細(xì)胞實驗技術(shù)-課堂PPT-第一講 細(xì)胞培養(yǎng)概述3.31

1、細(xì)胞培養(yǎng)概述,Cell Culture,細(xì)胞生物學(xué)教研室,授課對象：研究生授課教材：細(xì)胞培養(yǎng)，司徒振強(qiáng)、吳軍正主編等主編， 世界圖書出版西安有限公司授課教師：顧蕓，王彩萍，劉曉宇帶教研究生：一組負(fù)責(zé)人：彭蘇 組員：龔佳歡、劉鑫、吳建成、葉永契 二組負(fù)責(zé)人：何春嬌 組員：王盛燃、張薛杰、查廣彬 從猛 神經(jīng)再生重點實驗室/神經(jīng)科學(xué)系,課程內(nèi)容介紹,第一講：細(xì)胞概論- 4.11（周一）18:30 第二講：細(xì)胞株傳代培養(yǎng)- 4.12（周二）18:00 第三講：臺盼藍(lán)染色及細(xì)胞計數(shù)- 4.14（周四）18:00 第四講：細(xì)胞凍存及種細(xì)胞（為真核轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分裂指數(shù)做準(zhǔn)備） - 4.15（周五）18:00

2、第五講：真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染- 4.16（周六）18:00 第六講：細(xì)胞分裂指數(shù)，細(xì)胞活力鑒定及細(xì)胞固定（為細(xì)胞周期測定做準(zhǔn)備） - 4.17（周日）18:00 第七講：凍存細(xì)胞復(fù)蘇、觀察轉(zhuǎn)染效果及講解細(xì)胞周期、細(xì)胞活力測定結(jié)果 - 4.18（周一）18:00 第八講：原代細(xì)胞的培養(yǎng)- 4.19（周二）18:00 第九講：觀察原代培養(yǎng)結(jié)果，流式細(xì)胞實驗演示，課程復(fù)習(xí)和總結(jié) - 4.21（周四）18:00,？WHY,據(jù)CCTV4報道，13年10月中國臺灣地區(qū)臺北榮民總醫(yī)院在干細(xì)胞研究方面有重大突破，研究人員利用干細(xì)胞已分化出網(wǎng)膜和心肌細(xì)胞，目前該研究正處于臨床實驗階段，未來有望生產(chǎn)干細(xì)胞藥品有效治療失明

3、、心臟病等。,一口好牙不但能給出一個美麗的笑容，還是健康的標(biāo)志。但由于疾病或意外事故，我們可能失去牙齒。鑲顆金牙吧，有損整體美觀?，F(xiàn)在好了，科學(xué)家成功利用人的尿液衍生的細(xì)胞誘導(dǎo)形成干細(xì)胞獲得再生牙齒雛形。7月30日，這項研究成果刊登在學(xué)術(shù)期刊細(xì)胞再生上，同時也引發(fā)國際社會廣泛討論。,CLS生物治療的原理是利用自身免疫殺滅腫瘤細(xì)胞。2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎獲得者斯坦曼博士在1973年發(fā)現(xiàn)了激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞DC細(xì)胞。在20世紀(jì)80年代，科學(xué)家又培養(yǎng)出了具有腫瘤強(qiáng)殺傷效應(yīng)的CIK細(xì)胞。這兩種細(xì)胞是腫瘤生物治療的關(guān)鍵。CLS生物治療通過體外實驗萬倍擴(kuò)增這兩類細(xì)胞，再輸回患者體內(nèi)實現(xiàn)腫瘤大面積殺傷治

4、療。CLS多細(xì)胞生物免疫治瘤-有效延長生命長度3-5年,保證提升生物質(zhì)量,實現(xiàn)瘤自我康復(fù) .,細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用,細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用,研究哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律 研究細(xì)胞分化用于制造組織，器官 研究基因功能 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物 疾病治療與治療性克隆 研究細(xì)胞癌變機(jī)理及新藥物的篩選,從分子到細(xì)胞，我們?nèi)绾稳ニ伎迹?細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點,1.活細(xì)胞：能長時間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動 2.可控制：可選擇特定的研究細(xì)胞種類、性質(zhì)、階段 可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等因素 可采用各種研究技術(shù)、記錄方法： 倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、

5、同位素標(biāo)記等。 3. 樣品均一性：來源于同一組織同一種細(xì)胞。 4.經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化,細(xì)胞培養(yǎng)的局限性,人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高, 但人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同。缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。 當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后, 生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，必然發(fā)生變化。,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,無菌/滅菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器， 潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清 細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器

6、， 高速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：液氮罐 實驗室安全： 生物實驗室安全，P1, P2, P3 實驗室安全,設(shè)計原則：防止微生物和有害物質(zhì)的影響，要求環(huán)境整潔，空氣清新、無塵、干燥。細(xì)胞培養(yǎng)室按功能可分為準(zhǔn)備室，緩沖室，培養(yǎng)室。,Cell Biology Lab,凈化工作室,細(xì)胞培養(yǎng)室,超凈工作臺,Sterile work area,laminar flow cabinet class II - HEPA filter (0.3 m) - UV 250-270 nm,Incubator (humid CO2 incubator recommended),CO2 incubator， 37oC

7、， Appropriate CO2,大容量高壓滅菌器,全自動手提式滅菌器,濕熱滅菌裝置,自動雙重純水蒸餾器 純水儀,細(xì)胞培養(yǎng)用水裝置,酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器,水平離心機(jī),倒置顯微鏡,inverted microscope,水浴箱,干燥箱,29,Liquid N2,Long-term storage of cells,液氮罐,移液器,濾 器,大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。,Zeiss濾器(過濾除菌)：,培養(yǎng)基過濾除菌裝置,負(fù)壓,正壓,培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿,實驗器材的清洗和滅菌,清洗的重要性 1. 除化學(xué)污染：鹽、油污、蛋白質(zhì)、重金屬等 2. 使培養(yǎng)瓶內(nèi)表面帶負(fù)電荷，供細(xì)

8、胞附著。 不要讓污染了的器皿變干！ 滅菌的重要性 除去微生物污染,一、玻璃制品的清洗 清洗工作包括；浸泡、超聲、浸酸、沖洗四步。 1、浸泡；器皿在加中性洗滌劑的液體中浸泡數(shù)小時。新購的玻璃器皿必須徹底清洗。 2、超聲；在加有中性洗滌劑的超聲槽中超聲30min。 3、沖洗，用水沖凈，稍涼干后浸酸。 4、浸酸-清潔液，一般浸泡6h以上。以配制中等強(qiáng)度清潔液為例；重鉻酸鉀120g、濃硫酸200ml、蒸餾水200ml。 5、沖洗，及時沖凈（不掛水為止） 6、烘干。,三：金屬器皿,金屬器皿不能泡酸，洗滌時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中

9、晾干。 放入鋁制盒內(nèi)包裝好，高壓滅菌，再烘干備用。,二、塑料及橡膠制品 用水浸泡超聲沖洗浸酸（1%鹽酸，6h）沖洗烘干。,四、物品的包裝及消毒 1、 洗凈、烘干的物品應(yīng)及時包裝，常用牛皮紙、棉布、鋁盒、以及專用金屬消毒筒等。物品應(yīng)標(biāo)明品名、日期。 2、消毒； 用壓力蒸氣滅菌，玻璃器皿一般15壓力（ibf)-121.壓力維持30min。培養(yǎng)用的液體以及塑料、橡膠制品常以10ibf-115，維持10min。 過濾除菌；有塑料、不銹鋼微孔濾膜濾器，用正壓過濾除菌。塑料的一般為針式濾器，直徑25mm和50mm兩種。不銹鋼微孔濾膜濾器有500和1000ml兩種。除菌用微孔濾膜，孔徑為0.22um。注意濾

10、完后要檢查濾膜是否完整。 電離輻 射滅菌；核素產(chǎn)生的r射線或電子加速器產(chǎn)生的加速離子輻射物品殺細(xì)菌和微生物的方法。 環(huán)氧乙烷，化學(xué)滅菌。,培養(yǎng)用液,體外培養(yǎng)離不開細(xì)胞在體外生存和生長的各種液體環(huán)境-培養(yǎng)用液，因此其各種成份必需嚴(yán)格選擇，有嚴(yán)格的制備操作過程。 培養(yǎng)用液主要包括: 培養(yǎng)液、緩沖液、平衡鹽溶液、血清、PH調(diào)整液、抗生素液等。所有用液均除菌后標(biāo)明名稱、日期、 PH值，在適當(dāng)溫度下貯存。,一、水與緩沖液 （一） 水: 是培養(yǎng)用液最主要的溶劑，是細(xì)胞賴依生存的環(huán)境。 對水質(zhì)要求高；三蒸水、去離子水、超純水。此外，水的貯存也很重要；貯存于密封、洗凈玻璃并內(nèi)，時間2W，最好是現(xiàn)制現(xiàn)用。,（二

11、）緩沖液 由弱酸/弱酸強(qiáng)堿組成的鹽或弱堿/弱堿強(qiáng)酸組成的鹽如碳酸/碳酸氫鈉，磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉。 細(xì)胞生活環(huán)境中無機(jī)鹽種類很多，因細(xì)胞、組織的不同而不同，在所有細(xì)胞中無機(jī)鹽都以離子狀態(tài)存在。,培養(yǎng)用液,二、培養(yǎng)基,（一）、營養(yǎng)成分： 1、氨基酸：主要需要以下12種必須氨基酸，它們都是L型的。 2、單糖：六碳糖是主要的能源，也是合成氨基酸的原料， 吸收能力最強(qiáng)的是葡萄糖、半乳糖最低。 3、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，因此是必不可少的。 4、無機(jī)離子和微量元素： 細(xì)胞生長過程中除需要鈉、鉀、鈣、鎂等基本元素外，還需要一些微量元素，鐵、鋅、錳、鉬等。,培養(yǎng)用液,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)

12、胞生存和生長的溶液,（二）、促生長因子及激素,體內(nèi)生長需要因子的刺激、調(diào)節(jié)，體外同樣需要，愈來愈多的實驗證明各種激素、生長調(diào)節(jié)因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)具有十分重要的作用。,（三）、滲透壓,細(xì)胞必須生活在等滲的環(huán)境中，大多數(shù)細(xì)胞對滲透壓有一定的耐受性。人血漿的滲透壓是290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。對于大多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞，滲透壓在260320mOsm/kg的范圍內(nèi)都適宜。,（四）、pH,大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.27.4，偏離此范圍對細(xì)胞產(chǎn)生有害影響，培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力。造成培養(yǎng)基pH波動的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2, 在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與

13、水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為了解決這一問題，合成培養(yǎng)基中采用了NaHCO3-CO3緩沖系統(tǒng)，并采用開放式培養(yǎng)的方式，使細(xì)胞產(chǎn)生的CO2及時逸出培養(yǎng)器皿，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中的CO2氣體的濃度（5%），使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。,NaHCO3+H2O Na+ +HO+H2O+CO2,（五）、無毒、無污染,體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)無任何抵抗力。因此，培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染、無其他對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染。,培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：營養(yǎng)成分

14、豐富，培養(yǎng)效果好。 缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。,（六）、培養(yǎng)基的種類,合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 。 缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。,水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)

15、酸堿度等重要作用。 配液時注意：（1）用水；配制先后順序；稱量，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等。（2）物質(zhì)的純度，常用的純度有優(yōu)級純(特級純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種。（3）物質(zhì)的可溶性，避免沉淀析出。（4）物質(zhì)的穩(wěn)定性，如葡萄糖只能在10磅下維持1520分鐘。（5）貯存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時混合和稀釋，過濾除菌備用。 常用的緩沖液：生理鹽水、PB、PBS(注意有無鈣鎂離子)、 Hanks液（含有鈣鎂離子、葡萄糖、酚紅）,細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制,pH調(diào)節(jié)液 (1)碳酸氫鈉液 可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過濾

16、除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4冰箱保存。市售有5%10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過程中或超過要求值時，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。 (2)Hepes緩沖液 是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值較長時間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為1015mmol/L。配制時，稱取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過濾除菌分裝小瓶中，4冰箱保存。,消化液 (1) 胰蛋白酶溶液， 一種黃白色粉末，易受潮，應(yīng)密封放置陰暗干燥處。它的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開來。常用濃度

17、為0.25%或5%胰蛋白酶。 (2) EDTA(乙烯二胺與乙酸或Versene)溶液 EDTA是一種化學(xué)螯合劑，毒性小，對貼壁細(xì)胞有離散作用。一般使用濃度為0.02%。稱0.1gVersene溶解于500ml無鈣鎂離子磷酸緩沖液中，15磅30分鐘高壓滅菌，4或室溫保存。 (3) 胰蛋白酶EDTA的配制 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4ml，無鈣鎂離子緩沖液100ml。,抗生素溶液 在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100g 。 配制時取青霉素1106和鏈霉素1106g,溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量為青霉素1104U/ml，鏈霉素1

18、104g/ml，使用時每100ml培養(yǎng)液中加入0.51ml。,慶大霉素：每毫升100單位-方便、廣譜、穩(wěn)定。,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95 血清 5一20 碳酸氫鈉 2.0 g/L 青、鏈霉素 各100單位毫升,完全培養(yǎng)基的組成,血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）； 多種金屬離子； 激素；各種生長因子； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 胰酶抑制因子； 轉(zhuǎn)移蛋白； 不明成分。,血 清,血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。 血

19、清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘。 血清的消毒：過濾除菌。,血清的使用,一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加10血清。 對于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。 血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。,血清的作用,無血清培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù),一、無 菌 技 術(shù),微生物污染一直是細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題。

20、,無菌程度梯度示意圖,培養(yǎng)室的滅菌,實驗人員的無菌準(zhǔn)備,工作面無菌原則,正確的工作臺面布局,物品在工作臺中部潔凈區(qū)圍成新月狀，酒精燈位于中央。,保持臺面整齊,Good！,Bad！,無菌操作,凡是帶入超凈工作臺內(nèi)瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面 靠近酒精燈火焰操作。 玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必須過火滅菌 打開和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。 無菌級別高的物品不能觸碰無菌級別低的物品。手不能從敞開的瓶口上方經(jīng)過 各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。 吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。 手握試管、滴管、移液管時盡量遠(yuǎn)離工作端。 盡可能移

21、走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精擦拭臺面。 盡可能減少開蓋時間。 隨時擦去任何溢出物。,無菌操作,傾倒廢液時防止濺起和瓶口回流。 在視野范圍內(nèi)工作。,無菌的思想貫穿到細(xì)胞培養(yǎng)的任何操作步驟,二、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,（一）肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度 （二）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài),培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征,1. 體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,2. 培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,3. 體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類,4. 細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,1. 貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：,成纖維細(xì)胞 上皮型細(xì)胞 游走細(xì)胞型 多型細(xì)胞

22、型,2. 懸浮型：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。,胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細(xì)胞。,成纖維細(xì)胞型：,貼附型,細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。,

23、上皮型細(xì)胞：,游走細(xì)胞型： 呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。 多形細(xì)胞型： 有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。,2. 懸浮型,概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能 特點：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán) 優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)， 易于收獲，可獲得穩(wěn)

24、定狀態(tài) 缺點：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞),細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)課件,73,懸浮細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,1. 培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells） 指細(xì)胞在整個離體培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時間，分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。 2. 組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所謂細(xì)胞“一代”一詞，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。 如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增( Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36

25、次。,概念“代”,細(xì)胞分裂一次？ 錯！ 培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。,細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)課件,77,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),每代貼附生長細(xì)胞的生長過程,游離期 貼壁期 潛伏期 對數(shù)生長期 平臺期,游離: 懸浮,胞質(zhì)回縮, 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形; 吸附: 貼附底物,一般24小時內(nèi)貼壁; 潛伏期: 可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相.,細(xì)胞貼壁過程,細(xì)胞密度：接種的細(xì)胞密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較

26、長。 細(xì)胞類型：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞潛伏期比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短。傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞,一般為624h;原代2496h或更長。單個細(xì)胞快,細(xì)胞大團(tuán)慢,組織塊慢。連續(xù)細(xì)胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(6-24h)比有限細(xì)胞系與正常二倍體細(xì)胞的短。來源：胚胎組織:短,2天可見細(xì)胞生長；成體組織:長。 細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)：不良者慢。 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液, pH, 底物等，不利：污染,有毒； 慢。,滯留時間的長短與：細(xì)胞種類、接種的細(xì)胞密度、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。,初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約2496小時或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅624小時；細(xì)胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增

27、生期。,潛伏期,指數(shù)生長期,停滯期,有絲分裂指數(shù)(MI) : 指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細(xì)胞。一般細(xì)胞的MI約為0.1 0.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3% 5%。 細(xì)胞群體倍增時間： 培養(yǎng)物種中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時間 MTT法： 反映細(xì)胞內(nèi)線粒體中一種酶活性程度 標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入量：反映DNA合成,判斷細(xì)胞生長的指標(biāo)：指數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞分裂活動的程度(增殖活性)可作為判斷細(xì)胞生長是否旺盛的重要指標(biāo)。,1. 初代培養(yǎng) 又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦進(jìn)行

28、傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。 2. 細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無限細(xì)胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。 3. 細(xì)胞株 從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株

29、進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株。,體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類,4. 二倍體細(xì)胞 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75或80以上）的細(xì)胞群，稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同，二倍體細(xì)胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土10代，人胚腎只有810代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞1530代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用，一般在初代或25代即大量凍存作為原種，用時再進(jìn)行繁殖，用

30、后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細(xì)胞的衰老。 5. 遺傳缺陷細(xì)胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。 6. 腫瘤細(xì)胞系或株 這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,HeLa： 為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO： 中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary） 宮-743： 宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）建立；

31、 每3天傳代，每次接種3105細(xì)胞毫升。,細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用,培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、 供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等；凍 存 液：培養(yǎng)基和防凍液名稱；細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性； 培 養(yǎng) 液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量； 細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長特性核 型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無無污染檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH， 以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測細(xì)胞建

32、立者：建立者姓名；檢測者姓名,如：ATCC入庫細(xì)胞要求檢測項目,同時附有照片（高低密度）,細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測,細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒。無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等是主要的污染源。 嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。,肉眼直接觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法,細(xì)菌和真菌的污染和檢測,支原體的污染和檢測,造成支原體高污染率的原因有多種 支原體大小0.10.8 m，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 m ）； 支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 ； 過去缺

33、乏簡單、快速且可靠的檢測方式； 細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實驗室間的相互污染； 研究或操作人員忽略污染問題； 已受污染的細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清 等。,相差顯微鏡觀察法 Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法 DNA熒光染色法 PCR方法 特異引物擴(kuò)增支原體 DNA,支原體的檢測,支原體污染后的抗生素處理: 第一種方法：使用泰樂菌素（tylosin，Sigma)，泰樂菌素是一種獸用抗生素,常用在雞、豬的食料輔料，可以防止支原體感染引起的支氣管哮喘，至今尚未見有耐藥菌株，是治療支原體感染的特效藥。 第二種方法：M-Plasmocin, InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmoci

34、n能有效地殺滅支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細(xì)胞，不會重新感染支原體。 第三種方法：用BM-Cyclin-1/2，效果很好，方法如下：細(xì)胞傳代同時加BM-Cyclin-1 10g/ml，37培養(yǎng)3天，加入BM-Cyclin-2 5 g/ml，37培養(yǎng)3天；（不需傳代，因為支原體污染的細(xì)胞生長非常慢?。┤绻?xì)胞生長恢復(fù)正常，即可結(jié)束。否則加BM-Cyclin-1 20 g/ml，37培養(yǎng)3天，加入BM-Cyclin-2 10 g/ml，37培養(yǎng)3天。懷疑是支原體污染的就可以試試，對細(xì)胞不會有太大影響。,3. 病毒的污染和檢測,細(xì)胞的直接觀察 動物接種檢查 電子顯微鏡觀察 免疫學(xué)檢查 PCR技術(shù),常用抗生素用量和效應(yīng),抗生素,抗菌譜,細(xì)菌 真菌 支原體 常用濃度,青霉素 G+ 100IU/ml 鏈霉素 G- 100g/ml 慶大霉素 G+,G- 200g/ml 四環(huán)素 G+,G- 10g/ml 卡那霉素 G+,G- 50g/ml 兩性霉素 2 g/ml 制霉菌素 25 g/ml,細(xì)胞培養(yǎng)中的研究方法,內(nèi)容提要