PDA培養(yǎng)基的配制方法

1、.PDA培養(yǎng)基的配制方法一、目的要求1學(xué)習(xí)并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2學(xué)習(xí)并掌握棉塞的制作方法。二、培養(yǎng)基的配制原理培養(yǎng)基是人工配制的各種營養(yǎng)物質(zhì)供微生物生長繁殖的基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加上實(shí)訓(xùn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，但不論是何種培養(yǎng)基，均應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽等。不同微生物對(duì)pH值要求不一樣，所以配制培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)根據(jù)不同微生物對(duì)pH值的要求，將培養(yǎng)基調(diào)到合適的pH值范圍。三、實(shí)訓(xùn)材料和用具瓊脂，可溶性淀粉，葡萄糖， 10NaOH，10HCl，1molL NaOH，lmolL

2、HCl，KNO3，NaCl，K2HPO43H20，MgSO47H20，F(xiàn)eSO47H2O；試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH試紙，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，紗布， 四、操作方法與步驟(一) 培養(yǎng)基的配制PDA培養(yǎng)基的配制 其配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂1520g，水1000mL，pH值自然。(1)稱量和熬煮 藥品實(shí)際用量計(jì)算后，按培養(yǎng)基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，在加熱器上加熱至沸騰，維持2030min，用可用2層紗布趁熱在量杯上過濾，濾渣棄取。濾液補(bǔ)充水分到1000ml。 (2)加熱溶解 把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15

3、20g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。 (3)分裝 按實(shí)訓(xùn)要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml三角瓶內(nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的15，滅菌后制成斜面，分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜；半固體培養(yǎng)基以試管高度的13為宜，滅菌后垂直待凝。(4) 加棉塞 培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或試管帽等)，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)造成污染，并保證有良好的通氣性能。(5)包扎 加塞后，將全部試管用麻繩或橡皮筋捆好，

4、再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩或橡皮筋扎好，用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。(二) 棉塞的制作棉塞的作用有二：一是防止雜菌污染；二是可過濾空氣，保證通氣良好，并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，所以正確地制備棉塞是培養(yǎng)基制備中重要的一環(huán)。正確的棉塞是形狀、大小，松緊應(yīng)與試管口(或三角燒瓶)完全適合。過緊則妨礙空氣流通，操作不便；過松時(shí)，空氣會(huì)毫無障礙地進(jìn)入試管(或三角燒瓶)中，達(dá)不到滅菌的目的。棉塞過小往往易掉進(jìn)試管內(nèi)，因此棉塞質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)實(shí)訓(xùn)的結(jié)果有很大的影響。正確的棉塞頭較大，加塞時(shí)，應(yīng)使棉塞長度的13留在試管口外，23在試管口內(nèi)（見實(shí)訓(xùn)圖6-4）。目前

5、，有條件的實(shí)訓(xùn)室已使用堅(jiān)固的塑料試管帽、金屬試管帽、硅膠泡沫塞替代棉塞，制作棉塞要選纖維較長的棉花，一般不選用脫脂棉。因?yàn)樗菀孜儩瘢斐晌廴?，而且價(jià)格也貴。棉塞制作方法見圖6-5 實(shí)圖6-4棉塞 實(shí)圖6-5 棉塞的制作方法（三）斜面與平板培養(yǎng)基的制作斜面與平面培養(yǎng)基是常用的瓊脂固體培養(yǎng)基。將熬制好的瓊脂培養(yǎng)基趁熱裝入試管滅菌后擺鞋面，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基常用于菌種培養(yǎng)、菌種保藏等工作。將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基傾注于無菌培養(yǎng)皿中，凝固后即成平板培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基常用于分離菌種、菌落計(jì)數(shù)、菌落形態(tài)觀察及菌種鑒定等。斜面與平板培養(yǎng)基的制作過程大致為：溶解原料、融化瓊脂、調(diào)PH、分裝、滅

6、菌和制斜面或平板。1、溶解原料為加速原料的溶解，最好用熱水。先將原料依次加入到占配制量一半的水中，待全部溶解后在加足水量。如配方中有馬鈴薯、麩皮、胡羅卜、豆芽等天然原料，需將其熬制約30min，取出定量濾液，在將所需的其他原料加入濾液中。 2、融化瓊脂 瓊脂的用量可靈活掌握。用作保藏菌種的培養(yǎng)基，瓊脂用量可提高至2.5%，以增加持水性。冬季的氣溫低，瓊脂用量可適當(dāng)減少。瓊脂用前可剪成小段，以利于融化。待溶液煮沸是再加入，不斷攪拌至完全無瓊脂塊狀物時(shí)再停止加熱。 3、調(diào)整PH 用潔凈干燥的玻璃棒沾一點(diǎn)培養(yǎng)基滴在試紙上，立即與比色板比較。一般用10%NaOH或HCl調(diào)節(jié)。 4、分裝將培養(yǎng)基趁熱倒入

7、墊有紗布的漏斗中，使培養(yǎng)基直接濾至試管或三角瓶中，試管裝量一般為管高的1/4左右，三角瓶的裝量約為其容量的一半。勿使培養(yǎng)基玷污容器口部。口部塞有棉塞，試管每7或9 支扎一捆，棉塞外面包牛皮紙，以防在滅菌過程中被水汽打濕。5、滅菌分裝后的培養(yǎng)基應(yīng)隨即滅菌。除特殊情況外，一般培養(yǎng)基均用高壓蒸汽滅菌，在104kPa壓力下，滅菌20-30min 。6、制作斜面或平板將滅菌后的試管趁熱斜置于棍條上，傾斜度以試管中的培養(yǎng)基約占試管長度的1/2為宜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。待滅菌后三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基冷卻至4550時(shí)，以無菌操作法向無菌培養(yǎng)皿中倒入培養(yǎng)基，裝置以剛覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿底部為宜（約15ml）,凝固后即成平

8、板培養(yǎng)基。五、高壓蒸汽滅菌法 該法使用高壓滅菌鍋，在121，O105MPa壓力下滅菌1530min。微生物實(shí)訓(xùn)所需的一切器皿、器具、培養(yǎng)基(不耐高溫者除外)、無菌水、工作服等物品都可用此法滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋是能耐一定壓力的密閉金屬鍋，有立式或臥式(實(shí)圖8-1、2 )兩種。滅菌鍋上附有壓力表、排氣閥、安全閥、加水口、排水口等。臥式滅菌鍋還附有溫度計(jì)。有的還有蒸汽人口。滅菌鍋的加熱源有電、煤氣和蒸汽三種。高壓蒸汽滅菌的操作過程(1) 加水 將滅菌鍋內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，以水面與三角架相平為宜。立式鍋是直接加水至鍋內(nèi)底部隔板以下13處。有加水口者由加水口加入至止水線處。(2)

9、裝料 將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝入待滅菌的物品。放置裝有培養(yǎng)基的容器時(shí)要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以防冷凝水沾濕棉塞。(3) 加蓋 擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓的方式擰緊所有螺栓，打開排氣閥。(4) 排氣 用電爐或煤氣加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出。一般認(rèn)為，當(dāng)排氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)空氣已排凈(沸后約5min)。(5) 升壓 當(dāng)鍋內(nèi)空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。 實(shí)圖7-1 立式滅菌鍋 實(shí)圖7-2 臥式滅菌鍋1安全閥 2壓力表 3放氣閥4軟管 5緊固螺栓 6滅菌桶 7篩架8水 (6)保壓 當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力刻度時(shí)，控制熱源，開始計(jì)時(shí)

10、并維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)訓(xùn)用121、20rnin滅菌。(7)降壓 達(dá)到所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開排氣閥。放凈余下的蒸汽后，再打開鍋蓋，取出滅菌物品，排掉鍋內(nèi)剩余水。(8)無菌檢查 將已滅菌培養(yǎng)基冷卻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長，則放人冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩?化學(xué)藥品滅菌 化學(xué)藥品消毒滅菌法是用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；僅阻抑細(xì)菌代謝機(jī)能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多抗生素等?；瘜W(xué)藥品對(duì)微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果，還與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物的時(shí)間長短、微生物的種類及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。微生物實(shí)訓(xùn)室中常用的化學(xué)藥品有2煤酚皂溶液(來蘇爾)、O25新潔爾滅、01升汞、35的甲醛溶液和75乙醇溶液等。5注意事項(xiàng)(1)使用高壓滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，避免發(fā)生事故；滅菌時(shí)，操作者切勿擅自離開；務(wù)必待壓力降到零后，才可打開鍋蓋。(2)干熱滅菌時(shí)電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸，以防包裝紙烤焦。(3)記述高壓蒸