基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定

1、第四章 基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定第一節(jié) 轉(zhuǎn)化基因片段在體外只是一段核酸分子，是化學(xué)物質(zhì)，無法表現(xiàn)出遺傳物質(zhì)的生命活性。只有當(dāng)其存在于活細(xì)胞后，生命的特征才能充分展示出來。在分子克隆實踐中，在體外操作的核酸分子只有進入細(xì)胞以后才能達到克隆的目的。一、 重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞1. 重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化（transformation）重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程。轉(zhuǎn)化不僅適合于大腸桿菌受體細(xì)胞，而且適合于枯草桿菌和藍藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受體細(xì)胞。（1）CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染A、制備感受態(tài)細(xì)胞

2、受體細(xì)胞的細(xì)菌，經(jīng)一定濃度的冰冷的 CaCl2（50100 mmolL）溶液處理后變成。所謂感受態(tài)細(xì)胞，處在感受態(tài)狀態(tài)的菌體有攝取各種外源 DNA的能力。轉(zhuǎn)化：感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程；轉(zhuǎn)染：感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達噬菌體DNA分子的生命過程；好的感受態(tài)細(xì)胞，每微克的超螺旋質(zhì)粒DNA可得5107個轉(zhuǎn)化體。B、細(xì)胞轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）的具體操作過程： 將處于對數(shù)期的新鮮培養(yǎng)物于04000轉(zhuǎn)/分離心10分，回收細(xì)菌細(xì)胞； 將細(xì)胞用0的0.1mol/L CaCl2低滲溶液處理30分鐘，離心回收細(xì)胞，再用適量 0的0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞，以誘導(dǎo)感受態(tài)產(chǎn)生

3、。 加入適量DNA，于42 熱處理混合物90秒，使DNA分子被細(xì)胞吸收； 將混合物快速轉(zhuǎn)到冰浴中，冷卻12分，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，在37 培養(yǎng)45分，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因； 通過選擇培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化體。 如果用抗菌素篩選轉(zhuǎn)化體，作為對照的受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長。（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進行電穿孔（electroporation），形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收。 受體細(xì)胞的準(zhǔn)備：當(dāng)細(xì)菌生長到對數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細(xì)胞懸浮液的離子強度，并用10%甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3

4、1010個ml，分裝，在干冰上速凍后置于-70貯存。每小份細(xì)胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達6個月以上。（3）三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌原理：是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用（mobilization）而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式。首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細(xì)菌菌株，即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，故稱三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。尤其適用于那些難以采用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或電穿孔法等進行重組質(zhì)粒DNA

5、分子直接轉(zhuǎn)化的受體菌。（4）轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率有兩種表示方式：A：以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示B：以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)的比率表示。以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)為基數(shù)來計算轉(zhuǎn)化率A：通過菌液OD值測定或細(xì)菌計數(shù)，計算出用于制備感受態(tài)細(xì)胞的受體菌總數(shù)。B：計算轉(zhuǎn)化子與受體菌的比率。用于制備感受體細(xì)胞的菌液每毫升有5107個菌體，則4 ml菌液有2108個菌體，由此菌液制備成感受態(tài)細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)化處理，獲得1000個轉(zhuǎn)化子，則轉(zhuǎn)化率是103（2108）510-6。其含義是每個受體菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化的概率是510-6，

6、或者說，要得到一個轉(zhuǎn)化子，需要2105個受體菌細(xì)胞。每單位質(zhì)量的DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)來表示單位通常是轉(zhuǎn)化子數(shù)每g DNA分子，如每g重組DNA分子獲得106個轉(zhuǎn)化子，則轉(zhuǎn)化率為106個/ g DNA分子。影響轉(zhuǎn)化率的因素：分子量載體類型及構(gòu)型重組DNA分子的濃度與純度受體細(xì)胞2. 重組噬菌體DNA子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）是指通過噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。DNA與外殼蛋白結(jié)合成噬菌體顆粒，才有轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主大腸桿菌的能力。因此重組的DNA必須進行體外包裝。所謂體外包裝，是指在體外模擬噬菌體DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特

7、殊的包裝反應(yīng)過程，將重組噬菌體DNA分子包裴為成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù)。 在實驗方法上，體外包裝包括兩個方面：（1）包裝抽提物的制備；（2）體外包裝過程。二、重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞1. 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法是目前研究最多、機制最清楚、技術(shù)方法最成熟的基因轉(zhuǎn)化途徑。迄今為止約8096的轉(zhuǎn)基因植株都是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得的。農(nóng)桿菌是一類土壤習(xí)居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，而對絕大多數(shù)單子葉植物無侵染能力。植物受傷后，傷口處細(xì)胞分泌大量的酚類化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（OHAs），它們是農(nóng)桿菌識別敏感植物

8、的信號分子。具有趨化性的農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，并將其Ti質(zhì)粒上的TDNA的轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部。根據(jù)這一性質(zhì)，將待轉(zhuǎn)移的目的基因組入Ti質(zhì)粒載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進人植物細(xì)胞，與染色體DNA整合，得以穩(wěn)定維持或表達。步驟：（1）外植體選擇與預(yù)培養(yǎng)；（2）接種活化的農(nóng)桿菌工程菌；（3）共培養(yǎng)；（4）選擇培養(yǎng)；（5）轉(zhuǎn)化植株再生2. 高壓電穿孔法利用脈沖電場將DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法叫做高壓電穿孔法。利用這種方法，可以將DNA導(dǎo)入動、植物及細(xì)菌細(xì)胞。具有簡單方便、對細(xì)胞毒性低以及轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點。（1）標(biāo)準(zhǔn)的操作程序?qū)⒏邼舛鹊暮锌寺』虻馁|(zhì)粒DNA加到原生質(zhì)體的懸浮液中，然后置于200600Vcm的電場下

9、進行電脈沖刺激。經(jīng)過如此電穿孔處理的原生質(zhì)體在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)12星期之后，選擇已經(jīng)捕獲了轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)胞，作進一步的繼續(xù)培養(yǎng)，以便獲得再生植株。應(yīng)用這種方法已成功地轉(zhuǎn)化了玉米和水稻的原生質(zhì)體，其轉(zhuǎn)化效率在0110之間。（2）影響電穿孔導(dǎo)入DNA效率的因素： 外加電場的強度：250750 Vcm較宜； 電脈沖的時間：20100ms；工作溫度：對不同類型細(xì)胞所要求的條件不同，可以在0至室溫（25）之間進行選擇； DNA的構(gòu)象和濃度：線性 DNA比環(huán)狀 DNA要好，濃度控制在1 40 gmL。工作緩沖液的離子成分：也對其DNA導(dǎo)入效率發(fā)生作用，一般用鹽溶液懸浮細(xì)胞要比用非離子溶液更易DNA的導(dǎo)入。

10、3. 聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法這種方法常用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及其他真菌細(xì)胞。活躍生長的細(xì)胞或菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶處理變成球形體后，在適當(dāng)濃度的聚乙二醇6000（PEG6000）的介導(dǎo)下，將外源DNA轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中。4. 磷酸鈣或DEAE一葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染這是將外源基因?qū)氩溉轭惣?xì)胞中進行瞬時表達的常規(guī)方法。將被轉(zhuǎn)染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后通過內(nèi)吞作用進入受體細(xì)胞。對于DEAE-葡聚糖作用的機理尚不清楚，可能是其與DNA結(jié)合從而抑制核酸酶的作用或與細(xì)胞結(jié)合從而促進DNA的內(nèi)吞作用。5. 原生質(zhì)體融合通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合。經(jīng)過細(xì)胞膜

11、融合，細(xì)菌內(nèi)容物轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。6. 脂質(zhì)體法將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將基因?qū)搿Ｖ|(zhì)體是由磷脂組成的膜狀結(jié)構(gòu)，用它包裝外源DNA分子，然后與植物原生質(zhì)體共保溫。于是脂質(zhì)體與原生質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)之間發(fā)生相互作用，爾后通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用而將外源DNA高效地納入植物的原生質(zhì)體。這種方法具有多方面的優(yōu)點，包括可保護DNA在導(dǎo)入細(xì)胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了對細(xì)胞的毒性效應(yīng)，適用的植物種類廣泛，重復(fù)性高，包裝在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可穩(wěn)定地貯藏等。用此法轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體的效率可達14，并得到了轉(zhuǎn)基因的再生植株。7. 顯微注射法借助顯微鏡將外源D

12、NA直接注射到受體細(xì)胞的方法。適用于此種方法的植物樣品包括原生質(zhì)體、游離的細(xì)胞，以及諸如愈傷組織、分生組織和胚胎組織等多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在顯微注射的實際操作中，受體細(xì)胞或組織是被固定在褐藻酸鈉或瓊脂糖等特定載體上，然后通過顯微操作器，將轉(zhuǎn)化的外源DNA直接注射到受體細(xì)胞核中去。由于一些重要的禾本科糧食作物均為單子葉的，在原生質(zhì)體再生和Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方面都存在著相當(dāng)?shù)睦щy，所以對此類植物來說，DNA的直接注射法具有特別重要的實用價值。本法的一個突出優(yōu)點是轉(zhuǎn)化頻率高，可達60以上，但操作困難，需要經(jīng)過特殊訓(xùn)練的專門技術(shù)人員才能迸行。8. 顆粒轟擊（particle bombardment）技術(shù)顆粒轟擊技

13、術(shù)是將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或組織中去的通用方法，也就是平常所說的用基因槍實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的方法。將DNA包被在金或鎢的微粒中，然后用基因槍將DNA包被的顆粒直接轉(zhuǎn)移到原位組織、細(xì)胞乃至細(xì)胞器中去。這一技術(shù)目前廣泛用于植物基因工程、基因治療以及基因（DNA）免疫等研究。生物彈擊法的操作對象可以是完整的細(xì)胞或組織，突破了基因轉(zhuǎn)移的物種界限，也不必制備原生質(zhì)體，實驗步驟比較簡單易行，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為研究植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物的最有效的手段之一。第二節(jié) 基因重組 將目的基因插入載體的過程，即基因重組（gene recombination)，其基本過程包括：首先在目的目的基因和載體兩端造成切

14、口，然后依賴于雙鏈DNA粘性末端單鏈序列的互補結(jié)合和DNA連接酶將切口補上。這一步的實質(zhì)就是將兩種DNA在體外進行酶促連接，最終獲得一個重組子。一般連接反應(yīng)中外源DNA與載體的比例采用3：1，4：1或5：1。不同來源、性質(zhì)的外源片段采用的連接方式不同。常采用的連接方法有：粘末端連接、平端連接法、人工接頭法和同聚物接尾法。1、 粘末端連接 1. 全同源粘性末端連接 如果目的序列與載體兩端具有相同的限制內(nèi)切酶位點，則同一限制性核酸內(nèi)切酶酶切后在目的基因與載體兩端產(chǎn)生完全相同的粘性末端，在降低溫度退火時，能重新互補結(jié)合，在DNA連接酶催化下，目的序列與載體DNA連接，實現(xiàn)基因重組，稱為全同源粘性末端

15、連接。另外，不同的限制性內(nèi)切酶，如果產(chǎn)生的粘性末端相同，也同樣用此方法連接。該連接方法的優(yōu)缺點為：優(yōu)點：該方法是最方便的克隆方法，其連接效率高，一般采用低濃度酶在低于16度，高濃度ATP的情況下進行連接。缺點：容易出現(xiàn)載體自身環(huán)化、雙向插入（即目的基因以兩種方向插入載體和多拷貝插入的現(xiàn)象，從而在轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)高背景，使得篩選更為困難。雙向插入盡管對基因克隆無影響，卻會影響基因的表達。采用堿性磷酸酶事先對載體DNA進行去磷酸化處理，可有效避免載體自身環(huán)化現(xiàn)象；建立連接體系時，若將目的基因和載體DNA的摩爾數(shù)控制在23：1，則可有效減少多拷貝插入的問題。2. 定向克隆使目的基因按一定的方向插入載體的克

16、隆方案稱為定向克隆。最常用的定向克隆方案使用兩種限制性內(nèi)切酶切割載體和目的基因，從而在載體和目的基因兩端產(chǎn)生非同源互補的兩個粘性末端。定向克隆也可以通過在一端造成平端，另一端產(chǎn)生同源粘性末端實現(xiàn)年-平連接。定向克隆有效的限制了自身環(huán)化，并且實現(xiàn)了目的基因的定向插入，在基因克隆，尤其是表達某一基因時，極為有用。定向克隆的連接體系與相應(yīng)的粘性末端或平末端連接相同。（1） 平末端連接 T4DNA連接酶能催化限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的 DNA平末端進行連接。如果目的序列和載體上沒有相同的限制性內(nèi)切酶位點可供使用，用不同的限制性內(nèi)切酶切割后的粘性末端不能互補結(jié)合，則可用適當(dāng)?shù)拿笇⒄承阅┒俗優(yōu)槠侥┒?，再用T4

17、DNA連接酶。 平端連接比粘性末端連接效率低很多，但具有普適性，可適用于任何DNA片斷間的連接，是非常有用的基因克隆策略。另外，平端連接還常用于將人工合成的人工接頭連接到DNA末端，為進一步的克隆奠定基礎(chǔ)。 平端連接的主要缺點是連接效率低和存在多拷貝的插入，為此，在平端連接時。需采用高濃度的DNAA和連接酶，同時，在連接體系中加入低濃度的聚義二醇類物質(zhì)，也可有效提高連接效率。多拷貝插入的缺點?？赏ㄟ^控制插入片斷與載體的墨爾比解決。（2） 同聚物加尾同聚物加尾法就是利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體分子及外源雙鏈DNA片段的3末端各加上一段寡聚核苷酸，人工制成粘性末端。外源DNA片段和載體DNA分子要分別

18、加上不同的寡聚核苷酸。這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移酶的功能，它能夠催化脫氧核苷三磷酸逐個地加到DNA分子的3-OH末端，反應(yīng)中不需要模板的存在，4種dNTP中的任何一種都可以作為它的前體物。因此，當(dāng)反應(yīng)混合物中有一種dNTP時，就可以將核苷酸轉(zhuǎn)移到雙鏈DNA分子的突出或隱蔽的3-OH上，行程僅由一種核苷酸組成的尾巴。（3） 人工接頭連接法人工接頭連接法可分為兩種：一種為DNA連接法（linker）,另一種是DNA 接頭法(adapter)。1. DNA連接子法：DNA連接子是一段人工合成的具有平頭末端的雙鏈寡聚脫氧核苷酸片斷，長度一般為812個，其上有一個或數(shù)個限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點。由此

19、可以看出，DNA連接子的作用主要是在DNA末端天加一個限制性內(nèi)切酶識別位點，已產(chǎn)生粘性末端，已利用DNA片斷連接。主要使用于對平末段的改造和連接。2. DNA 接頭法: 盡管DNA人工連接子技術(shù)具有許多優(yōu)越性，但也存在一些弊端。如靶DNA內(nèi)部含有與連接子相同的識別序列時，在進行限制性核酸內(nèi)切酶切割之前，必須進行甲基化，以保護靶DNA不被破壞。這一系列步驟，使得DNA連接子技術(shù)操作較為煩瑣。DNA接頭是一段人工合成的一端或兩端為粘性末端的DNA序列，其中包含一個至多個限制性核酸內(nèi)切酶位點。接頭法克服了連接子僅適用于平端改造的缺點，可以平端與目的基因連接，也可以粘性末端與目的基因連接。（4） T-

20、A克隆 目前T-A克隆是用來直接克隆PCR產(chǎn)物的方便方法。其原理是：由于TaqDNA聚合酶在擴增目的基因的同時，可以不依賴于模板而在產(chǎn)生的兩端加上兩個游離的“A”，因而只要載體切口處人工加上游離的“T”，PCR產(chǎn)物即可與載體連接。T-A克隆載體已被廣泛應(yīng)用，并已成為商品化載體。 第三節(jié) 克隆的篩選與檢測在基因克隆、DNA文庫制備過程中，外源DNA與載體連接、載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝的載體中，往往有一部分是沒有外源DNA的，來自自我載體的空荷載體。如何從克隆的群體中排除假陽性的重組子，如何從成千萬的重組子中篩選出所需要的目的克隆，如何證明選擇的克隆含有所需要的目的基因？所以篩選是克隆目的基因的

21、重要步驟。篩選的目的就是挑選出含有目的序列的重組體。（一） 重組克隆的初步篩選克隆的篩選可以根據(jù)載體類型、受體細(xì)胞特性的變化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遺傳學(xué)檢測、物理特性檢測、分子雜交以及免疫學(xué)分析等。從初步篩選直到分子雜交，進一步到DNA測序和基于蛋白質(zhì)功能的分析，使得對克隆的檢測逐步深入、精確。1. 重組克隆的遺傳學(xué)檢測遺傳學(xué)檢測方法是重組子篩選過程中最初的檢測步驟。重組子的表征來源于載體所攜帶的標(biāo)記和重組子結(jié)構(gòu)特性。根據(jù)這兩類表征對重組子進行初步篩選。重組子的篩選含有兩層含義：（1）把攜帶有外源插入DNA片段的克隆挑選出來；（2）把攜帶有特定外源插入片段的重組子挑

22、選出來。(1) 抗藥性篩選這是利用載體DNA上組裝的抗藥性選擇標(biāo)記進行篩選的方法。常用的抗生素篩選劑:氨芐青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯霉素（chloramphenicol，Cm或Cmp）；卡那霉素（kanamycin，Kn或Kan）；四環(huán)素（tetracymic，Tc或Tet）；鏈霉素（strentomycin，Sm或Str）。重組質(zhì)粒DNA攜帶特定的抗藥性基因，轉(zhuǎn)化后賦予受體菌在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上正常生長，而不含此載體的DNA的受體菌不能存活。在質(zhì)粒載體中通常使用雙抗藥性標(biāo)記。例如：以質(zhì)粒載體pBR322為例，pBR322含有Tetr和Ampr兩個抗性基因。非重組的

23、野生型pBR322應(yīng)該表現(xiàn)出對Tet和Amp兩種抗生素的抗性活性。能在其中之一下生長的受體菌，說明其受體細(xì)胞已被轉(zhuǎn)化。（2） 插入失活篩選法檢測克隆載體攜帶有外源DNA的通常方法是插入失活。經(jīng)過抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包含所需要的重組子，也包含非重組子。為了進一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的抗藥性進行再次篩選。如：pBR322有四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因內(nèi)有BamH和Sal兩種限制酶位點，如果在這兩個位點中有外源DNA插入，都會導(dǎo)致Tetr基因失活。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞分別培養(yǎng)在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中，便可檢出轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。（3） 插入表

24、達篩選法與插入失活相反，插入表達法是外源目的基因插入特定載體后，能激活用于篩選操作的標(biāo)記基因的表達，由此進行轉(zhuǎn)化子的篩選。設(shè)計載體時，在篩選標(biāo)記基因前面連接一段具有抑制作用的負(fù)調(diào)控序列，插入外源DNA將使該負(fù)調(diào)控序列失活，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達。例如質(zhì)粒pTR262有一個負(fù)調(diào)控的cI基因，當(dāng)外源DNA片段插入cI基因中的BcII或Hind III位點，造成cI基因失活，位于cI基因下游的Tet基因（受cI基因控制）因解除阻遏而被表達，轉(zhuǎn)化后的重組體細(xì)胞，在含有四環(huán)素的平板中可形成菌落；而未被酶解的質(zhì)粒，自身環(huán)化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞及未轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞均不能形成菌落。（4） 環(huán)絲氨酸篩選這種篩選方法

25、只使用于抗四環(huán)素的基因插入失活的重組克隆篩選。如：四環(huán)素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（5） 顯色反應(yīng)篩選法上面所述的抗藥性等篩選法是用插入失活原理篩選重組DNA的方法。對菌落或噬菌斑平板進行影印復(fù)制，通過兩個平板的比較，才能辨別插入失活的表型特征。這給篩選工作帶來許多麻煩。顯色反應(yīng)可以在平板上或膜上直接顯示出重組克隆，不僅方便而且靈敏。如：在某些載體如M13噬菌體載體，pUC質(zhì)粒系列、pG

26、EM質(zhì)粒系列，它們的載體上都攜帶lac z基因一段序列，它編碼-半乳糖苷酶的肽，而宿主細(xì)胞為lac zM15的突變株。當(dāng)將上述載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在含有X-gal和IPTG平板中，由于基因內(nèi)互補作用，產(chǎn)生有生物活性的-半乳糖苷酶，把培養(yǎng)基中的無色X-gal分解成半乳糖和呈藍色的5-溴-4氯-靛藍，使菌落呈藍色。若將外源DNA插入到載體上lac z 序列中，使-肽基因失活，失去互補作用，將重組體轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在含有X-gal-IPTG平板上，菌落無色。利用-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)即可挑選出含有外源DNA重組體的陽性克隆2. 報告基因報告基因是某種生物的特定基因，裝配在載體上成為載體結(jié)構(gòu)的一部分，具有指示

27、的功能。與抗藥性基因相比較，報告基因作為篩選方法有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，在基因工程中的重要性要大得多。報告基因的表達產(chǎn)物易被檢測，受體細(xì)胞本身沒有這種內(nèi)源性產(chǎn)物。通過快速測定，“報告”外源基因是否已經(jīng)重組到載體中，判斷外源基因是否已成功地導(dǎo)入宿主細(xì)胞（器官或組織），或者在宿主細(xì)胞中是否表達。細(xì)胞內(nèi)報告基因產(chǎn)物常作為直接觀察載體活動的指示分子。把已知的調(diào)控元件連接到報告基因上，控制后者轉(zhuǎn)錄活性，對細(xì)胞中基因調(diào)控和表達的變化作出應(yīng)答反應(yīng)，從而直觀地“報告”細(xì)胞內(nèi)有關(guān)基因表達的信號傳遞。在基因工程實驗中，選用何種報告基因依賴于所使用的細(xì)胞和實驗的性質(zhì)，以及相應(yīng)檢測方法的掌握。選擇報告基因的準(zhǔn)則包括（

28、1）報告分子（報告基因的產(chǎn)物）應(yīng)不存在于原有宿主細(xì)胞中，或者易與內(nèi)源性基因產(chǎn)物相區(qū)別；（2）報告分子應(yīng)該有一個簡單、快速、靈敏及經(jīng)濟的分析方法來檢測；（3）啟動報告分子表達應(yīng)有很寬的信號范圍，以便分析啟動子活性的幅度變化；（4）報告基因的表達必須不改變受體細(xì)胞本來的生理活動?；蚬こ讨谐Ｓ玫膱蟾婊颍喝纾海?）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloraphenicol acetyltransferase，CAT）基因氯霉素可選擇性地與原核細(xì)胞核糖體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶的活性，從而阻斷肽鍵的形成并最終抑制細(xì)胞生長。 （2）-葡萄糖酸苷酶（-Glucuronidase，GUS）基因：一種水解酶，轉(zhuǎn)

29、化植物細(xì)胞所產(chǎn)生的-葡萄糖酸苷酶能夠催化某些特殊反應(yīng)的進行，通過熒光、分光光度和組織化學(xué)的方法對這些特殊反應(yīng)產(chǎn)物的檢測即可確定Gus報告基因的表達情況，以此區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子。 （3）熒光素酶（luciferase，LUC）基因一種源于螢火蟲的動物蛋白基因產(chǎn)物，能夠催化生物發(fā)光反應(yīng)。 3. 依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法（1）快速裂解菌落鑒定分子大小 根據(jù)有外源DNA片段插入的重組質(zhì)粒與載體DNA之間大小的差異來區(qū)分重組子和非重組子 （2）限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析法不僅可以進一步篩選鑒定重組子，而且能判斷外源DNA片段的插人方向及分子質(zhì)量大小等 將重組DNA分子限制酶切點圖譜與空載體圖譜

30、作對比，根據(jù)各種酶切所得DNA片段的大小及變化，即可推測有無外源DNA的插入，并確定出各插入片段的相對位置。 （3）利用PCR方法篩選確定重組子利用合適的引物，以從初選出來的陽性克隆中提取的質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)，通過對PCR產(chǎn)物的電泳分析來確定目的基因是否重組入載體中。（4）DNA序列測定 最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對重組體的DNA進行序列測定。4. 物理檢測法（1）凝膠電泳檢測法質(zhì)粒DNA的電泳遷移率是與其分子量大小成比例的。因此，那些帶有外源DNA插入序列的分子量較大的重組體DNA，在凝膠中的遷移速度，就要比不具有外源DNA插入序列的分子量較小的質(zhì)粒DNA來得緩慢些根據(jù)這種

31、差別，就可以容易地鑒定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量較大的重組質(zhì)粒。（2）R-環(huán)檢測法在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度（70%）的甲酰胺溶液中，即所謂的形成R-環(huán)的條件下，雙鏈的DNA-RNA分子要比雙鏈的DNA-DNA分子更為穩(wěn)定。因此，將RNA及DNA的混合物置于這種退火條件下，RNA便會同它的雙鏈DNA分子中的互補序列退火形成穩(wěn)定的DNA-RNA雜交分子，而使被取代的另一鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體，叫做R-環(huán)結(jié)構(gòu)。R-環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定，而且可以在電子顯微銳下觀察到。所以，應(yīng)用R-環(huán)檢測法，可以鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。（2） 目的克隆的鑒定經(jīng)過初步篩選獲得的陽性克隆，下一步必須對帶有目的序列的克隆做進一步篩選和鑒定。鑒定一般有幾種常用方法：（1）分子雜交；（2）免疫學(xué)檢測；（3）DNA測序；（4）蛋白質(zhì)活性篩選；（5）基因互補實驗。1. 分子雜交核酸分子雜交有多種方法：原位雜交、點雜交及Southern雜交等。原理：帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。如果彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，那么如此形成的雙鏈分子就叫做雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來源的DNA分子其親緣關(guān)系較為密切；反之，其