細(xì)胞工程復(fù)習(xí)題

1、細(xì)胞工程如何正確區(qū)分正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞？P491、 細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式。P572、 植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點。P75植物無性繁殖過程中器官發(fā)生的方式。P743、 植物組織培養(yǎng)的問題分析。P834、 人工授精動物與體外受精動物有什么異同？P96/105人工授精是動物受精方式的一種，比如魚類和兩棲類，精子和卵細(xì)胞的結(jié)合是在體外的 人工授精是人為的取出動物（或人）的精子和卵細(xì)胞，在體外人工環(huán)境下完成精子和卵細(xì)胞的結(jié)合 二者一個是自發(fā)的，一個是人為的 人工授精的應(yīng)用可以體現(xiàn)在多方面，比如近年來的試管嬰兒技術(shù)；另外，人工授精在動物轉(zhuǎn)基因上也有很多的的應(yīng)用。5、 如何看待試管嬰兒和體細(xì)胞克隆帶來的倫理學(xué)問題？與

2、技術(shù)問題相比，人們更為擔(dān)憂或恐慌的是克隆技術(shù)給傳統(tǒng)的倫理道德、社會觀念及價值體系帶來的巨大沖擊和挑戰(zhàn)。A、 克隆人的法律地位和倫理關(guān)系難以確定。克隆人的出現(xiàn)，使世代的秩序和個 人身份的確立出了問題。這種秩序和定位是構(gòu)成人和社會關(guān)系的基本部分（如果產(chǎn)生了混亂 ，人和社會的意義將發(fā)生偏移）。另外，當(dāng)克隆人在社會上與人相處時，由于其身份的特殊 性，可能在心理上產(chǎn)生孤獨感、恐懼感和絕望感，造成新的社會問題；B、打破“哺乳動物不能無性繁殖”的自然規(guī)律，挑戰(zhàn)傳統(tǒng)的性倫理關(guān)系。千百年來，人類一直遵循著有性繁殖方式，而克隆這種“實驗室里人為操縱下制造出生命” 的方式，完全改變了人類自然的生育方式，從有性繁殖回

3、到無性繁殖，人類繁殖后代的過程 不再需要兩性共同參與，這將對現(xiàn)有的社會關(guān)系、家庭結(jié)構(gòu)造成難以承受的巨大沖擊；C、人類克隆技術(shù)可能破壞基因的多樣性遺傳機制。基因的多樣性是物種得以進化適應(yīng)環(huán)境的源泉所在，人類傳統(tǒng)生育方式保證了不同基因組之；D、從遺傳學(xué)看，它破壞了人擁有獨特基因型的權(quán)利?？寺〖夹g(shù)使人類基因單一地遺傳下去，導(dǎo)致人種退化，基因突變、新型病毒出現(xiàn)等一系列嚴(yán) 重的問題。7、.胚胎工程動物培育的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)有哪些？如何控制成功率？關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)有：體外受精、人工受精、核移植和胚胎移植四個環(huán)節(jié)；控制成功率：要對各個環(huán)節(jié)技術(shù)的熟悉了解及掌握，即深化理論知識，對各個環(huán)節(jié)的相關(guān)技術(shù)、應(yīng)注意的問題進行精

4、細(xì)控制.8、從培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)設(shè)備上比較分析植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)的異同？微生物、動物、植物細(xì)胞培養(yǎng)的異同點如下 不同點:首先在培養(yǎng)基上微生物是固體、半固體培養(yǎng)基都有成分主要是水、無機鹽、生長因子、碳源、氮源等。如果是病毒的話要用細(xì)菌進行培養(yǎng)動物的話用天然培養(yǎng)基加生長因子比較好一般是液體培養(yǎng)基成分主要是水、葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清而植物培養(yǎng)基用合成培養(yǎng)基就可以了,一般是固體培養(yǎng)基成分主要是礦質(zhì)元素、蔗糖、纖維素、植物激素、有機添加劑。其次是各自培養(yǎng)的原理上的不同微生物細(xì)胞培養(yǎng)的原理是微生物細(xì)胞的增殖動物細(xì)胞培養(yǎng)的原理是細(xì)胞的增殖植物細(xì)胞培養(yǎng)原理是細(xì)胞的全能性。 最后

5、微生物細(xì)胞培養(yǎng)主要是獲得其代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物或得到細(xì)胞本身植物細(xì)胞培養(yǎng)主要是獲得新個體或細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)用與快速繁殖試管苗、細(xì)胞產(chǎn)品、人工種子、轉(zhuǎn)基因植物的培育等。動物細(xì)胞培養(yǎng)是獲得大量新生細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)用是獲得細(xì)胞的產(chǎn)物或細(xì)胞等。另外動物細(xì)胞分散用到的是胰蛋白酶植物是纖維素酶等。 相同點: 兩者都需要培養(yǎng)基、都需要無菌操作防止染菌、培養(yǎng)時候都需要適當(dāng)?shù)臏囟鹊葪l件。9、 分析討論動物細(xì)胞生物制藥的優(yōu)點與存在問題？P23610、 舉例說明動物細(xì)胞培養(yǎng)在生物制藥中的應(yīng)用。P23511、干細(xì)胞研究的優(yōu)點與存在的問題。P27712、.簡述胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)。P283、413、胚胎細(xì)胞克隆動物

6、與體細(xì)胞克隆動物各有什么優(yōu)勢？胚胎細(xì)胞克隆動物的優(yōu)勢有：胚胎細(xì)胞分化程度較低，成功率較高；可能一次性繁殖性狀相同或高度相似的動物。體細(xì)胞克隆動物的優(yōu)勢有；體細(xì)胞數(shù)量豐富，易于獲得；被獲取核供體的動物不受性別、年齡限制。14、什么是試管動物？試管動物培育一般經(jīng)過哪幾個步驟？其繁殖技術(shù)的關(guān)鍵問題有哪些？試管動物，也稱體外受精動物，是指將供體的精子和卵子在體外受精，體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育到一定階段，通過胚胎移植移入受體完成發(fā)育出生的動物。培育步驟：精子采集與體外獲能，卵子采集與成熟培養(yǎng)；體外受精；重組胚激活與體外培養(yǎng)；胚胎移植；體內(nèi)發(fā)育、出生。關(guān)鍵問題有：精子的采集、獲能和卵子的采集與成熟培養(yǎng)；體外受精問

7、題；胚胎體外培養(yǎng)中的發(fā)育阻滯問題；胚胎移植成活率低的問題；15、脫毒植物的鑒定：直接檢測法（觀察癥狀）、指示植物法，指采用對某種病毒反應(yīng)敏感、癥狀明顯的植物來檢測病毒電鏡法，用電子顯微鏡觀察樣品材料有無病毒存在，抗血清檢測法，病毒注射進動物體內(nèi)，看是否會在血清中產(chǎn)生抗體得到抗血清16、植物細(xì)胞融合的過程：取材（生長旺盛、生命力強的組織）-制備原生質(zhì)體，即去除細(xì)胞壁，（機械去除法和生物酶解法）-純化原生質(zhì)體（離心法、漂浮法等）-誘導(dǎo)細(xì)胞融合（可以利用病毒、化學(xué)誘導(dǎo)劑促使細(xì)胞融合，或者采用的電融合誘導(dǎo)法）。17、怎樣獲得植物的單倍體、三倍體和四倍體？植物四倍體獲得的方法：秋水仙素獲得四倍體（調(diào)整秋

8、水仙素濃度-處理分裂能力強的細(xì)胞）。單倍體的獲得方法是：花藥和花粉培養(yǎng)，（取單核期未開放的花蕾，接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，再通過植株再生發(fā)育成單倍體植株）。植物三倍體的方法：用以上獲得四倍體的方法得到四倍你后，再以二倍體作父本，與四倍體母本植株雜交。18、什么是植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)，它有什么優(yōu)點？植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)是將游離的細(xì)胞包埋在惰性支持物內(nèi)部或貼附在它的表面多糖或多聚化合物置備成的網(wǎng)狀支持物中、培養(yǎng)液呈流動狀態(tài)進行無菌培養(yǎng)的技術(shù)。方法有：吸附、交聯(lián)、共價結(jié)合和包埋等。其優(yōu)點有：細(xì)胞包埋后所受剪切力損傷減小，維持了細(xì)胞穩(wěn)定性；細(xì)胞密度較高時不會改變培養(yǎng)液流體性質(zhì)；可將細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成2個階段分

9、開；細(xì)胞生長較緩慢，利于次生代謝產(chǎn)物積累；增加細(xì)胞之間接觸，促進了細(xì)胞間信息傳遞，利于代謝產(chǎn)物合成；固定化細(xì)胞可反復(fù)使用，可利于連續(xù)培養(yǎng)和收獲產(chǎn)物，降低成本等優(yōu)點。19、什么是次級代謝產(chǎn)物，如何提高植物次級代謝產(chǎn)物？次級代謝產(chǎn)物上通過次級代謝合成的產(chǎn)物，如抗生素、激素、生物堿、毒素等。提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量需要考慮的因素有；A具體是選育優(yōu)良的細(xì)胞株，B培養(yǎng)時保證培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件符合細(xì)胞生長和代謝的需要，C添加次級代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)進行調(diào)控，D添加表面活性劑增加細(xì)胞膜的通透性。20、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法有哪些？各自主要是為了解決什么問題？動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法及其為了解決的問題是：轉(zhuǎn)瓶（管）

10、培養(yǎng)系統(tǒng)，為了解決從小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過度問題；微載體培養(yǎng)，為擺脫傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）培養(yǎng)限制，實現(xiàn)三維立體貼附培養(yǎng)；中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)，為改善傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的氣體、營養(yǎng)物質(zhì)及水分等物質(zhì)的通透性；大規(guī)模培養(yǎng)方式，該法是為使細(xì)胞持續(xù)生長到較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高水平。21、原代培養(yǎng)取材時需要注意的幾個問題是：應(yīng)選分化程度低、容易培養(yǎng)的組織，如胚胎、新生組織等；注意使用新鮮材料和保鮮，取材后一般6h內(nèi)分離細(xì)胞；嚴(yán)格無菌；防止細(xì)胞機械損傷；避免組織干燥。動物細(xì)胞原代培養(yǎng)有組織塊原代培養(yǎng)和細(xì)胞原代培養(yǎng)。 22、利用MS培養(yǎng)基配制植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的方法及步驟 （P45）解：基本步驟：1，根據(jù)所

11、需配置的培養(yǎng)基量，用移液管從裝有MS母液的容器里吸取所需的母液量以及所需的6-BA0.5mgL植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液。注：不同的母液需要用不同的移液管吸取，切忌混用，以免母液被污染不純 2，將吸取的母液依次注入量筒，注入蒸餾水定容 3，將電飯鍋的電源插上,將溶液倒入，打開開關(guān)加溫，并在適當(dāng)?shù)臏囟葧r分別加入蔗糖與瓊脂，并用玻璃棒不斷攪拌，使其均勻溶解。注：加入瓊脂時，必須注意溫度的掌握，不可過高。 4，在桌上將玻璃瓶按一定序列排好，將煮好的培養(yǎng)基均勻倒入，并且蓋好瓶蓋，貼上標(biāo)簽，寫上培養(yǎng)基的名稱。 5，將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋后，擰緊，并加適量的水。打開開關(guān)工作后，先讓溫度上升至120，保持20分鐘

12、左右，溫度開始下降，整體滅菌需要一段較長時間（一般為2個小時左右）。6，一段時間后，取出培養(yǎng)基，將那些瓶蓋沒蓋好，已經(jīng)感染的培養(yǎng)基處理掉。 7，做好一切后，打掃衛(wèi)生，保持整體環(huán)境干凈整潔23、分析比較細(xì)胞培養(yǎng)不同操作方式的優(yōu)缺點。分批式培養(yǎng)方式的優(yōu)點有操作簡單，培養(yǎng)周期短，能直觀反映細(xì)胞生長代謝過程，生產(chǎn)規(guī)模放大比較容易，其缺點有不能控制底物濃度、細(xì)胞容易老化、生長周期短、效率低等；流加式培養(yǎng)的優(yōu)點有可合理充足補充營養(yǎng)、減少產(chǎn)物反饋抑制、排除有害代謝物積累對細(xì)胞的損傷及細(xì)胞不易老化，另外還能避免一次性投料過多，改善培養(yǎng)液流體性質(zhì)，延長指數(shù)生長期，其缺點是操作較麻煩，受生物反應(yīng)器容積的限制等；半

13、連續(xù)式培養(yǎng)能使細(xì)胞持續(xù)指數(shù)生長，可多次收獲并且操作簡便，生產(chǎn)效率高，其缺點是菌種易老化；連續(xù)式培養(yǎng)可使細(xì)胞在恒定狀態(tài)下生長，細(xì)胞生長速率可基本保持不變，持續(xù)指數(shù)增長，但其缺點是收獲細(xì)胞濃度不高、細(xì)胞分裂快、易變異、易污染等；灌流式培養(yǎng)可維持較高的細(xì)胞密度，使細(xì)胞處于較穩(wěn)定的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物積累低，反應(yīng)速率易控制，培養(yǎng)周期長，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高，其缺點是儀器設(shè)備要求較高，操作較復(fù)雜等。7、植物組織培養(yǎng)的基本步驟及獲得完整植株的途徑解：第一步，將采來的植物材料除去不用的部分第二步是對材料的表面浸潤滅菌第三步是用滅菌劑處理植物離體快繁和脫毒技術(shù)第四步 把消毒過的外植體接到ms培養(yǎng)基上、在光照培

14、養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)、若要得到愈傷組織、則無需光照，直接進行暗培養(yǎng)第五步 愈傷組織的誘導(dǎo)、把形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到生芽生根培養(yǎng)基上、進行再分化第六步 得試管苗、轉(zhuǎn)種、得到完整植株在無菌的情況下，將植物體內(nèi)的某一部分器官或組織，如莖尖、芽尖、形成層、根尖、胚芽和莖的髓組織等從植物體上分離下來，放在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間的生長、分化最后長成一個完整的植株11、簡述植物激素的應(yīng)用規(guī)律。先生長素處理，后細(xì)胞分裂素處理，有利于細(xì)胞分裂，但細(xì)胞不分化。先細(xì)胞分裂素處理，后生長素處理、細(xì)胞分裂也分化（可能是內(nèi)源生長素起了作用）。生長素和細(xì)胞分裂素同時處理，分化頻率提高。兩者同時存在的用量比值可以改變形態(tài)建成

15、的方向。生長素細(xì)胞分裂素：比值高：有利根分化，抑制芽形成；比值低：有利芽分化，抑制根形成；比值適中：促進愈傷組織生長。1、雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體的制備原理與技術(shù)流程？原理：將雜交瘤細(xì)胞與免疫的動物脾細(xì)胞融合得到既能夠分泌抗體又能在體外長期繁殖的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。這種技術(shù)稱為雜交瘤技術(shù)。技術(shù)流程：動物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備：一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫（向動物腹腔內(nèi)注射抗體）、加強免疫（向動物靜脈內(nèi)注射抗體）三個過程，如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液 骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)：骨髓細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，

16、這樣雜交融合率高。通常采用鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞系。一般在準(zhǔn)備融合細(xì)胞錢的兩周就應(yīng)開始附屬骨髓瘤細(xì)胞。保 證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。細(xì)胞融合：取對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清。用PEG作用下，融合雜交瘤細(xì)胞。融合細(xì)胞的篩選：融合后的細(xì)胞類型：融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活57天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。剩余：脾細(xì)胞+瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞+未融合的瘤細(xì)胞+融合的瘤細(xì)胞，其中后兩種需要進行特別的篩選去除。克隆

17、化培養(yǎng)：將融合的細(xì)胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一個孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個細(xì)胞之間。培養(yǎng)一段時間后去上清以ELISA法選出抗體高分泌性的抗體。找到針對目標(biāo)抗原的抗體，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體。分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：主要是基于抗原或抗體能夠吸附至固定相載體的表面并保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。單克隆抗體的大來那個生產(chǎn)：實體瘤法、腹水制備法、生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗。7、何謂細(xì)胞工程？簡述細(xì)胞工程的技術(shù)。細(xì)胞工程操作的主要對象有哪兩大類細(xì)胞？細(xì)胞工程：是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過某種工程技術(shù)手段，

18、在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。細(xì)胞工程的技術(shù)包括：細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞拆合技術(shù)、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、細(xì)胞器移植技術(shù)、胚胎移植技術(shù)、細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)、染色體導(dǎo)入技術(shù)，從細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同層次對細(xì)胞進行遺傳操作。細(xì)胞工程操作的主要對象有原核細(xì)胞如細(xì)菌、放射菌等細(xì)胞和真核細(xì)胞如酵母、動植物等細(xì)胞兩大類。 簡述植物細(xì)胞的培養(yǎng)特性（1）植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，具有纖維素細(xì)胞壁。（2）培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染、需要用抗生素。（3）在細(xì)胞生長的中期和對數(shù)期容易凝聚成直徑達(dá)350-400um的團塊，懸浮培養(yǎng)比較困難。（4）培養(yǎng)時需要供

19、氧，培養(yǎng)液粘度較大，不能耐受強力通風(fēng)攪拌。（5）細(xì)胞具有群體效應(yīng)、無錨地依賴性和接觸抑制性。（6）細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物多數(shù)滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量較低。（7）培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)、功能上的全能性細(xì)胞工程.二級生物安全適用于處理什么材料，具體要求有哪些答：適用于：（1）來自于來自于靈長類動物的材料和細(xì)胞系(2) 接觸過靈長類的病毒或被其轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞系(3)含有支原體的細(xì)胞系。要求：（1）所有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作都應(yīng)使用垂直層流生物安全小室；（2）所有污染物都應(yīng)放入裝滿蒸餾水的防漏的不銹鋼桶中；（3）大的塑料器皿蓋緊后放入高壓消毒袋中進行高壓消毒；（4）在處理或沖洗用過的器皿前，應(yīng)先進行高壓消毒；（5）進行操作時要

20、帶乳膠手套。2.原生質(zhì)體分離的方法有哪些，各有何優(yōu)缺點（6分）答：（1）機械法優(yōu)點：可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞。缺點：獲得完整原生質(zhì)體的數(shù)量少，使用此法的植物種類有限。（2）酶解法優(yōu)點：可獲得大量原生質(zhì)體，條件溫和，原生質(zhì)體完整性好，幾乎所有植物都可用此法。缺點：影響原生質(zhì)體的活力。.植物組織培養(yǎng)的基本步驟答：（1）培養(yǎng)材料的采集（2）培養(yǎng)材料的消毒（3）制備外植體（4）接種和培養(yǎng)（5）根的誘導(dǎo)（6）組織苗的練苗移栽4.細(xì)胞系和細(xì)胞株的鑒定指標(biāo)及方法（8分）答：鑒定指標(biāo)：（1）純度：分析以何種細(xì)胞為主，所占比例為多少，混雜有哪些其他細(xì)胞。（2）細(xì)胞生物學(xué)特征：細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、染色體組型、生長

21、曲線、分裂指數(shù)、倍增時間是否與來源細(xì)胞一致。（3）穩(wěn)定性：傳代過程中細(xì)胞學(xué)特征是否發(fā)生變化。（4）污染情況：檢查是否有微生物或其他細(xì)胞系的污染。鑒定方法：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；繪制生長曲線，計算分裂指數(shù)；染色體組型和帶型分析；同工酶譜檢測4.植物細(xì)胞固定化的方法及特點答：吸附法：利用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。包埋法：將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部而制成固定化細(xì)胞的方法。特點：（1）由于載體的保護作用，減小剪切力作用，提高細(xì)胞存活率和穩(wěn)定性。（2）細(xì)胞束縛在一定空間內(nèi)，不易聚集成團，促進代謝產(chǎn)物的分散。（3）可簡便地在不同培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液。（4）固定化植物細(xì)胞可連續(xù)反復(fù)使用，

22、可縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。（5）容易與培養(yǎng)液分離，有利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。植物單細(xì)胞培養(yǎng)的程序及各步中應(yīng)注意的事項答：1.建立細(xì)胞株（1）材料準(zhǔn)備a.確定植物種類品種b.選擇單細(xì)胞或愈傷組織或葉肉、下胚軸等c.借助酶處理：酶的種類、濃度、處理時間都對材料有一定影響（2）制備細(xì)胞懸浮液a.培養(yǎng)基成分篩選b.懸浮培養(yǎng)，振蕩次數(shù)為8090次/minc.用200300目鋼網(wǎng)過濾盒離心沉降2.選擇細(xì)胞株平板篩選a.細(xì)胞起始密度（0.5-2.5）*105個/mlb.固體薄層培養(yǎng)基c.按目標(biāo)反復(fù)進行測定3.擴大培養(yǎng)（或分化培養(yǎng)）（1）擴大培養(yǎng)（懸浮）（2）分化培養(yǎng)（固體）抗性分析（生化分析

23、4.鑒定分析（1）擴大培養(yǎng)：鑒定提取：多次重復(fù)測定（生化分析）（2）分化培養(yǎng)：植株再生鑒定遺傳分析：抗性測定、生化分析、遺傳分析1.利用固定化技術(shù)的優(yōu)點為:(1)反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞濃度高，代謝產(chǎn)物產(chǎn)率相應(yīng)提高;(2)細(xì)胞可以長時間重復(fù).使用;(3)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，細(xì)胞抗剪切應(yīng)力能力提高;(4)細(xì)胞間接觸良好，細(xì)胞分化適宜，有利于次生代謝產(chǎn)物的合成;(5)減少植物細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性2.大規(guī)模培養(yǎng)的特點:（1）代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)完全在人工控制條件下進行，可以通過改變培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系得到超整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物；（2）培養(yǎng)在無菌條件下進行，可排除病菌和蟲害侵?jǐn)_；（3）可以進行特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；（4

24、）可以探索新的合成路線和獲得新的有用物質(zhì)等。3.植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù):懸浮細(xì)胞培養(yǎng):機械攪拌式生物反應(yīng)器氣升循環(huán)式生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器固定化培養(yǎng)植物器官培養(yǎng)4.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素:1.外植體的選擇2.環(huán)境因子的影響:光、溫、振蕩頻率3.培養(yǎng)基的選擇5.細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)實意義：生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生技術(shù)產(chǎn)品如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮生長因子及干擾素、白細(xì)胞介素等生長因子及單克隆抗體等。科學(xué)研究上：在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面。臨床醫(yī)學(xué)上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾病的治療等5.培養(yǎng)細(xì)胞生命期：是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。包括原代培養(yǎng)期、

25、傳代培養(yǎng)期及衰退期。原代培養(yǎng)(PrimaryCulture)期：特點：細(xì)胞呈活躍移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。傳代期：在全生命期中此期的持續(xù)時間最長，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型衰退期：特點：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。6.單克隆抗體的應(yīng)用：a.單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。b.利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時也增加了疫苗的安全性。c.單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)d.單克隆抗體技術(shù)

26、還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不7.常用的雜種細(xì)胞篩選方法：u基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選u基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選u由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選u具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選8.什么是胚胎移植？有什么意義？所謂胚胎移植（embryotransfer）也稱受精卵移植，是指將良種母畜配種后，從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同種生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體技術(shù)，所以也稱為“借腹懷胎”。胚胎移植的意義：發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖力，迅速擴大優(yōu)良畜種數(shù)量，加速優(yōu)良畜種的推廣應(yīng)用；縮短世代間隔、增加選擇強度，促進家畜改良速

27、度；長期保存冷凍胚胎，便于優(yōu)良品種的種質(zhì)運輸和保存；是胚胎分割、胚胎嵌合、性別鑒定和核移植等其它胚胎生物技術(shù)的基礎(chǔ)，也是基礎(chǔ)生命科學(xué)研究的重要手段。9.干細(xì)胞有幾個主要特征：干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞；干細(xì)胞能無限增殖分裂；干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能有兩種命運保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞10.動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法1.轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)：培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，是細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣。2.反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞貼附于反應(yīng)器內(nèi)固定的表面生長。特點：比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離和培養(yǎng)設(shè)備，但難以擴大規(guī)模。3.懸浮培養(yǎng)主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞的培

28、養(yǎng)特點：成本較低，可連續(xù)收集部分細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，傳代時無需消化分散。4.固定化培養(yǎng)將細(xì)胞與非水溶性載體結(jié)合起來，在生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模培養(yǎng)。11.胚胎細(xì)胞的生物學(xué)特性、來源、培養(yǎng)、鑒定ES細(xì)胞的生物學(xué)特性：1.細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型2.細(xì)胞的高度分化潛能3.堿性磷酸酶的表達(dá)4.胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)ES細(xì)胞的來源:1.早期胚胎2.妊娠早期胎兒組織3.體細(xì)胞核移植ES細(xì)胞的培養(yǎng)：1.飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法（1）小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）：能產(chǎn)生抑制ES細(xì)胞分化的白血病抑制因子（LIF）和促進ES細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子（2） STO細(xì)胞：來自SIM小鼠胚胎（S），對硫代鳥嘌呤（A）和鳥苯苷（O）

29、具有抗性的成纖維細(xì)胞系2.無飼養(yǎng)層培養(yǎng):（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)液+500-1000IU/ml重組LIF（2）大鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基（3）大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基ES細(xì)胞的鑒定:-細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)-核型分析-特異性標(biāo)志分子的表達(dá)-分化能力檢測-嵌合體的形成ES細(xì)胞研究的應(yīng)用1.ES系統(tǒng)已經(jīng)成為基因功能研究的有效手段2.ES細(xì)胞系建立后，可從最根本上揭示人及動物發(fā)育過程中的決定基因3.ES細(xì)胞可作為評價新藥及化學(xué)產(chǎn)品的毒性及效能的檢測系統(tǒng)4.ES細(xì)胞有可能成為今后細(xì)胞替代療法和組織器官移植的最佳來源成體干細(xì)胞的生物學(xué)特征(1)成體干細(xì)胞體積小，細(xì)胞器稀少，RNA含量較低，在增殖過程中處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，在組織結(jié)構(gòu)

30、中位置相對固定。(2)成體干細(xì)胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。(3)成體干細(xì)胞是自我復(fù)制還是分化為功能細(xì)胞取決于所在的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。(4)成體干細(xì)胞沒有確定的來源。12.核移植技術(shù)的應(yīng)用:1制備轉(zhuǎn)基因克隆動物，進行生物藥物生產(chǎn)；2培育優(yōu)良畜種，擴大良種種群3開展異種動物克隆，拯救瀕危動物4與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆5利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問題。13.目的基因的來源:1.采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增特定基因片段。14.轉(zhuǎn)基因動物的方法:反轉(zhuǎn)錄病

31、毒法基因顯微注射法胚胎干細(xì)胞移植法15.正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細(xì)胞：通過物理方法將重組DNA分子導(dǎo)入ES細(xì)胞，在含有抗菌素G418的培養(yǎng)基中，沒有整合外源基因的細(xì)胞將全部死亡，只有整合了外源基因的細(xì)胞才可以存活下來。負(fù)選擇法篩選出特異整合型ES細(xì)胞：如果非特異性整合發(fā)生，則兩個tk基因或其中一個基因很大可能與TG和neor一起整合，這時用GCV篩選，tk基因表達(dá)的胸苷激酶能反GCV轉(zhuǎn)化成有毒的化合物，使細(xì)胞死亡。這是負(fù)選反擇。16.反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理：寄生在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒有包裝信號，能生產(chǎn)病病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，載體上的

32、包裝信號將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。17.轉(zhuǎn)基因動物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用:研究基因的結(jié)構(gòu)與功能;研究基因的組織特異性表達(dá);研究發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控;克隆在發(fā)育中起重要作用的基因;基因多級調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究;細(xì)胞功能研究18.轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用:研究病毒性疾病;研究建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型;轉(zhuǎn)基因動物與基因治療;生產(chǎn)天然活性藥物蛋白19.動物細(xì)胞的培養(yǎng)基主要哪幾種？各有何特點？主要分為天然，合成，無血清培養(yǎng)基。天然：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。成分復(fù)雜，個體差異大來源有限。合成優(yōu)點：已知成分配制，培養(yǎng)條件一致,有利于定量研究代謝成分,便于細(xì)胞大量生產(chǎn)節(jié)省人力

33、、物力,無潛在病毒污染.缺點：一般仍需要補充一定量的血清。由于血清中成分復(fù)雜且不穩(wěn)定，給細(xì)胞產(chǎn)物的分離提取，激素，藥物的作用機理研究，細(xì)胞對營養(yǎng)的確切需求等實驗的設(shè)計和結(jié)果分析帶來很多困難，而且血清只能過濾細(xì)菌，但過濾只能出去細(xì)菌，而不能出去血清中可能含有的病毒支原體，會干擾研究。無血清：優(yōu)點：保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，可重復(fù)性，穩(wěn)定性，簡化了提純和鑒定細(xì)胞產(chǎn)物的程序，減少細(xì)胞污染，降低疫苗反應(yīng)。缺點：成本太高，對試劑和水的純度以及器皿的清潔程度要求也更高，針對性較強，一種無血清培養(yǎng)基一般只適用于一類細(xì)胞的培養(yǎng)等。20.大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞技術(shù)？目前哪些應(yīng)用？問題？1氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)2微載體培養(yǎng)系統(tǒng)

34、3中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)4微囊培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)用：疫苗，干擾素，單克隆抗體，基因重組產(chǎn)品。存在問題：1細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度低2細(xì)胞群體在大規(guī)模、長時間的培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物的能力易丟失，或產(chǎn)物的活性以降低3培養(yǎng)成本高，產(chǎn)品價格昂貴4對細(xì)胞代謝和生長特性的基礎(chǔ)研究比較欠缺。5在線檢測技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)等。細(xì)胞橋的形成是細(xì)胞融合最關(guān)鍵的一步21.為什么細(xì)胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？因為滅活的病毒能使細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅活的話會感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。22.干細(xì)胞分類：（1）按來源分類胚胎干細(xì)胞，成體干細(xì)胞（2）按分化潛能分類全能干細(xì)胞，多能干細(xì)胞，單能干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞特點：具有很強的分化能力，可以無限增加，并且可以分化成全身多種細(xì)胞類型。干細(xì)胞共同特征：具有自我更新和不同程度的多向分化潛能，屬非終末分化細(xì)胞，終生保持未分化或低分化特征，缺乏分化標(biāo)記，能無限地分裂、增殖，干細(xì)胞通過兩種可能的方式增長，對稱分裂和非對稱分裂。胚胎干細(xì)胞：具有發(fā)育全能性，具有種系