ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng)

1、 ELISA基礎(chǔ)知識和注意事項(xiàng)基礎(chǔ)知識和注意事項(xiàng) ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 類容類容 ELISA的基本原理和相關(guān)概念 特別說說捕獲法 ELISA結(jié)果的影響因素 ELISA結(jié)果的處理 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) ELISA的基本原理和相關(guān)概念 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) ELISA的分類 測抗原：競爭法（也可用于測抗體）、雙 抗體夾心法。 測抗體：間接法、捕獲法、雙抗原夾心法 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 競爭法elisa 競爭法 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 包被特異性抗體包被特異性抗體 酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原 檢測抗原檢測抗原 孵

2、育孵育洗滌后顯色洗滌后顯色加樣加樣 A B 競爭法競爭法ELISAELISA 3.顯色顯色 3.孵育孵育1.加樣加樣 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 雙抗體夾心法 檢測測抗原要有至少具有2個(gè)抗原決定簇 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 包被特異性抗體包被特異性抗體 雙抗體夾心法雙抗體夾心法ELISAELISA 檢測抗原檢測抗原 1.加樣加樣2.孵育孵育3.洗滌洗滌 4.加入二抗加入二抗 5.孵育孵育6.顯色顯色 酶標(biāo)特異性抗體酶標(biāo)特異性抗體 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 雙抗原夾心法 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 3.洗滌洗滌 1.加樣加樣2.孵育孵育 6.顯色顯色5.孵育孵育 4.加入酶標(biāo)加入酶標(biāo)

3、 抗原抗原 雙抗原夾心法雙抗原夾心法ELISA ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 間接法 酶標(biāo)二抗是針對一類免疫球蛋白分子酶標(biāo)二抗是針對一類免疫球蛋白分子 只需要變換包被抗原，就可用一種酶標(biāo)二只需要變換包被抗原，就可用一種酶標(biāo)二 抗檢測各種與抗原結(jié)合的抗體抗檢測各種與抗原結(jié)合的抗體 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 1.加樣加樣 2.孵育孵育3.洗滌洗滌 4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.顯色顯色 間接法間接法ELISA ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 捕獲法 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 1.加樣加樣 2.孵育孵育3.洗滌洗滌 4.加入抗原加入抗原 孵育孵育 5.加入二抗加入二抗 孵育孵育 6.顯色

4、顯色 捕獲法捕獲法ELISA ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 區(qū)別理解 檢測抗原？抗體？ 包被什么？ 標(biāo)記什么？ ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 間接法和捕獲法比較 間接法：假陰性，假陽性 捕獲法：酶標(biāo)抗體的要求較高 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 間接法的假陽性 麻疹I(lǐng)gG 麻疹 抗原 麻疹I(lǐng)gM 抗人抗人酶標(biāo) IgM抗體 類風(fēng)濕因子 陽陽 性性 結(jié)結(jié) 果果 假假 陽陽 性性 結(jié)結(jié) 果果 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 間接法的假陰性 麻疹I(lǐng)gG 麻疹 抗原 麻疹I(lǐng)gM 酶標(biāo)抗人 IgM抗體 陽陽 性性 結(jié)結(jié) 果果 假假 陰陰 性性 結(jié)結(jié) 果果 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) ELISA的有關(guān)名詞概念

5、 質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配 制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可 以購置也可以自配。自己配制時(shí)要注意選用無脂血的 血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽性對照。若用稀釋 的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對結(jié)果的 影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對結(jié) 果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動(dòng)，不 可用于標(biāo)定儀器或評價(jià)方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血 清一般選取清一般選取CUTOFF值值2-3倍的質(zhì)控品。倍的質(zhì)控品。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 室內(nèi)質(zhì)控：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果 可靠性的一種質(zhì)量控制。 室間質(zhì)評：用于考核各個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可

6、靠 性的一種考核，可分為國家級和地方級的 室間質(zhì)評?？梢岳斫鉃?“各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì) 量評比”。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽 性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確 定是測定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定 的。許多試劑都會(huì)給出臨界值或臨界值的 計(jì)算方法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，陽性顯 色，陰性不顯色，本底就是整個(gè)陰性顯色 的情況。ELISA 抗HBcAb，陽性不顯色，陰 性顯色，本底就是整個(gè)陽性顯色的情況。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表 示檢測下限的能力。 相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性） 1

7、00% 測定方法及表示方法：靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì) 控血清、陽性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)、血清盤 （pannel）及臨床標(biāo)本陽性率。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 特異性特異性： 真陰性標(biāo)本的檢出能力。 相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性） 100% 測定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨 床標(biāo)本陰性率。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) Elisa結(jié)果的影響因素 試劑盒的選擇 標(biāo)本 加樣與稀釋 溫育 洗版 顯色 質(zhì)控 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 試劑盒的選擇 同行的試劑使用情況 上級部門對試劑實(shí)際使用的綜合評價(jià) 使用臨界值質(zhì)控血清進(jìn)行實(shí)際檢測比較,選 擇林敏度和準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)試劑盒 ELISA基礎(chǔ)知識和須知

8、事項(xiàng) 標(biāo)本 應(yīng)注意避免溶血 在5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4、超 過一周測定的需20保存 盡量避免反復(fù)凍融（少量分裝） ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 加樣和稀釋 加樣本的準(zhǔn)確性（個(gè)人因素和實(shí)驗(yàn)條件） 盡可能排除主關(guān)因素（盡可能用加樣槍， 避免直接使用滴瓶） 各種試劑盒標(biāo)本的稀釋使用，嚴(yán)格按照說 明是操作 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 溫育 溫度 水浴箱 發(fā)硬板應(yīng)漂浮于水上或水面應(yīng)高于反應(yīng)板 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 洗版 手洗 洗板機(jī) （微孔液體殘留45s） ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 顯色 通常是A、B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應(yīng) 立即丟棄 先加A后加B，顯色時(shí)間嚴(yán)格按說明書進(jìn)行 終止

9、后15內(nèi)比色 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 質(zhì)控 室內(nèi)質(zhì)控血清 即刻法 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) ELISA試劑的常見問題原因及其 解決 顯色淺，靈敏度低 假陽性多，本底高甚至花板 重復(fù)性不好 白板 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 顯色淺 靈敏度低 序號原因解決方法 1試劑盒運(yùn)輸時(shí)間過長，受高溫天氣影響，酶的活性 降低。 試劑運(yùn)輸過程加放足夠冰袋并盡可能縮短運(yùn)輸時(shí)間。 2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件 不正確。 試劑盒內(nèi)所有組分都應(yīng)當(dāng)在4冷藏，未使用完的板 條要密封保存。 3試劑盒使用時(shí)已超出有效期。過期試劑盒不可以使用。 4溫育時(shí)間不夠。嚴(yán)格按照說明書操作。 5恒溫箱溫度達(dá)不

10、到37。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在370.5。 盡量避免頻繁開關(guān)恒溫箱門。 經(jīng)常注意水箱中合適的水位。 在保證水不沒過酶標(biāo)板的前提下，使水位盡量高， 以保證反應(yīng)溫度。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 6加樣量不足；移液時(shí)抽吸排放過快，有氣泡、或吸頭內(nèi) 殘留液體過多。 經(jīng)常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜 過快，排放要完全。 7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說明書要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入 量。 8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。 9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來后，要先平衡至室 溫方可以使用。

11、10試劑開啟時(shí)間過長，污染。試劑開啟后應(yīng)該在盡可能短的時(shí)間內(nèi)用完，在保證正確 貯存的前提最長不要超過。 12不同批號試劑中混用不同批號試劑不能混用 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 假陽性多，本底高甚至花板 序號原因解決方法 1試劑過期過期試劑不能使用 2加樣時(shí)污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。 3加酶時(shí)污染對先加樣后加酶的操作，加酶時(shí)要注意吸頭不要接觸標(biāo) 本，造成污染。當(dāng)可能造成污染時(shí)，一定要更換 吸頭，切忌僥幸心理。 4恒溫箱溫度過高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在370.5。 5整個(gè)操作時(shí)間過長、造成反應(yīng)時(shí)間不同（第一孔與最后 一孔反應(yīng)時(shí)間相差很懸殊）。氣溫高時(shí)更明顯。 在盡可能短的時(shí)間

12、內(nèi)完成操作。 盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時(shí)）。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 6洗液稀釋倍數(shù)過高按照要求倍數(shù)稀釋洗液 7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù) 8洗板時(shí)浸泡時(shí)間不夠按要求操作，并適當(dāng)延長浸泡時(shí)間。 9手工洗板方式不正確洗板時(shí)，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗 液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時(shí) 間。 10洗板機(jī)調(diào)試不正確或者有故障 （可通過手工洗板判定） 手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。 11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。 12顯色液B液被污染 13顯色完后沒有終止反應(yīng)。顯色完立即終止反應(yīng)。 ELISA基礎(chǔ)知識和須知事項(xiàng) 重復(fù)性不好 1加樣量多少不一，操作時(shí)間長短不一。重復(fù)同一樣品時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間相同；同時(shí) 注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后應(yīng)該將酶標(biāo)板 放置在微量振蕩器上，充分混合；標(biāo)本保 證一致、無污染；盡可能由同一名操作人 員操作。 盡可能模擬相同的反應(yīng)條件。 2加入標(biāo)本后沒有混勻。 3重復(fù)實(shí)驗(yàn)的操作人員不同，操作習(xí)慣不同。 4反應(yīng)時(shí)間、溫度等不相同。 5標(biāo)本不同（被混淆或者處理不同） 6精密度測定方法不標(biāo)準(zhǔn)采用正確的方法操作 ELISA基