PCR技術(shù)及測(cè)序ppt課件

PCR技術(shù)及原理,PCR反應(yīng)原理,PCR技術(shù)是利用DNA在體外高溫時(shí)破壞氫鍵，變性成單鏈，低溫時(shí)引物與單鏈按堿基配對(duì)原則結(jié)合，再調(diào)溫至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5-3）的方向合成互補(bǔ)鏈。即：,PCR反應(yīng)過程,熒光定量PCR,熒光定量PCR是在一般PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)加入特異性熒光探針（寡核苷酸）兩段分別標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，擴(kuò)增時(shí)Taq聚合酶5-3外切酶活性將熒光基團(tuán)酶切降解，使之分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)收到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與產(chǎn)物形成完全同步。,基因測(cè)序技術(shù),1.第一代：Sanger鏈終止法、Gilbert化學(xué)降解法2.第二代：454、Illumina、SOLiD3.第三代：HelicoBioSciencePacificBioscienceSMRTTOxfordNanoporeTechnologiesIonTorrent,Sanger鏈終止法測(cè)序原理,由于ddNTP的2和3都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP，ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列。,Gilbert化學(xué)降解法測(cè)序原理,用特異的化學(xué)試劑修飾DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈。該法設(shè)計(jì)四組特異的反應(yīng)：G反應(yīng)，用硫酸二甲酯使鳥嘌呤上的N7甲基化，加熱引起甲基化鳥嘌呤脫落，導(dǎo)致多核苷酸鏈可在該處斷裂；G+A反應(yīng)，用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂；T+C反應(yīng)，用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基；C反應(yīng)，在有鹽存在時(shí)，只有C與肼反應(yīng)，并被哌啶除去。這樣一來，同一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在四組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別得到部分降解，每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某一種或某一類堿基，生成四組放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)，每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA全片段上的位置。最后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離此后組產(chǎn)物，再從放射自顯影片上即可讀出序列。,454測(cè)序,1.文庫制備：454測(cè)序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測(cè)DNA打斷成300-800bp長(zhǎng)的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y(cè)DNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫,454測(cè)序,2.乳液PCR：將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”（水包油），基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)磁珠。這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結(jié)合在磁珠上。同時(shí)孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，所以保證了每個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都能獨(dú)立進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進(jìn)過擴(kuò)增，每個(gè)小片段都將被擴(kuò)增約100萬倍，從而達(dá)到下一步測(cè)序所要求的DNA量。,454測(cè)序,3.焦磷酸測(cè)序：測(cè)序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)磁珠，通過這種方法來固定每個(gè)磁珠的位置，以便檢測(cè)接下來的測(cè)序反應(yīng)過程。測(cè)序方法采用焦磷酸測(cè)序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測(cè)序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測(cè)序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)處理而獲得最終的測(cè)序結(jié)果。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測(cè)分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會(huì)在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測(cè)序反應(yīng)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。,Illumina測(cè)序,1.文庫構(gòu)建：利用超聲波把待測(cè)的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長(zhǎng)的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。2.Flowcell:當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時(shí)候會(huì)隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上。每個(gè)Flowcell有8個(gè)channel，每個(gè)channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對(duì)，并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。,Illumina測(cè)序,3.橋式PCR擴(kuò)增與變性：橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個(gè)束都含有單個(gè)DNA模板的很多份拷貝，進(jìn)行這一過程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號(hào)強(qiáng)度放大，以達(dá)到測(cè)序所需的信號(hào)要求。4.測(cè)序：向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測(cè)序法）。這些dNTP的3-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能添加一個(gè)dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基。這樣熒光信號(hào)記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP3-OH保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測(cè)序反應(yīng)。,SOLiD測(cè)序,1.文庫構(gòu)建：片段打斷并在片段兩端加上測(cè)序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。2.EmulsionPCR：Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsionPCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um。在擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測(cè)序過程作的準(zhǔn)備。3修飾的微珠會(huì)被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域。3.連接酶測(cè)序：Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡(jiǎn)單表示為：3-XXnnnzzz-5。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5末端分別標(biāo)記了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測(cè)序法，兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基。這種測(cè)序方法也稱之為兩堿基測(cè)序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對(duì)而連接上時(shí)，就會(huì)發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號(hào)，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號(hào)后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號(hào)，以便進(jìn)行下一個(gè)位置的測(cè)序。不過值得注意的是，通過這種測(cè)序方法，每次測(cè)序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位在測(cè)到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進(jìn)行第二輪測(cè)序。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對(duì)的位置上相差一個(gè)堿基（圖6-a.8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測(cè)序位置往3端移動(dòng)一個(gè)堿基位置，因而就能測(cè)定第0、1位和第5、6位第二輪測(cè)序完成，依此類推，直至第五輪測(cè)序，最終可以完成所有位置的堿基測(cè)序，并且每個(gè)位置的堿基均被檢測(cè)了兩次。,SOLiD測(cè)序示意圖,HelicoBioScience,該測(cè)序是基于邊合成邊測(cè)序的思想，將待測(cè)序列隨機(jī)打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在3末端加上poly(A),以及在poly(A)的末端進(jìn)行熒光標(biāo)記和阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測(cè)序的位點(diǎn)加入聚合酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進(jìn)行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對(duì)Cy3成像，觀測(cè)模板位點(diǎn)上是否有熒光信號(hào)，然后化學(xué)裂解核苷酸上的燃料并釋放。加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。,PacificBioscienceSMRTT,該測(cè)序也是基于邊合成邊測(cè)序的原理，這項(xiàng)技術(shù)使用Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級(jí)波導(dǎo))。測(cè)序的過程：被熒光標(biāo)記磷酸基團(tuán)的核苷酸在聚合酶活性位點(diǎn)上與模板鏈結(jié)合（每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標(biāo)記），被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標(biāo)記的磷酸集團(tuán)被切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個(gè)位置，下一個(gè)脫氧核苷酸連接到位點(diǎn)上開始釋放熒光脈沖，進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。,OxfordNanoporeTechnologies,大多數(shù)納米孔測(cè)序技術(shù)的基本原理是當(dāng)DNA分子或者它的組成堿基從一個(gè)孔洞經(jīng)過時(shí)而檢測(cè)到被影響的電流或光信號(hào)。OxfordNanopore測(cè)序技術(shù)是以-溶血素來構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的外表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價(jià)結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個(gè)系統(tǒng)被鑲嵌在一個(gè)脂雙分子層內(nèi)，為了提供既符合堿基區(qū)分檢測(cè)又滿足外切酶活性的物理?xiàng)l件，脂雙分子層兩側(cè)為不同的鹽濃度在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流，腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號(hào)大小很相近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留是時(shí)間是其他核苷酸的2-3倍，所以每個(gè)堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是