè)器待測(cè)波長以外的光。主要來源于儀器色散元件表面的散射、單色器內(nèi)壁塵埃等。3狹縫寬度的影響：單色器設(shè)有進(jìn)、出口狹縫，狹縫愈窄，單色光愈純，吸光度增加，但輻射能減小，對(duì)弱吸收帶的測(cè)量有一定影響。定性分析時(shí)，為提高分辨能力常采用較小的狹縫，而定量分析時(shí)，在靈敏度允許的情況下，宜采用較大狹縫。當(dāng)出、入射狹縫寬度相等時(shí)，狹縫寬度引起的誤差最小。4非吸收作用引起的誤差：1.散射效應(yīng)：光吸收定律只適用于均勻的吸收體系，如待測(cè)溶液是混濁的，當(dāng)光通過時(shí)，將

4、產(chǎn)生散射效應(yīng)。其結(jié)果使光通過吸收物質(zhì)的光程不固定，散射光的一部分和透射光一起進(jìn)入檢測(cè)器，導(dǎo)致偏離 Beer 定律。因此，免疫比濁法常用多點(diǎn)校準(zhǔn)來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 熒光效應(yīng)：分子吸收輻射能后產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)分子以重新發(fā)射輻射的方式回到基態(tài)而發(fā)射熒光。由于多數(shù)顯色體系熒光效應(yīng)很小，而且熒光發(fā)射是各向同性，只有一部分沿透射光方向進(jìn)入檢測(cè)器，使測(cè)量吸光度偏低。一般情況下，熒光效應(yīng)對(duì)分光光度法產(chǎn)生的影響較小。目前，多數(shù)光度計(jì)設(shè)有兩個(gè)樣品室，對(duì)有熒光試樣可置于離檢測(cè)器較遠(yuǎn)的樣品室，或在光路中插入適當(dāng)?shù)臑V光片以消除熒光效應(yīng)。5測(cè)定過程中產(chǎn)生的誤差：化學(xué)反應(yīng)引起的誤差， 人為的誤差等，在此不作詳細(xì)解釋。1.7生化

5、測(cè)定方法：臨床化學(xué)自動(dòng)分析儀所涉及的測(cè)定方法包括終點(diǎn)測(cè)定法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法、固定時(shí)間法等。1.8.1生化分析基本術(shù)語概述：1雙波長：由主波長和副波長構(gòu)成的兩個(gè)波長，測(cè)定樣品采用雙波長可以消除對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。主波長是指測(cè)定某物質(zhì)時(shí)，生成的產(chǎn)物顏色對(duì)光吸收的特有波長。副波長是指測(cè)定某物質(zhì)時(shí)，為消除其他干擾物質(zhì)在主波長造成測(cè)定干擾所設(shè)定的波長。2反應(yīng)杯空白：在特定波長下，光通過以蒸餾水或空氣為反應(yīng)體系所測(cè)得的吸光度值。3試劑空白 ：在各特定波長下，光通過以蒸餾水或生理鹽水為樣品和相應(yīng)測(cè)定項(xiàng)目試劑構(gòu)成的反應(yīng)體系時(shí)所測(cè)得的吸光度值。4樣品空白：在各特定波長下，光通過以生物樣品和相應(yīng)測(cè)定項(xiàng)目（不含有引起反應(yīng)的一

6、種或多種成分的試劑）構(gòu)成的反應(yīng)體系所測(cè)得的吸光度值；或由生物樣品和相應(yīng)測(cè)定項(xiàng)目試劑構(gòu)成的反應(yīng)體系產(chǎn)生反應(yīng)最初時(shí)間所測(cè)得的吸光度值。5終點(diǎn)法 ：這是最常用的分析法。因?yàn)樵摲ǔＳ袠?biāo)準(zhǔn)液，因此又稱比例終點(diǎn)法，是經(jīng)過一定反應(yīng)時(shí)間后，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡(終點(diǎn))時(shí)做到的一點(diǎn)分析法。一般是在一定溫度下，試劑與樣品經(jīng)過一定反應(yīng)時(shí)間，被送入比色系統(tǒng)，然后檢測(cè)吸光度的變化，由微機(jī)系統(tǒng)處理計(jì)算和打印顯示出結(jié)果。其中又分一點(diǎn)終點(diǎn)和兩點(diǎn)終點(diǎn)法。6、連續(xù)監(jiān)測(cè)法：也叫速率法，此法通過測(cè)定酶所催化的反應(yīng)速度，間接計(jì)算出酶的含量，稱酶活性測(cè)定法。在酶促反應(yīng)過程中，不是任何時(shí)期的反應(yīng)速率都和酶濃度成正比。當(dāng)酶促反應(yīng)剛一開始，底物處于

7、過量狀態(tài)，酶與底物開始結(jié)合，生成復(fù)合物 (ES) ，底物濃度開始下降，此時(shí)產(chǎn)物尚未生成。當(dāng)復(fù)合物(ES)分解，生成產(chǎn)物(P) ，酶促反應(yīng)速度急驟上升，經(jīng)過很短的作用時(shí)間后，產(chǎn)物的生成量或底物的減少量與反應(yīng)時(shí)間成線性關(guān)系，反應(yīng)速度保持恒定不變，這一時(shí)期稱為零級(jí)反應(yīng)期。隨酶促反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，底物不斷消耗，酶促反應(yīng)條件逐漸變化，酶促反應(yīng)速度逐漸減慢，產(chǎn)物生成或底物減少量的變化曲線遂趨平坦，這一時(shí)期稱為一級(jí)反應(yīng)期。此時(shí)的反應(yīng)速率常常不能準(zhǔn)確反應(yīng)酶的含量。因此其測(cè)光點(diǎn)一般要求取在反應(yīng)達(dá)到平衡前。 7、兩點(diǎn)速率法：兩點(diǎn)速率法也叫固定時(shí)間法，對(duì)測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)采用兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定。采用此方法的如肌酐（苦味酸法），目前

8、多數(shù)自動(dòng)分析儀還是用 Jaffe 氏反應(yīng)測(cè)肌酐，即肌酐能同堿性苦味酸鹽生成紅橙色化合物，這個(gè)反應(yīng)特異性不高，因?yàn)榫S生素 C 、丙酣酸、丙酣、葡萄糖、乙酷醋酸、果糖、氨基馬尿酸、蛋白質(zhì)及其他反應(yīng)產(chǎn)物亦能與堿性苦位酸鹽生成紅色化合物，血清中的這些假肌酐約含25%。但真性肌酐與苦味酸的反應(yīng)為快反應(yīng)，假肌酐為慢反應(yīng)，因此測(cè)試時(shí)測(cè)試時(shí)間一般在樣品與堿性苦味酸試劑混合后 25 秒和 1 分 25 秒在 500nm 處測(cè)吸光度變化。兩時(shí)間點(diǎn)的吸光度變化之差，則為特異反應(yīng)肌酐濃度。8普通免疫比濁與膠乳增強(qiáng)免疫比濁法：普通免疫比濁法：是抗原與相應(yīng)的抗體直接結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，在反應(yīng)液中具有一定的濁度，可由一般

9、分光光度法進(jìn)行透射比濁測(cè)定，可用于某些蛋白質(zhì)和藥物濃度等的測(cè)定。該法須做多點(diǎn)校準(zhǔn)，再經(jīng)非線性回歸，求出抗原或抗體的含量。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法：是將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，制成致敏的膠乳顆粒，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)并不阻礙光線透過，兩個(gè)及其兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過的光減少，其減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，即與待測(cè)抗原量呈正比，由此可檢測(cè)樣本中的特定抗原含量。 該法比普通免疫比濁敏感度高，試劑穩(wěn)定，個(gè)體免疫復(fù)合物對(duì)結(jié)果影響也小，因此結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好，精確度高。9參考物的量值溯源性:通過

10、一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈,使測(cè)量結(jié)果或測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn),通常是與國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來的特性。10檢測(cè)限： 是指檢測(cè)系統(tǒng)可檢測(cè)出的最低分析物濃度。又稱分析靈敏度。11靈敏度與線性范圍：靈敏度與線性范圍有著緊密聯(lián)系，這也是跟生化儀的性能有關(guān)。靈敏度與線性范圍的取舍就要根據(jù)其醫(yī)學(xué)決定水平而定。一般儀器能測(cè)的光 密度值最大在35000。假設(shè)謀項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平在0100，如果1個(gè)單位濃度變化能引起儀器吸光度響應(yīng)量為1000，那么它能測(cè)的濃度范圍為035，可以看出，雖然其靈敏度很高，但在其檢測(cè)范圍沒有達(dá)到其醫(yī)學(xué)決定水平，即線性范圍太窄。相反，如果 1個(gè)單位濃度變化能引起

11、儀器吸光度響應(yīng)量為100，那么它能測(cè)的濃度范圍為0350，這個(gè)線性范圍是可以的。因此，靈敏度與線性的評(píng)價(jià)，要根據(jù)其醫(yī)學(xué)決定水平而定。 1.9常用校準(zhǔn)方法：終點(diǎn)法或兩點(diǎn)速率法，必須通過使用標(biāo)準(zhǔn)液，建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線；速率法，采用標(biāo)準(zhǔn)液校正可消除系統(tǒng)誤差，也可直接輸入Factor值。校準(zhǔn)類型：空白定標(biāo)：以水做標(biāo)準(zhǔn)液，消除試劑本身對(duì)測(cè)試的干擾；（酶類） 兩點(diǎn)定標(biāo)：以水作為零點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)液作為另一點(diǎn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；（Y=AX+B）多點(diǎn)定標(biāo)：兩個(gè)以上的標(biāo)準(zhǔn)液建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線；（ LOGIT-LOG ）1.10參考區(qū)間與醫(yī)學(xué)決定水平： 臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)被檢驗(yàn)者低正常還是異常，有何臨床意義，如何用檢驗(yàn)結(jié)果協(xié)助

12、臨床醫(yī)生診斷和治療，這就涉及到參考區(qū)間和醫(yī)學(xué)決定水平了。參考區(qū)間大多是采用正態(tài)分布的原理制定，以95%的分布區(qū)間（x2s）即為參考區(qū)間的上、下限，少數(shù)用百分位數(shù)來制定參考區(qū)間。不論采用什么方法，總有少數(shù)正常人的測(cè)定值落在異常范圍內(nèi)。因此，假性結(jié)果是避免不了的。當(dāng)結(jié)果接近上限或下限時(shí)，不要輕易下正?；蛴胁〉慕Y(jié)論，要根據(jù)被測(cè)者的其他表征綜合判斷或過一段時(shí)間復(fù)查后，再做分析。 醫(yī)學(xué)決定水平是由Barnett于1968年首先提出的。是指臨床上必須采取措施時(shí)的檢測(cè)水平。決定性水平是一個(gè)閥值，高于該值或低于該值，應(yīng)決定對(duì)患者采取適當(dāng)?shù)闹委煷胧?。醫(yī)學(xué)決定水平可在疾病診斷中起著排除或確認(rèn)的作用，對(duì)某些疾病進(jìn)行

13、分級(jí)或分類，或愈后做出估計(jì)，來提醒醫(yī)生在臨床上做出相應(yīng)的處理方式。 醫(yī)學(xué)決定水平與參考區(qū)間的區(qū)別在于它不僅對(duì)健康人的數(shù)值進(jìn)行研究，以決定健康人的范圍，同時(shí)還對(duì)有關(guān)疾病的不同病情的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，以定出不同的決定性限值，以引導(dǎo)醫(yī)生采取不同的臨床措施。它的應(yīng)用可以克服只使用參考范圍的缺點(diǎn)，使一個(gè)檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)病人能起到提供診斷，處理依據(jù)的作用。1.11酶法檢測(cè)基本知識(shí)：酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生并能在體內(nèi)起催化作用的，一類特殊蛋白質(zhì)。體內(nèi)幾乎所有的代謝反應(yīng)都是在不同的酶催化下進(jìn)行的。酶的催化效率高，對(duì)底物有嚴(yán)格的選擇性，酶非常不穩(wěn)定，酶濃度的變化是許多疾病的敏感指針，這是建立和發(fā)展診斷酶學(xué)的依據(jù)。用酶作試劑(工具

14、酶)測(cè)定非酶物質(zhì)具有效率高、特異及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析的特點(diǎn)，是目前臨床生化檢驗(yàn)的主流方法。1.11.1酶促反應(yīng)速度的因素：包括:酶的濃度、底物的濃度、激活劑與抑制劑、pH 和溫度等。在研究某一因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)中其他因素不變。酶促反應(yīng)中所指速度是初速度，因?yàn)檫@時(shí)的反應(yīng)速度與酶濃度成正比，可以避免產(chǎn)物及其他因素對(duì)反應(yīng)速度的影響。在建立定量測(cè)定酶活性的方法時(shí)，需要研究酶促反應(yīng)的速度及影響此速度的因素，通常稱之為反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。 1.11.2酶活力測(cè)定酶的含量很低，除免疫學(xué)方法外，不能直接測(cè)定其含量，只能測(cè)其催化反應(yīng)過程中一定時(shí)間內(nèi)物質(zhì)變化的量，即酶促反應(yīng)速率，或稱酶的活力。要保證只有待

15、測(cè)酶的量影響反應(yīng)速率，其他各種影響反應(yīng)速率的因素都在嚴(yán)格控制之下，并保持各測(cè)定間的一致性。（一）酶促反應(yīng)的過程 通過測(cè)定底物濃度的下降，或測(cè)定產(chǎn)物濃度的上升，可以追蹤酶反應(yīng)過程中底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的過程。通常多測(cè)定產(chǎn)物的形成，因?yàn)闇y(cè)定產(chǎn)物從零或者從低濃度的增加，比測(cè)定高濃度底物的下降更可靠。典型的酶反應(yīng)過程曲線分為幾個(gè)時(shí)期。緊隨著加人血清或底物啟動(dòng)反應(yīng)后，在出現(xiàn)明顯的變化前為延遲期;此期從幾秒到幾分鐘。隨后是底物和產(chǎn)物變化與時(shí)間成直線的時(shí)期，形成產(chǎn)物的速率恒定，此時(shí)期的速率為反應(yīng)初速度。此期底物也下降，但實(shí)際上反應(yīng)速度與底物濃無關(guān)，對(duì)底物濃度而言，酶促反應(yīng)實(shí)際上是零級(jí)反應(yīng)。反應(yīng)曲線的直線期時(shí)間長短

16、相差懸殊。緊跟著是反應(yīng)速率持續(xù)下降，進(jìn)入速度依賴于底物濃度的一級(jí)反應(yīng)期。在這一期中，底物濃度下降，逆反應(yīng)增加，抑制性產(chǎn)物蓄積，乃至酶本身進(jìn)行性的滅活等因素也起作用。最后，當(dāng)?shù)孜锲鸨M或達(dá)到平衡時(shí)，反應(yīng)停止。在零級(jí)反應(yīng)期中，測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)形成產(chǎn)物的量，是以此期中速率維持恒定為條件。否則表觀的反應(yīng)速率將不正比于酶濃度。也就是選擇的監(jiān)測(cè)點(diǎn)必須在反應(yīng)速率恒定區(qū)（零級(jí)反應(yīng)期）。在正常測(cè)定中，為了能縮短延遲期和延長線性期，不僅要適量的底物濃度，還要在試劑中加入某些激活劑和其他的輔助因子。以改善反應(yīng)進(jìn)程曲線。(二) 固定時(shí)間法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法 在我國臨床實(shí)驗(yàn)室中，目前測(cè)定酶活性的方法，已從手工操作的固定時(shí)間法及兩

17、點(diǎn)測(cè)定法過渡到連續(xù)監(jiān)測(cè)法。固定時(shí)間法在反應(yīng)過程中測(cè)定一點(diǎn)的吸光度;兩點(diǎn)測(cè)定法是在反應(yīng)開始及反應(yīng)經(jīng)一定時(shí)間后，分別測(cè)兩點(diǎn)的吸光度，根據(jù)兩點(diǎn)間吸光度的差值，推算酶的活力。固定時(shí)間法和兩點(diǎn)測(cè)定法都是在酶和底物孵育一段時(shí)間后測(cè)定總的變化。兩點(diǎn)測(cè)定法也應(yīng)屬于酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法，但動(dòng)力學(xué)測(cè)定法這一術(shù)語，習(xí)慣上僅指多點(diǎn)測(cè)定的動(dòng)力學(xué)方法，即所謂速率法或連續(xù)監(jiān)測(cè)法，不論用手工法或自動(dòng)法。固定時(shí)間法和兩點(diǎn)測(cè)定法可能會(huì)有幾種誤差:酶活力非常高的樣品，由于底物消耗速度快，反應(yīng)很快呈現(xiàn)遲緩或停止；有一些反應(yīng)類型延遲期長；某些標(biāo)本的反應(yīng)曲線可能是非線性的；活力高的標(biāo)本，超出了限定的活力測(cè)定范圍，若稀釋標(biāo)本可能會(huì)引起催化活力

18、不成比例的變化。由于光度計(jì)及方法學(xué)的改進(jìn)，可以縮短孵育時(shí)間，增加酶活力測(cè)定范圍，縮短延遲期，增加線性期，使固定時(shí)間法仍發(fā)揮重要作用；尤其在中小醫(yī)院實(shí)險(xiǎn)室中更有實(shí)用價(jià)值，甚至一部分生化分析儀也采用了固定時(shí)間法。1.11.3酶法分析酶法分析即酶作為分析試劑，有利于提高測(cè)定結(jié)果的特異性;不需要先將測(cè)定的物質(zhì)分離和提純;可以直接分析血清這樣復(fù)雜的濡合物。具有絕對(duì)特異性的酶，即只作用于某一種物質(zhì)的酶，特別適合分析用。尿酸氧化酶、尿素酶、葡萄糖氧化酶特異性高。但實(shí)際上不能都如此。因此，必須了解酶對(duì)底物的特異性，從而預(yù)料可能發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正。在以酶作分析試劑測(cè)定某-物質(zhì)時(shí)，也可用偶聯(lián)反應(yīng);而且偶聯(lián)反

19、應(yīng)的特異性可以增加反應(yīng)全過程的特異性。如用己糖激酶 (HK) 法測(cè)葡萄糖，HK 也作用于果糖產(chǎn)生相應(yīng)的 6-磷酸醋;但偶聯(lián)的指示反應(yīng)是G6PD ，它特異地催化葡萄糖-6-磷酸的反應(yīng)，用此酶測(cè)定己糖激酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物，明顯地提高了偶聯(lián)系統(tǒng)的特異性。(一) 傳統(tǒng)的酶法分析非酶物質(zhì)方法以酶作試劑進(jìn)行分析的方法有兩種。廣泛應(yīng)用的第一種方法，是使反應(yīng)進(jìn)行到完全，使全部底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，稱終點(diǎn)法。這是最理想的分析類型。但是，在非理想的平衡時(shí)，底物遠(yuǎn)未完全轉(zhuǎn)變。此時(shí)需增加酶或非酶的反應(yīng)，以轉(zhuǎn)變或捕獲第一個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物，使反應(yīng)在所要求的方向上進(jìn)行到完全。如用乳酸脫氫酶測(cè)定乳酸中，形成的丙酣酸，通過加入硫酸阱形成腺

20、而捕獲丙酣酸，使反應(yīng)達(dá)到完全。第二種方法是動(dòng)力學(xué)法，即間隔一定的時(shí)間測(cè)定底物的變化量(=速率)。由酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線已知，開始為高底物濃度由酶催化的反應(yīng)，首先服從零級(jí)反應(yīng)，然后隨著底物濃度減低，進(jìn)入一級(jí)反應(yīng)期。對(duì)于任何一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)開始后在一給定時(shí)間 t 的底物濃度 (S) 為:(S) =(So)*e-kt (So) 是最初的底物濃度，e 是自然對(duì)數(shù)的底，K 是速率常數(shù)。在t1到 t2 的固定時(shí)間間隔中，底物濃度的變化量 (S) 與 (So) 的相互關(guān)系為:(So)=- (S)/( e-kt- e-kt2)也即在一固定時(shí)間間隔中，底物濃度的變化量正比于底物的初濃度。這是一級(jí)反應(yīng)的通性。對(duì)于酶的反

21、應(yīng)，當(dāng)(S )Km 時(shí)，米氏方程簡化為:V=(Kmax/Km)*(S)K 為一級(jí)速度常數(shù)。在反應(yīng)過程中的兩個(gè)固定時(shí)間，測(cè)量與底物濃度性質(zhì)相關(guān)的(如光吸收)的方法為兩點(diǎn)動(dòng)力學(xué)法。從理論上講，這是用酶法測(cè)定底物的最準(zhǔn)確的方法；但方法學(xué)上比平衡法要求高，所有影響反應(yīng)速率的因素如 pH 、溫度及酶量必須在兩點(diǎn)分析中保持恒定，并準(zhǔn)確定時(shí)。必須用標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行校正。為保證一級(jí)反應(yīng)條件，底物濃度必須低至小于 O.2xKm 。酶對(duì)底物的 Km 要高，以便測(cè)出較寬范圍的底物濃度。為增加試劑酶的表現(xiàn) Km 值，可引進(jìn)競爭性抑制劑。此外，被測(cè)非酶物質(zhì)作為酶促反應(yīng)激活劑者，則用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，如無機(jī)離子鉀和鈣的酶法測(cè)定。(二

22、) 酶循環(huán)法分析非酶物質(zhì)酶循環(huán)法 ( enzymatic eyeing method ) ，是利用酶的底物特異性放大靶物質(zhì)(被測(cè)物)以提高靈敏度的測(cè)定方法。只循環(huán)靶物質(zhì)，減少了樣品存在的其他物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，因此不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或?qū)Π形镔|(zhì)進(jìn)行提取，而且不需要特殊設(shè)備，是一種很有前途的測(cè)定技術(shù)。利用酶循環(huán)法測(cè)定的項(xiàng)目主要是總膽汁酸（TBA）。二、 生化儀器基礎(chǔ)知識(shí)2.1檢驗(yàn)科常見全自動(dòng)生化分析儀：l 日立：7100、7170、7080、7180、7600，l 奧林巴斯：AU400、AU640、AU2700、AU5400l 貝克曼：CX3、4、5、7、9、LX20、DXC800,AU480，

23、AU680，AU5800l 東芝：TBA-40、TBA-120l 雅培：2000、C8000、AEROSETl 拜爾(西門子)：ADVIA1200、ADVIA1650、ADVIA2400 2.2下面簡單介紹幾個(gè)常用品牌的相關(guān)儀器性能日立：現(xiàn)在各醫(yī)院所用日立儀器的型號(hào)主要為7180、7600，除7080為31個(gè)測(cè)光點(diǎn)外，其余都為34點(diǎn)。以下為7180儀器主要性能介紹：分析速度： 800個(gè)測(cè)定/小時(shí)（最大），約4.5秒加樣一次可分析項(xiàng)目： 86項(xiàng)（帶ISE的話，最大可達(dá)89項(xiàng)），計(jì)算項(xiàng)目8項(xiàng)樣本量： 1.535.0l，0.1l可調(diào)；試劑量： 20270l，1l可調(diào)；總反應(yīng)體積： 120300l；測(cè)

24、光時(shí)必須滿足該條件；光源燈： 保質(zhì)期750小時(shí)；比色杯： 20只8組共160只，依據(jù)杯空白值進(jìn)行更換；測(cè)光系統(tǒng)：采用凹面蝕刻光柵的后分光、雙波長測(cè)定方式；12個(gè)波長：340、405、450、480、505、546、570、600、660、700、750、800nm穩(wěn)定性高且可有效補(bǔ)償樣本混濁、溶血、黃疸及電源電壓變動(dòng)引發(fā)的干擾測(cè)定過程： 全反應(yīng)監(jiān)測(cè)，10分鐘測(cè)定34次吸光度值。15分鐘測(cè)定53次吸光度值依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇相應(yīng)測(cè)光點(diǎn)的吸光度值計(jì)算結(jié)果樣本容器：樣本針有液面探測(cè)裝置，可使用原始采血管離出血清后直接上機(jī)測(cè)定試劑： 同一項(xiàng)目最多可加入四步試劑，兩試劑艙位置各45個(gè)，溫度515。l 奧林巴

25、斯：AU400、AU640、AU2700、AU5400奧林巴斯生化儀已經(jīng)被貝克曼收購，除AU400、AU640、AU2700、AU5400外，還有一款A(yù)U680，其操作界面為貝克曼公司設(shè)計(jì)，但主要性能跟以往的AU640基本保持一致。測(cè)光點(diǎn)為27個(gè)，R2試劑在1011點(diǎn)加入。以下為AU400/600/640等型號(hào)設(shè)參數(shù)需了解的儀器性能：Sample vol（樣品量）：250,可以按0.5ul為單位增減。Reagent 1 vol（第一試劑量）：25-300,可以按1ul為單位增減。Dil vol(稀釋液-吐水量)：一般用濃縮試劑時(shí)才用。Reagent 2 vol（第二試劑量）：25-300，可以

26、按1為單位增減。Dil vol(稀釋液-吐水量)：一般用濃縮試劑時(shí)才用。第二試劑是固定的10-11點(diǎn)之間加入的。測(cè)定波長共有13種：340,380,410,450,520,540,570,600,660,700,750, 800nm。Method（方法學(xué)）共六種：End,Rate,Fixed;End1,Rate1,Fixed1。前三種與后三種的差別為：前三種是以試劑為空白的，后三種是以比色杯為空白的。Reaction（反應(yīng)方向）：-，+。End與Fixed法不起作用，但是Rate法一定要輸正確。Linearity（線性）：Fst ，Lst，Rate法才輸入，一般國產(chǎn)試劑30%；進(jìn)口試劑：15%

27、。No-Lag-Time： Rate法才輸入，在讀點(diǎn)期內(nèi)，如果反應(yīng)太快，超過線性（Linearity限）儀器會(huì)自動(dòng)用線性比較好的那一段來計(jì)算。試劑空白OD限：Fst指的是0點(diǎn)，Lst指的是27點(diǎn)。只對(duì)Rate法有用，一般向下的反應(yīng)，輸0.92.5，向上的反應(yīng)-2.00.8。下圖顯示屏幕上的基本顯示模型l 貝克曼：CX3、4、5、7、9、LX20、DXC800，貝克曼儀器是作為急診用的優(yōu)先選擇儀器，其有較高的準(zhǔn)確度，精密度和穩(wěn)定性，抗交叉污染也是一流的，但不適合常規(guī)大量樣本的檢測(cè)，其試劑消耗量也是現(xiàn)有儀器中比較大的。貝克曼儀器波長數(shù)為10個(gè)，340,380,410,470,520,560,600

28、,650,670,700nm。l 監(jiān)測(cè)時(shí)間不是以周期（點(diǎn)）計(jì)，而是以秒來計(jì)，每8S測(cè)一次吸光度。加樣時(shí)間為第0s, 第二次灌注時(shí)間為-180s，或9738s。貝克曼儀器必須用兩個(gè)波長測(cè)定，否則儀器不運(yùn)行，在設(shè)參數(shù)時(shí)必須符合這一規(guī)律。拜爾（西門子）： ADVIA2400 ，測(cè)試速度2400 Test /小時(shí)，比色法1800Test/小時(shí)，電解質(zhì)600測(cè)試/小時(shí)。其中有波長：340/410/451/478/505/545/571/596/658/694/751/805/845/884nm 14個(gè)。測(cè)試方法：終點(diǎn)法（EPA）、速率法（RRA）、兩點(diǎn)速率法（2PA）及多點(diǎn)均相免疫分析。微量取樣技術(shù)：所

29、有的樣本按1:5比例進(jìn)行預(yù)稀釋處理（30ul樣品+120ul生理鹽水）一般可作15個(gè)項(xiàng)目分析。微量技術(shù)加試劑保證每測(cè)試平均試劑體積為80ul-120ul，理論上1mL的試劑能做12.5個(gè)測(cè)試，最低也能做到8個(gè)測(cè)試。體現(xiàn)了其最大優(yōu)點(diǎn)就是省試劑。不同型號(hào)的生化儀每毫升試劑測(cè)試數(shù)是不一樣的，以下是各品牌的理論測(cè)試數(shù)：n 7170：180-380ul 5.5 T/mln 7060：250-500ul 4 T/mln AU400:150-350ul 6.6 T/ml n BECKMAN: 200-330ul 5 T/mln TBA-40:120-360ul 8.3 T/mln TBA-120:80-36

30、0ul 12.5 T/mln ADVIA2400：80-120ul 12.5 T/mln 進(jìn)口儀器4-5人份/毫升；國產(chǎn)儀器3-4人份/毫升三、 各生化項(xiàng)目的臨床意義及其檢測(cè)原理：3.1肝功能測(cè)定項(xiàng)目3.1.1 血清總膽汁酸TBA：膽汁酸是由膽固醇在肝臟中分解代謝所生成的，肝膽、腸、門靜脈都參與膽汁酸的自主循環(huán)過程。膽汁酸主要存在于肝腸循環(huán)系統(tǒng)并通過再循環(huán)起一定的保護(hù)作用。只有一少部分膽汁酸進(jìn)入外周循環(huán)。促進(jìn)膽汁酸肝腸循環(huán)的動(dòng)力是肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)棗吸收膽汁酸并將其分泌入膽汁，經(jīng)膽囊誘導(dǎo)的膽囊收縮，小腸的推進(jìn)蠕動(dòng)，回腸粘膜的主動(dòng)運(yùn)輸從血液經(jīng)門靜脈流入。 血清中膽汁酸的水平是反映肝臟損傷的重要指征

31、，一旦肝細(xì)胞發(fā)生病變，血中膽汁酸濃度極易升高。急性肝炎、慢活肝、肝硬化、肝癌，TBA結(jié)果明顯升高。與ALT比較，急性肝炎、慢性活肝ALT、TBA都較敏感，但肝硬化、肝癌兩種結(jié)果差異明顯：TBA陽性率高達(dá)95%，而ALT陽性率僅為20%。因此，TBA測(cè)定用于監(jiān)測(cè)慢性肝病價(jià)值很大。其測(cè)定方法簡單，是一項(xiàng)很具實(shí)用價(jià)值的肝功能診斷指標(biāo)。檢驗(yàn)原理:血清中的膽汁酸（3-羥類固醇）會(huì)被3-羥類固醇脫氫酶（3-HSD）及-硫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD+)特異性地氧化，生成3 - 酮類固醇，同時(shí)Thio-NAD+ 被還原成-硫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(Thio-NADH)。新生成的3 -酮類

32、固醇在3-羥類固醇脫氫酶（3-HSD）及-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(NADH)存在下，還原成膽汁酸，同時(shí)NADH氧化成-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD+）。通過酶的循環(huán)反應(yīng)，微量膽汁酸的量被放大。在405 nm處測(cè)定Thio - NADH吸光度的變化值，可求得血清中膽汁酸的含量。3.1.2 谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT/GPT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)， 又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于組織細(xì)胞中，正常狀況下只有極少量釋放入血液中，所以此酶在血清中活性很低。當(dāng)組織發(fā)生病變時(shí)，組織細(xì)胞中ALT就大量釋放于血液，使血清中該酶的活性升高。血清中ALT主要來源于肝臟，各種肝炎活動(dòng)期、肝癌、肝硬化和阻塞性黃疸時(shí)A

33、LT的活性顯著增高，心肌梗塞時(shí)ALT的活性僅有輕度增高。檢驗(yàn)原理:本法為IFCC推薦的測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的動(dòng)力學(xué)方法，在ALT速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)為：L - 丙氨酸+2-酮戊二酸 ALT 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+ NADH + H+ LDH L -乳酸+ NAD+在340 nm波長下檢測(cè)NADH的氧化速率，吸光度的下降速率與ALT活性成正比。3.1.3 谷草轉(zhuǎn)氨酶AST/GOT：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，又稱谷草轉(zhuǎn)氨酶，此酶在組織中分布很廣，如心肌、橫紋肌、肝臟，其中心肌含量最高。心肌梗死后6 -12小時(shí)開始增高，16 - 48小時(shí)達(dá)最高值，3 - 6天恢復(fù)正常。肝炎時(shí)，AST和A

34、LT一樣明顯升高，急性期由于ALT清除率較慢，往往ALT大于AST活力。恢復(fù)時(shí)也是ALT較慢，AST/ALT比值小于1。如轉(zhuǎn)氨酶升高，且比值大于1常說明有慢性肝炎的可能，肝硬化則比值明顯升高。因此，AST活性的增高意味著心肌或肝細(xì)胞損害的發(fā)生。檢驗(yàn)原理:本法為IFCC推薦的測(cè)定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的動(dòng)力學(xué)方法，在AST速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)為：L -天門冬氨酸+ -酮戊二酸 AST 草酰乙酸+ L -谷氨酸草酰乙酸+ NADH + H+ MDH L - 蘋果酸+ NAD+3.1.4 -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶-GT：-GT主要用于診斷肝膽疾病。-GT明顯增高見于原發(fā)/繼發(fā)性肝癌、阻塞性黃疸、膽汁性肝硬化、

35、胰頭癌、肝外膽道癌等。輕度或中度增高見于傳染性肝炎、肝硬化、胰腺炎以及嗜酒和長期服用某些藥物（如苯巴比妥)者，在解釋酶活性增高的原因時(shí)應(yīng)全面考慮。檢驗(yàn)原理:L- r-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺+雙甘氨肽 -GT L-r-谷氨酰雙甘氨肽 + 5-氨基-2硝基苯甲酸3.1.5 堿性磷酸酶ALP：骨骼系統(tǒng)疾患如纖維骨炎、變形性骨炎、成骨不全癥、骨質(zhì)軟化癥、佝僂病、轉(zhuǎn)移性骨瘤和骨折愈合期等可使ALP活性增高。肝膽疾患如阻塞性黃疸、急性或慢性黃疸型肝炎、肝癌和肝膿腫等，以及甲狀腺功能亢進(jìn)、妊娠后期等均可使ALP活性增高。而重癥慢性腎炎、兒童甲狀腺功能不全、貧血、惡病質(zhì)等則使ALP活性下降。檢驗(yàn)原理:

36、IFCC推薦的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定方法，其原理是 以磷酸對(duì)硝基苯酚(4NPP)為底物，2氨基2甲基1丙酮(AMP)為磷酸?；氖荏w物質(zhì)，增進(jìn)酶促反應(yīng)速率。4NPP在堿性溶液中為無色，在ALP催化下，4NPP分裂出磷酸基團(tuán)，生起游離的對(duì)硝基苯酚(4NP)，后者在堿性溶液中轉(zhuǎn)變成醌式結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)較深的黃色。在波長 405nm處監(jiān)測(cè)吸光度增高速率，計(jì)算ALP活性單位。3.1.6 白蛋白ALB：血清白蛋白在肝臟合成。在營養(yǎng)不良的病人中可看到很低水平的血漿白蛋白。另外，血液稀釋或由于營養(yǎng)不良，肝臟疾病使合成白蛋白能力下降，或由于腎病綜合癥、蛋白丟失性腸道疾病等均可導(dǎo)致低白蛋白。高白蛋白血癥則常見于脫水或血液濃縮。檢

37、驗(yàn)原理:在pH = 4.2的酸性條件下，白蛋白作為一種陽離子，結(jié)合陰離子染料溴甲酚綠(BCG)，生成藍(lán)綠色復(fù)合物，在波長630nm處有吸收峰。其吸光度與白蛋白濃度成正比，與同樣處理的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較，可求得血清中白蛋白的含量。3.1.7 總蛋白TP：血液中水分增加，營養(yǎng)不良和消耗增加，肝臟疾病以及腎病綜合癥等均可導(dǎo)致總蛋白水平下降。脫水癥及免疫球蛋白增加的疾病則可使血清總蛋白水平增高。檢驗(yàn)原理:在堿性溶液中，血清蛋白與二價(jià)銅離子反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物(雙縮脲反應(yīng)），顏色深淺與總蛋白的濃度成正比例關(guān)系。3.1.8 總膽紅素TBIL/直接膽紅素DBIL ：膽紅素與重氮化對(duì)氨基苯磺酸（DSA）反應(yīng)生成一種

38、紅色偶氮染料，在546nm波長處染料的吸光度與樣本中膽紅素的濃度成正比。水溶性膽紅素葡萄糖醛酸直接與重氮化對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)，而白蛋白結(jié)合的間接膽紅素只有在促進(jìn)劑作用下才能反應(yīng)，總膽紅素=直接膽紅素+間接膽紅素。檢驗(yàn)原理:膽紅素與重氮化對(duì)氨基苯磺酸（DSA）反應(yīng)生成一種紅色偶氮染料，在546nm波長處染料的吸光度與樣本中膽紅素的濃度成正比。水溶性膽紅素葡萄糖醛酸直接與重氮化對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)，而白蛋白結(jié)合的間接膽紅素只有在促進(jìn)劑作用下才能反應(yīng)，總膽紅素=直接膽紅素+間接膽紅素。3.1.9 -L巖藻糖苷酶AFU： AFU是溶酶體酶，其作用是分解巖藻糖甘油結(jié)合物。血清-L-巖藻糖苷酶（AFU)是肝細(xì)胞

39、肝癌診斷的一個(gè)新標(biāo)記物。在甲胎蛋白（AFP)陰性的原發(fā)性肝癌病例中，大約有7085出現(xiàn)AFU陽性結(jié)果，而且小細(xì)胞肝癌病人血清AFU的陽性率高于AFP。同時(shí)測(cè)定AFU與AFP，可使原發(fā)性肝癌的陽性檢出率從單獨(dú)測(cè)定AFP的70左右提高到90%94。因此，檢測(cè)血清AFU活性，對(duì)肝癌的早期診斷和肝癌高發(fā)人群的篩查均有重要意義。檢驗(yàn)原理:2-氯-4-硝基苯酚-L-巖藻吡喃糖苷在酶的水解作用下生成2-氯-4-硝基苯酚和-L-巖藻糖，可用速率法監(jiān)測(cè)2-氯-4-硝基苯酚，405nm波長處的吸光率的上升速率。反應(yīng)速率與-L-巖藻糖苷酶的含量成正比，可計(jì)算出樣本中-L-巖藻糖苷酶的活力。3.1.10 5-核苷酸酶

40、 5-NT： 5-NT是一種特殊的水解酶。能特異性的將次黃嘌呤核苷酸水解為次黃苷和磷酸，此酶廣泛分布在人體和動(dòng)物的組織中，5-NT經(jīng)肝細(xì)胞膜進(jìn)入膽汁，隨之進(jìn)入血清中 ，是檢測(cè)肝膽疾病的重要指標(biāo)。肝內(nèi)外膽管阻塞，肝癌和伴隨循環(huán)轉(zhuǎn)移的乳房切除術(shù)后的病人此酶升高明顯。診斷肝膽疾病和肝癌，5-NT較其他酶類更敏感。檢驗(yàn)原理：次黃嘌呤核苷酸+H2O 5-NT 次黃苷+磷酸次黃苷+磷酸 核苷酸磷酸化酶 次黃嘌呤+核酸-1-磷酸次黃嘌呤+2 H2O+2 O2 黃嘌呤氧化酶 尿酸+ 2H2O22H2O2+EHSPT+4-AA POP 4H2O+紅色醌類3.1.11 腺苷脫氨酶ADA：ADA活性是反映肝損傷的敏

41、感指標(biāo)，可作為肝功能常規(guī)檢查項(xiàng)目之一，與ALT或GGT(-GT)等組成肝酶譜，能較全面地反映肝臟病的酶學(xué)改變。血清中ADA活性的測(cè)定可用于判斷急性肝損傷及殘留病變；協(xié)助診斷慢性肝?。挥兄诟卫w維化的診斷有助于黃疸的鑒別：ADA在良惡性難辨的滲出液鑒別診斷上有重要價(jià)值。結(jié)核性胸腹水ADA活性顯著增高，癌性胸腹水不增高。此外，腦脊液ADA檢測(cè)可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷和鑒別診斷的重要指標(biāo)，結(jié)核性腦膜炎ADA活性顯著增高，病毒性腦炎不增高，顱內(nèi)腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病稍增高。ADA檢驗(yàn)原理:本方法原理反應(yīng)方程式如下：腺苷 + H20 次黃苷+ NH3PNPXOD次黃苷+ Pi 次黃嘌呤 + 1磷酸核

42、苷POD次黃嘌呤+ H20+2O2 尿酸+2H2O22H2O2+4-AA+EHSPT 4H2O+醌(550nm) ADA酶解腺苷產(chǎn)生次黃苷，再應(yīng)用嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)酶解次黃苷產(chǎn)生次黃嘌呤，然后通過黃嘌呤氧化酶(XOD)的作用，生成H2O2，再在過氧化物酶(POD)作用下生成醌色素。通過測(cè)量550nm處吸光度上升的速度，計(jì)算ADA的活性大小。3.1.12 膽堿酯酶CHE：膽堿酯酶可用于有機(jī)磷殺蟲劑和戰(zhàn)爭劑急慢性中毒的診斷。在病情嚴(yán)重的肝炎患者中，約有五分之四的病人膽堿酯酶降低至正常的60%，危重病人可降至正常的10%以內(nèi)，甚至完全缺乏。另外，慢性活動(dòng)型肝炎、肝硬化均可導(dǎo)致膽堿酯酶活力下降

43、。檢驗(yàn)原理: 膽堿酯酶催化水解丁酰硫代膽堿酯酶形成膽堿酯酶和丁酸鹽。黃色三價(jià)鐵氰化鉀轉(zhuǎn)化為無色二價(jià)亞鐵氰化鉀，吸光度降低程度與樣本中膽堿酯酶活性成正比關(guān)系。3.2血脂類測(cè)定項(xiàng)目3.2.1甘油三酯TG ：甘油三酯升高：是冠心病的誘因之一?？梢鸸跔顒?dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、糖尿病、原發(fā)性高血脂癥、肥胖癥、急性胰腺炎、膽道梗阻、極度貧血等。甘油三酯降低：有嚴(yán)重營養(yǎng)不良，脂肪消化吸收障礙，甲亢等。檢驗(yàn)原理:甘油三酯經(jīng)酯酶水解被測(cè)定，生成的過氧化氫，4-氨基安替比林和4-氯酚在過氧化物酶催化下生成醌亞胺。有色物質(zhì)造成吸光度的改變與甘油三酯的濃度成正比。3.2.2 膽固醇 TCHO:長期的高膽固醇、高飽和

44、脂肪和高熱量飲食，遺傳因素、缺少運(yùn)動(dòng)、腦力勞動(dòng)、精神緊張等可使膽固醇升高；遺傳因素、甲亢、營養(yǎng)不良、慢性消耗性疾病等可使膽固醇降低。檢驗(yàn)原理:膽固醇經(jīng)酶水解和氧化被測(cè)定。在酚和過氧化物酶存在情況下，過氧化氫和4-氨基安替比林形成有顏色的醌類物質(zhì)。3.2.3 高密度脂蛋白膽固醇HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇被視為防止冠心病的一種保護(hù)性脂類成分，與低密度脂蛋白膽固醇一起對(duì)冠心病的危險(xiǎn)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢驗(yàn)原理:乳糜微粒，極低密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇通過與抗人-脂蛋白抗體反應(yīng)被特異性消除和破壞，在過氧化氫酶作用下水解。剩余的高密度脂蛋白膽固醇在加入特異性的表面活化劑后經(jīng)膽固醇脂酶(CE)及膽

45、固醇氧化酶(COD)等特異的酶促反應(yīng)被測(cè)定。通過對(duì)藍(lán)色結(jié)合物吸光度的測(cè)量對(duì)應(yīng)得出HDL的濃度。這種方法要比其它檢測(cè)方法更加特異。3.2.4 低密度脂蛋白膽固醇LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)被認(rèn)為是導(dǎo)致冠心病(CHD）的脂質(zhì)成份,與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C）同時(shí)檢測(cè)，用于冠心病的診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。檢驗(yàn)原理:本檢測(cè)中第一步反應(yīng)通過酶反應(yīng)特異性去除乳糜微粒、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白膽固醇，保護(hù)LDL不與酶進(jìn)行反應(yīng)。第一步：HDL、VLDL、CM +H2O + O2表面活性劑 膽甾烯酮+脂肪酸+H2O2 2H2O2 過氧化物酶 2H2O+O2第二步：通過酶反應(yīng)和特殊的表面活性劑測(cè)

46、定剩下的低密度脂蛋白膽固醇。通過對(duì)藍(lán)色結(jié)合物吸光度的測(cè)量，得出LDL的濃度。LDL-C+H2O+O2 表面活性劑 膽甾烯酮+脂肪酸+H2O2H2O2+色原 過氧化物酶 有顏色的醌類物質(zhì)+H2O3.2.5 載脂蛋白A1 APOA1：載脂蛋白的測(cè)定是評(píng)價(jià)心血管疾病危險(xiǎn)因素的指標(biāo)，對(duì)于發(fā)現(xiàn)和診斷載脂蛋白異常，研究載脂蛋白在脂類代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有重要意義。ApoA(和ApoA一起)占HDL蛋白的80%-90%，因此，血清中ApoA可以代表HDL水平，與HDL-C呈明顯正相關(guān)。ApoA降低主要見于高脂血癥、冠心病、腦血管病、ApoA缺乏癥、家族性低脂蛋白血癥、魚眼病等。檢驗(yàn)原理:當(dāng)樣品與緩沖液和

47、抗體混合，樣品中的載脂蛋白A1與試劑中的抗人載脂蛋白A1抗體特異性結(jié)合,形成濁度增加，通過測(cè)定濁度的透光率判斷樣品中的載脂蛋白A1含量。 3.2.6 載脂蛋白B APOB ：載脂蛋白的測(cè)定是評(píng)價(jià)心血管病危險(xiǎn)因素的指標(biāo)，對(duì)于發(fā)現(xiàn)和診斷載脂蛋白異常，研究載脂蛋白在脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有重要意義。ApoB是LDL的主要蛋白質(zhì)，因此，血清中ApoB 主要代表LDL水平，與LDLC成顯著正相關(guān)。高ApoB是冠心病的危險(xiǎn)因素，也是較好的動(dòng)脈粥樣硬化標(biāo)志物。銀屑病患者ApoB也可升高。檢驗(yàn)原理:當(dāng)樣品與緩沖液和抗體混合，樣品中的載脂蛋白B與試劑中的抗人載脂蛋白B抗體特異性結(jié)合,形成濁度增加，通過測(cè)定濁

48、度的透光率判斷樣品中的載脂蛋白B含量。 3.2.7 脂蛋白a LP（a）：是含有獨(dú)自的載脂蛋白(a)的脂蛋白，脂質(zhì)組成結(jié)構(gòu)與LDL極其相似，密度位于低密度脂蛋白和高密度脂蛋白之間。1963年Berg發(fā)現(xiàn)Lp(a)時(shí)，因其病理意義不明，未被引起重視。1987年Mclean發(fā)現(xiàn)Lp(a)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與纖溶酶原部分相同，作為動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立因子越來越受到人們的重視。LP（a）水平的差異是由遺傳因素決定的，受生活方式影響并不大。血清中高濃度的LP（a）可用為動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病危險(xiǎn)的一種有意義的指標(biāo)。流行病學(xué)研究表明血清膽固醇正常，而血清脂蛋白（a）水平超過30mg/dl的人患冠心病的危險(xiǎn)增加2倍。如

49、果LDL和LP（a）水平同時(shí)升高其危險(xiǎn)性增加8倍。檢驗(yàn)原理：當(dāng)樣品與緩沖液和抗體混合，樣品中的脂蛋白（a）與試劑中的抗人脂蛋白（a）抗體特異性結(jié)合, 生成不溶性的沉淀物，引起濁度的增加，通過測(cè)定濁度的透光率判斷樣品中的脂蛋白（a）含量。3.3腎功能測(cè)定項(xiàng)目3.3.1 尿素 UREA：血清尿素升高：正常生理狀況下的高蛋白飲食。病理狀況下的原因之一是由于尿素排泄減少，如腎功能損害引起的腎小球?yàn)V過率降低，結(jié)石、腫瘤、前列腺肥大引起的尿道或輸尿管阻塞使尿量排出減少，低血壓或腎血流減少所致的尿形成減少。病理狀況下另一原因是蛋白分解代謝的增加、可見于長期發(fā)燒、腎上腺皮質(zhì)類固醇分泌的增加、使用皮質(zhì)激素類藥物

50、、胃或十二指腸出血。檢驗(yàn)原理:本法為測(cè)定尿素的酶學(xué)方法，反應(yīng)式如下： 尿素+ 2H2O 脲酶 2NH4+ + CO2-酮戊二酸 + NH4+ + NADH GLDH L- 谷氨酸+NAD+H2O 尿素和水在脲酶作用下生成氨和二氧化碳。產(chǎn)生的氨與-酮戊二酸鹽和NADH在谷氨酸脫氫酸（GLDH）催化下形成谷氨酸鹽和NAD+。其吸光度降低速率與尿素濃度成比例。3.3.2 尿酸UA（雙試劑）: 血清中尿酸增高常見于痛風(fēng)。另外核酸代謝增加的白血病多發(fā)性骨髓瘤、紅細(xì)胞增多癥等患者血清中尿酸亦常見增高；其次腎功能降低、鉛中毒、酒精中毒、腫瘤化療、放射治療后和妊娠毒血癥等均可使血清尿酸增高。血清尿酸的減少可見

51、于服用可的松、雙香豆素、丙磺舒等藥物以后。檢驗(yàn)原理:尿酸酶水解尿酸，產(chǎn)生的H2O2在過氧化物酶的催化下與3，5一二氯-2-羥基苯磺酸(DCHBS)和4-氨基安替比林(4-AAP)反應(yīng)，形成一種紫紅色醌亞胺。3.3.3 肌酐CRE（苦味酸）: 肌肉中的磷酸肌酸變成肌酸后，再經(jīng)過脫水生成肌酐, 肌酐與肌肉組織有密切的關(guān)系，肌酐的生成量可作為判斷肌肉疾病的有用指標(biāo)。另外，尿中肌酐的排泄量與肌肉總量成一定比例，不受飲食和尿量的影響，經(jīng)腎小球?yàn)V過后也不被腎小管重吸收，因此可用來檢測(cè)腎小球功能。腎臟疾病初期，一般血清肌酐濃度不升高。直至腎臟實(shí)質(zhì)性損害，如腎功能不全、尿毒癥和腎功能障礙引起血清肌酐濃度升高。

52、檢驗(yàn)原理:肌酐在堿性溶液中與苦味酸形成一種桔紅色絡(luò)合物。該絡(luò)合物的吸光度與樣品中肌酐濃度成正比。3.3.4 肌酐CRE（酶法）: 肌肉中的磷酸肌酸變成肌酸后，再經(jīng)過脫水生成肌酐,肌酐與肌肉組織有密切的關(guān)系，肌酐的生成量可作為判斷肌肉疾病的有用指標(biāo)。另外，尿中肌酐的排泄量與肌肉總量成一定比例，不受飲食和尿量的影響，經(jīng)腎小球?yàn)V過后也不被腎小管重吸收，因此可用來檢測(cè)腎小球功能。腎臟疾病初期，一般血清肌酐濃度不升高。直至腎臟實(shí)質(zhì)性損害，如腎功能不全、尿毒癥和腎功能障礙才引起血清肌酐濃度升高。檢驗(yàn)原理:反應(yīng)分兩步，在第一步，存在于標(biāo)本中的內(nèi)源性肌酸被分解生成水，不對(duì)本反應(yīng)產(chǎn)生影響。樣本中的肌酐在各種酶的

53、作用下生成紅色的醌色素，根據(jù)比色法測(cè)定醌色素的量，從而計(jì)算出肌酐的含量。 3.3.5 胱抑素C CYS-C: 腎小球?yàn)V過率（GFR）是檢測(cè)腎功能的最直接的指標(biāo)，在腎病早期就出現(xiàn)GFR的降低。準(zhǔn)確的腎小球?yàn)V過率的檢測(cè)能夠反映腎病的進(jìn)程，指導(dǎo)用藥從而避免腎臟功能的損傷。目前，常用肌酐清除率的方法來評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過率。血清中的肌酐中度特異，但是靈敏度低，只有當(dāng)GFR下降到50或更低時(shí)才有顯著升高。并且肌酐的升高受肌肉重量，體表面積，飲食攝入影響很大，也就是說和年齡，性別，身高都會(huì)影響肌酐量。胱抑素C（Cys-C）是一種小分子量的胱氨酸蛋白酶抑制劑。所有的有核細(xì)胞都能穩(wěn)定地產(chǎn)生Cys-C。Cys-C幾乎

54、完全被腎小球?yàn)V過，然后由腎小管重吸收，并且腎小管不分泌，也不通過腎小管排泄。Cys-C不受炎癥反應(yīng)、性別、肌肉以及年齡變化的影響。所以Cys-C是一個(gè)非常穩(wěn)定的反映腎小球?yàn)V過率的指標(biāo)檢驗(yàn)原理:樣本中的Cys-C與超敏化的抗Cys-C抗體膠乳顆粒試劑反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，在570nm波長處檢測(cè)其吸光度的變化，其變化程度與樣本中的Cys-C含量成正比。3.3.6 2-微球蛋白 2-MG: 2微球蛋白是一種幾乎在所有體細(xì)胞的細(xì)胞膜上部都存在的低分子量（11000道爾頓）蛋白質(zhì)，游離的2-微球蛋白是細(xì)胞裂解的產(chǎn)物。它是由腎小球分泌的，然后被腎小管細(xì)胞吸收和分解。腎小管功能異常時(shí)，血清中BMG、尿液中的

55、BMG濃度升高。細(xì)胞破碎后，濃度顯著升高，如在急性白血病中血清中的BMG濃度升高。3.3.7 尿微量白蛋白 MALB: 微量白蛋白尿是糖尿病腎病最早的臨床表現(xiàn)，是心血管發(fā)病率和死亡顯著增高的一個(gè)標(biāo)志。早期檢測(cè)微量白蛋白尿能夠使個(gè)體化的積極治療及早實(shí)施。新近發(fā)表的幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)已經(jīng)顯示早期發(fā)現(xiàn)微量白蛋白尿并盡早治療，可以預(yù)防或延緩糖尿病腎病進(jìn)展至終末期腎病的效果。檢驗(yàn)原理：白蛋白與試劑中抗人白蛋白抗體在緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過剩時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與校準(zhǔn)品對(duì)照，即可算出未知白蛋白的含量。3.3.9 視黃醇結(jié)合蛋白

56、 RBP: 視黃醇結(jié)合蛋白是反映機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)的一個(gè)靈敏指標(biāo)，特別是蛋白質(zhì)-熱卡營養(yǎng)不良。內(nèi)臟的蛋白質(zhì)是作為蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，而根據(jù)營養(yǎng)狀態(tài)視黃醇結(jié)合蛋白R(shí)BP能做出更快反應(yīng)。RBP主要在肝臟合成，因此血清中RBP的降低和增加和肝臟疾病有關(guān)，并受肝臟疾病的出現(xiàn)和嚴(yán)重程度的影響。在肝病，肝硬化及急、慢性肝炎的血清RBP水平均顯著降低。RBP可作為腎小管損傷的早期診斷指標(biāo)。視黃醇結(jié)合蛋白R(shí)BP在尿中穩(wěn)定性強(qiáng)，不易分解，不受pH和血壓干擾。在腎近曲小管損傷時(shí)，其尿排量明顯增加，故尿中RBP排量增加可作為腎近曲小管損傷的標(biāo)志物。當(dāng)腎臟濾過功能降低時(shí)，血中RBP因貯積而顯示濃度升高。血

57、液或尿液中的RBP濃度可以作為一種理想的腎功能指標(biāo)應(yīng)用于臨床。檢驗(yàn)原理: 以膠乳增強(qiáng)免疫比濁法為測(cè)定原理，樣品中的視黃醇結(jié)合蛋白和被乳狀液粒吸附的抗體引起抗原抗體反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，在570nm波長處檢測(cè)其濁度的變化，其變化程度與樣本中的視黃醇結(jié)合蛋白成正比。3.4心肌類測(cè)定項(xiàng)目3.4.1 肌酸激酶CK: 各種類型進(jìn)行性肌萎縮時(shí)，血清CK活性均可升高。神經(jīng)因素引起的肌萎縮如脊髓灰白質(zhì)炎時(shí)活性正常，皮肌炎時(shí)CK活性可有輕度或中度增高。急性心肌梗塞后3-8小時(shí)就開始增高，可高達(dá)正常上限的10-12 倍，病毒性心肌炎時(shí)也明顯升高，對(duì)診斷及預(yù)后有參考價(jià)值。檢驗(yàn)原理:磷酸肌酸+ADP CK 肌酸+ATPATP+葡萄糖 HK 6 - 磷酸葡萄糖+ADP葡萄糖-6-磷酸葡萄糖+NADP+ G-6-P-DH 6-磷酸葡萄糖酸 +NADPH+H+G-6-P-DH：6 - 磷酸葡萄糖脫氫