PCR常見問題分析與對策.doc

1、PCR引物設計的11條黃金法則1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內設計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長度一般在1530堿基之間。引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。3.引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72。GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

2、另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。4.引物3端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T

3、時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。6. 堿基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基

4、的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話，應盡量使其G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。8. 引物5 端和中間G值應該相對較高，而3 端G值較低。G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用5 端和中間G值相對較高，而3 端G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯配

5、位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA 聚合反應。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進行分析）9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。引物的5 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3 端開始的，不能進行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級結構可能。10. 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區(qū)域。用有關軟件（

6、比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G）小于58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。11. 引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，

7、盡量去滿足條件。做Real Time時,用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設計的要求：1)避免重復堿基，尤其是G.2)Tm=58-60度。3）GC=30-80%.4)3端最后5個堿基內不能有多于2個的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6)PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的

8、能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。PCR常見問題分析與對策PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質量及，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸

9、提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應

10、和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 物

11、理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。 引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR

12、產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。 需重新設計引物。 靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴增

13、帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性，65左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶

14、量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR/RT-PCR疑難問題解答 1.問題：RT-PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物。 可能原因： 1）RNA被降解 建議解決方法： 在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA使用良好的無污染技術分離RNA； 在將組織從動物體取出后立刻處理在100甲酰胺中儲存RNA； 如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結合的RNase。而且

15、，在0.8mMDTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 2）RNA中包含逆轉錄抑制劑 建議解決方法： 通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70（v/v）乙醇對RNA沉淀進行清洗?？梢约尤胩窃?.25g到0.4g/l）以幫助小量樣品RNA的恢復。 逆轉錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。 將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反應比較產量以檢驗抑制劑。 3）多糖同RNA共沉淀 建議解決方法： 使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 4）用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火 建議解決方法： 確定退火溫度適合您的引物。對于隨機六聚體，建議在反應溫

16、度保溫之前先在25保溫10分鐘。 對于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機六聚體. 確定GSP是反義序列。 5）起始RNA量不夠 建議解決方法： 增加RNA量。 對于50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1g到0.5g乙酰BSA。 6）RNA模板二級結構太多 建議解決方法： 將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火. 提高逆轉錄反應溫度，對SuperScript可以到50，對ThermoScript可以到65。 注意：不要在60時使用oligo(dT)引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP。對于1kb的RT-PCR產物，保持反

17、應溫度65。 注意：不要在高于37時使用M-MLV。 如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應中使用隨機引物。 7）引物或模板對殘余的RNA模板敏感 建議解決方法： 在PCR前用RNaseH處理。 8）靶序列在分析的組織中不表達 建議解決方法： 嘗試其他靶序列或組織 9）PCR沒有起作用 建議解決方法： 對兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉錄反應產物。 2.問題：PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物。 可能原因： 1）PCR引物設計較差 建議解決方法： 避免在引物3端含有互補序列。避免可以形成內部發(fā)卡結構的序列。設計Tm類似的引物。 2）DNA含有

18、抑制劑 建議解決方法： 諸如DMSO，SDS和甲酰胺之類的試劑會抑制TaqDNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA。 3）富含GC的模板 建議解決方法： 對于GC含量50的模板，使用PCRxEnhancerSolution。 4）模板濃度太低 建議解決方法： 使用104拷貝的靶序列，以在25到30個循環(huán)中獲得信號。 5）鎂離子濃度太低 建議解決方法： 從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反應，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。注意：對實時定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。 6）退火溫度太高 建議解決方法： 使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設定為低于T

19、m5。因為這些公式只是估算Tm值，所有真正的退火溫度實際會高些或低些。 7引物濃度太低 建議解決方法： 最佳引物濃度介于0.1M到0.5M之間。為了精確確定引物濃度，在260nm測量光密度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計算濃度。 3.問題：RT-PCR特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。 可能原因： 1物和模板非特異性退火 建議解決方法： 在第一鏈合成中使用GSP，而不是隨機引物或oligo(dT)。 試用允許高溫cDNA合成的GSP。 2GSP設計較差 建議解決方法： 遵循用于擴增引物設計的同樣原則 3RNA中沾染了基因組DNA 建議解決方法： 使用擴增級DNase處理RNA。使用沒有

20、逆轉錄的對照反應檢測DNA污染。 4.問題：PCR特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。 可能原因： 1形成引物二聚體 建議解決方法： 設計在3端沒有互補序列的引物。 2引物和模板非特異性退火 建議解決方法： 以2到5間隔增加退火溫度，減少退火時間。 在開始幾個循環(huán)使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。 使用PlatinumTaqDNA進行自動熱啟動PCR。 避免在引物3端含有2到3個dG或dC。 3鎂離子濃度太高 建議解決方法： 對于每一個模板和引物組合優(yōu)化鎂離子濃度。 4因為擴增復雜模板導致引物錯誤起始 建議解決方法： 使用巢式PCR或遞減PCR。 5沾染外源DNA 建議解決方

21、法： 使用抗氣霧劑的tip和UDG。 6因為二級結構導致引物結合位點無法接近 建議解決方法： 對于GC含量50的模板，使用（1-3）PCRxEnhancerSolution。 5.問題：PCR忠實性：PCR在產物序列中引入了錯誤 可能原因： 1聚合酶忠實性低 建議解決方法： 使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如PlatinumPfxDNA聚合酶。 2循環(huán)數(shù)太多 建議解決方法： 降低循環(huán)數(shù)。 3四種dNTP的濃度不同 建議解決方法： 制備新的dNTP混合物，保證四種核苷濃度相同。使用預混合物如何選擇適合的Tag酶?隨著分子生物學研究發(fā)展的不斷廣泛和深入，PCR已成為一門相當成熟的常規(guī)技術，而熱聚合

22、酶（即Taq酶）的合理選擇是PCR成敗與否的一個關鍵因素。目前市面上有多種Taq酶，能夠滿足多方面的實驗需要。那么，如何選擇最合適的Taq酶？根據(jù)用戶經常考慮的指標，如特異性、保真性、耐熱性、擴增速率、擴增片段長度、能否進行復雜模板擴增以及優(yōu)化條件難易等等，我們在這兒將主要的Taq酶歸歸類，其性質、用途也就一目了然了。 高特異性Taq酶 高度特異性地擴增所需的片段是PCR最基本的要求，影響PCR特異性的因素很多，包括模板、引物性質及質量、反應條件的控制等等，而高特異性Taq酶的出現(xiàn)大大減少了摸條件這一繁瑣的實驗過程，也為PCR產物快速有效的純化（PCR產物直接純化）打下了基礎。這類酶最典型的代

23、表是熱啟動Taq酶。大家都知道，在PCR第一個循環(huán)變性之前，有一個升溫的過程，引物和模板會有一些非特異性配對，如果這時Taq酶發(fā)揮活性，就很容易產生非特異性擴增，由于循環(huán)初期模板量非常少，產生的非特異性條帶經過后面的指數(shù)擴增，就會嚴重干擾目的片段的擴增，甚至導致特異性條帶不能擴出。而熱啟動Taq酶是必需經過高溫才能激活的酶，因此在初始循環(huán)的變性之前它沒有活性，不會產生非特異性擴增，這就大大提高了PCR擴增的特異性。第一代熱啟動Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修飾，比如用抗體抑制，蠟封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些產品，由于抗體、蠟等異物的摻入，對實驗造

24、成一定的影響，也給試驗者帶來一些不便。新一代的熱啟動Taq酶是通過內部改造的重組酶，真正實現(xiàn)便利的熱啟動，代表產品如QIAGEN公司的HotStar系列，無需別的輔助抑制物，也不用擔心抑制不穩(wěn)定，使用起來方便、高效。此外，由于幾乎所有的Taq酶產品都帶有相應的反應緩沖液，緩沖液的品質也對保證Taq酶特異性擴增起著不可忽視的作用，一般的緩沖液中調節(jié)H鍵作用的鹽只有KCl，QIAGEN公司的緩沖體系通過KCl、(NH4)SO4鹽離子體系的平衡調節(jié)也提高了酶作用的特異性。 此外，熱啟動的Taq酶也是實現(xiàn)一步法RT-PCR的基礎。如QIAGEN公司的OneStepRT-PCR試劑盒，在RT反應較低溫度

25、下，Taq酶沒有活性，逆轉錄酶發(fā)揮活性；RT反應結束，高溫滅活逆轉錄酶的同時，激活Taq酶，進行PCR反應。另一家公司Epicentre有一種MasterAmpTMTthDNA聚合酶，本身就具有逆轉錄酶活性，也可用作RT-PCR。 高保真Taq酶 下游應用為基因篩選、測序、突變檢測，分子診斷等等的用戶，往往對PCR保真性要求很高，保真性的一個通用標準是錯配率，錯配率越低保真性越好。普通Taq酶的錯配率在2-5X10-5堿基/循環(huán)數(shù)，而高保真Taq酶錯配率可達10-6數(shù)量級，大大降低了出錯的可能。其原理主要是因為高保真Taq酶具有3到5核酸外切酶（Proofreading）的活性，擴增途中如果產生了錯配的堿基，它可以將其切掉，從而保證了擴增的準確性。需要提醒用戶的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往擴增效率低一些，有的還容易降解引物，且產物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。目前市面上主要有兩類產品，一類是混合型的高保真酶，將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶（用于提高擴增效率）混合起來，錯配率在8-9X10-6堿基/循環(huán)數(shù)。Clontech、LTI等公司都有此類產品。如果要求更高的保真度，就要選擇單一型的高保真酶，如Stratagene的Pfu，NEB公司的VentDN