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第六屆“挑戰(zhàn)杯”廣東省大學生課外學術科技作品競賽獲獎作品陽東縣馬鈴薯病毒病田間調查及病毒基因克隆、序列分析、RT-PCR檢測許東林 蔡艷清摘 要：廣東省陽東縣大田馬鈴薯植株發(fā)生典型的卷葉病毒病癥狀，其株發(fā)病率為31.5%69.0%。采用RT-PCR反應對從病葉組織中提取的總RNA進行擴增，再對擴增產物DNA進行克隆及序列測定，并根據(jù)所測DNA序列中一個長為627bp的開讀框（編碼208個氨基酸）確認其為馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）的外殼蛋白（CP）基因。比較表明，PLRV陽東分離物CP基因與已報道的法國Noir株系、中國河北分離物、中國福建分離物、南非分離物等的CP基因高度同源，其核苷酸序列的同源率分別為100%、100%、99%、96%。同源率比較的結果可用于推測PLRV的可能傳播渠道。本研究設計并合成了4對寡聚核苷酸引物，從中篩選出了一個最佳引物對（P1: 5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3及P2-1: 5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-3）， 經一步法RT-PCR能夠準確、 高靈敏度地對病葉組織中PLRV進行快速檢測。對陽東縣的種薯進行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，有60%的種薯帶有PLRV，由此證實了種薯帶毒。關鍵詞：馬鈴薯卷葉病毒；外殼蛋白基因；分子檢測；RT-PCR馬鈴薯在種植生長過程中可受到多種病毒侵染，各種病毒在種薯中不斷積累，經無性繁殖數(shù)代后，種薯幾乎會100帶病毒，由此造成馬鈴薯產量逐年下降，品質變劣，“種性退化”，損失巨大1，3。目前馬鈴薯病毒病的主要防治措施是種植無毒種薯。而在種薯的脫毒生產中，對其進行病毒檢測以確定所生產的種薯是否帶病毒，是一道重要的工序。研究馬鈴薯病毒的檢測和鑒定技術，對馬鈴薯生產有著重要的意義。本研究對廣東省陽東縣的馬鈴薯病毒病進行了田間調查，并對其主要病原馬鈴薯卷葉病毒(PLRV) 外殼蛋白基因進行了克隆、序列分析，建立了PLRV 的RT-PCR檢測方法，對該縣種薯帶病毒情況進行了檢測。1 田間調查2002年秋末，廣東省陽東縣大溝鎮(zhèn)、雅韶鎮(zhèn)等地利用水稻冬閑田種植馬鈴薯，在其生長早期即發(fā)現(xiàn)部分植株生長異常，至生長中期表現(xiàn)出明顯的病毒病癥狀。因此我們于2003年1月27日對上述兩鎮(zhèn)種植的馬鈴薯進行了田間病情調查。1.1 病株癥狀表現(xiàn)發(fā)病植株大多黃化、矮化、僵直，生長不良。大部分病株下部葉片向上卷曲，直至呈筒狀，而上部葉片形狀基本正常。嚴重者整株葉片卷曲成筒狀。卷曲的病葉變得僵硬，手握可發(fā)出如紙片磨擦般的響聲。部分病葉沿葉脈變褐，呈褐色網紋狀；少數(shù)病葉有褐色斑點。部分病株葉柄及莖桿有褐色條斑。各類型癥狀見附錄I。1.2 病株田間分布病株在田間呈隨機分布，沒有明顯的發(fā)病中心，田塊邊緣和田塊中央沒有發(fā)病率的差異。1.3 不同田塊株發(fā)病率對陽東縣2個鎮(zhèn)連片種植的馬鈴薯田塊進行了調查，結果見表1。在所調查的6塊田中，所有田塊均有病毒病發(fā)生，株發(fā)病率為31.569.0%，田塊間發(fā)病率差異主要是由肥水管理差異所造成的。表1. 陽東縣馬鈴薯病毒病田間株發(fā)病率調查（2003年1月27日，生長中期）調查地點連片種植面積（畝）調查類型田病株率（病株數(shù)/調查株數(shù)）大溝鎮(zhèn)新梨洞村500長勢較差402%（172/410）長勢較好396%（120/303）長勢良好318%（96/302）長勢中等690%（181/263）雅韶鎮(zhèn)200長勢良好315%（252/801）長勢差417%（263/631）1.4 初步診斷與已有資料2對比，被調查的馬鈴薯病株大多呈現(xiàn)典型的卷葉病毒病癥狀。由于田間發(fā)病早，病株率較高，病株田間分布為分散型，沒有明顯的發(fā)病中心；種植田周邊也不具備大面積的馬鈴薯卷葉病毒轉主寄主（番茄、煙草等）作物。據(jù)此初步判斷廣東省陽東縣馬鈴薯可能是受到種薯傳帶的馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus, PLRV）為害。為了進一步確證病毒病原及種薯帶毒情況，我們進行了病毒基因分析及種薯帶毒分子檢測試驗。2 病毒基因克隆及序列分析根據(jù)田間調查結果，可以推測廣東省陽東縣馬鈴薯病毒病可能是由馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）引起的。由于PLRV不能經機械摩擦傳播，寄主范圍較窄（除馬鈴薯外，只能侵染番茄、煙草等少數(shù)幾種植物），通過寄主范圍測定法很難對其進行鑒定；PLRV僅存在于寄主植物的韌皮部，感病植物體內的病毒含量非常低，血清學方法也很難對其進行診斷鑒定1，3。為了確定該病的病原，并獲得有關此病原更詳細的資料，我們對發(fā)病植株體內病毒基因進行了克隆和序列分析。 2.1材料與方法211 引物設計與合成因為PLRV外殼蛋白（coat protein, CP）基因最為保守，我們根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫（GenBank）已報道的PLRV基因組序列，在病毒CP基因兩側設計和合成（交由大連寶生物工程公司合成）了DNA引物，上游引物P1：5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3，下游引物P2：5-AGTTCTGGTTCTCGTCCTC-3，以擴增PLRV CP基因，預期擴增DNA片段長度為960bp。212 樣品制備采集表現(xiàn)典型卷葉癥狀的病株上部初卷葉片，采用UNOQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）抽提葉組織總RNA，以健康無癥植株葉片為對照。具體步驟為：剪取50mg病葉組織，置于研缽中，加入適量液氮研磨成粉狀，加入0.5ml Trizol溶液，稍作研磨，研磨液轉入1.5ml離心管中，加300l氯仿異戊醇（241），充分振蕩，12,000rpm離心5min，取上清液轉入無菌無RNA酶污染的1.5ml離心管中，加1/3體積無水乙醇，混勻，將全部溶液轉入套放于收集管內的UNOQ-10柱中，室溫放置2分鐘，8,000rpm離心1分鐘，小心取出UNOQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將UNOQ-10柱放回收集管中，加入450l RPE溶液，10,000rpm離心30秒，小心取出UNOQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將UNOQ-10柱放回收集管中，10,000rpm離心15秒，小心取出UNOQ-10柱，將其放入到無菌無RNA酶污染的1.5ml離心管中，在柱內膜的中央小心加入50l 無RNA酶污染的水，室溫放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘，離心管內的溶液即為RNA樣品液。立即使用或置-70貯存?zhèn)溆谩?13 RT-PCR反應RT-PCR反應采用TaKaRa one step RNA PCR kit(AMV)進行，25l反應體積內含RNA樣品液1l，10buffer 2.5l，25mmol/L MgCl2 5l，10mmol/L dNTPs 2.5l，Rnase inhibitor(40U/l )0.5l，AMV-Optimized Taq 0.5l，AMV RtaseXL(5 U/l )0.5l，引物P1、P2各1l，補無RNA酶污染的雙蒸水至25l，反應液上覆蓋石蠟油15l，置于Biometra公司UNO熱循環(huán)儀上按下述程序進行反應：47反轉錄30min；942min滅活反轉錄酶；940.5min，55 0.5min，72 1.5 min，30個循環(huán)；72延伸10 min。214 RT-PCR產物電泳及回收取RT-PCR反應產物10l，加2l 6上樣緩沖液（0.25%溴酚蘭，40蔗糖水溶液），混勻，點入1.2瓊脂糖凝膠（含0.5g/ml EB）上樣孔中,以2，000bp ladder DNA ( Biolabs 公司產品)為分子量標準，用0.5TBE緩沖液（0.045 mmol/L Tris-硼酸，1.0 mmol/L EDTA，pH8.0）在5V/cm電場強度下電泳約1hr，于UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相。根據(jù)分子量大小判斷目的片段，并切膠回收其中的DNA分子。采用上海生工生物工程技術服務有限公司 提供的試劑盒回收DNA。215 RT-PCR產物克隆及測序電泳回收的DNA分子克隆于pMD 18-T載體，采用雙脫氧鏈末端終止法用M13-47（5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3）和RV-M（5-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3）引物分別從兩端在ABI PRISMTM377XL DNA測序儀上對重組質粒進行測序，克隆和測序交由大連寶生物工程有限公司進行。22 結果與分析221 RT-PCR產物電泳結果病葉總RNA抽提液經RT-PCR反應均能獲得預期大小的DNA電泳帶，不同樣品電泳帶強弱存在差異，可能與樣品抽提質量有關。健康植株對照樣品無任何擴增電泳帶（見圖1）。 1 2 3 4 5 6 7 8圖1. 引物P1、P2對馬鈴薯卷葉病株葉組織總RNA RT-PCR產物電泳結果1:健葉對照, 2,3,4,5,6,7:病葉總RNA擴增產物, 8:DNA分子量標準222 RT-PCR產物克隆測序結果測序結果表明，所獲得的RT-PCR產物全長960bp，所克隆片段的正義鏈核苷酸序列如下：C,CTCGTTACAT,CAACCGGACA,AAATAGATTA,TAAATTCTTA,GCGGGATTTG,CTTTAGGATT,TTCATCCGCA,ATCCCATTTT,CAGTAGCCGG,TTTATATTTT,GTTTACCTAA,AGATTTCCTC,CCACGTGCGA,TCAATTGTTA,ATGAGTACGG,TCGTGGTTAA,AGGAAATGTC,AATGGTGGTG,TACAACAACC,AAGAAGGCGA,AGAAGGCAAT,CCCTTCGCAG,CGCGCTAAC,AGAGTTCAGC,CAGTGGTTAT,GGTCACGGCC,CCTGGGCAAC,CCAGGCGCCG,AAGACGTAGA,AGAGGAGGCA,ATCGCCGCTC,AAGAAGAACT,GGAGTTCCCC,GAGGACGAGG,CTCAAGCGAG,ACATTCGTGT,TTACAAAGGA,CAACCTCATG,GGCAACTCCC,AGGAAGTTT,CACCTTCGGG,CCGAGTCTAT,CAGACTGTCC,GGCATTCAAG,GATGGAATAC,TCAAGGCCTA,CCATGAGTAT,AAGATCACAA,GCATCTTACT,TCAGTTCGTC,GCGAGGCCT,CTTCCACCTC,CTCCGGCTCC,ATCGCTTATG,AGTTGGACCC,CCATTGCAAA,GTATCATCCC,TCCAGTCCTA,CGTCAACAAG,TTCCAAATTA,CGAAGGGCGG,CGCCAAAACT,TATCAAGCGC,GGATGATAAA,CGGGGTAGAA,TGGCACGATT,CTTCTGAGGA,TCAGTGCCGG,ATACTGTGGA,AGGGAAATGG,AAAATCTTCA,GATACCGCAG,GATCCTTCAG,AGTCACCATC,AGGGTGGCTT,TGCAAAACCC,CAAATAGGTA,GACTCCGGAT,CAGAGCCTGG,TCCAAGCCCA,CAACCAACAC,CCACTCCAAC,TCCCCAGAAA,CACGAGCGAT,TTATTGCTTA,CGTTGGCATA,CCTATGCTAA,CCATTCAGGC,CAGGGAGAAC,GATGACCAAA,TCATATTGGG,TTCCTTAGGG,AACCAAAGGA,TGAAATATAT,AGAGGACGAG,ACCAGAACT 可見第142位有一個翻譯起始密碼ATG，第767位有一個翻譯終止密碼TAG，構成了一個627bp的開讀框，該開讀框推導產生208個氨基酸殘基的蛋白質產物。該開讀框即為馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白（coat protein, 簡稱CP）基因。223 馬鈴薯卷葉病毒陽東分離物CP基因序列分析由測序結果可知，我們從陽東縣馬鈴薯病株組織中克隆到了馬鈴薯卷葉病毒 CP基因，因而將發(fā)生于陽東縣的馬鈴薯病毒命名為PLRV陽東分離物。將所測定的PLRV陽東分離物CP基因序列與基因數(shù)據(jù)庫（GenBank）中已報道的基因序列進行比較，結果表明，PLRV陽東分離物CP基因與世界各地已報道的PLRV各株系或分離物CP基因高度同源：與分離自法國的Noir株系及中國河北張家口分離物完全相同；與中國福建分離物部分序列同源率為99%（611/617）；與南非分離物同源率最低，為96%(608/627)。表2列出了幾個具代表性株系或分離物的比較結果。表2. PLRV陽東分離物與部分已報道的PLRV株系或分離物CP基因序列同源性比較PLRV株系或分離物NoirZhamgjiakouFujian CanadianCU87Zim13V4AustalianSouth Africa地理來源法國中國中國加拿大古巴津巴布韋蘇格蘭澳大利亞南非與陽東分離物同源率100100*99999999989796*文獻報道的張家口分離物與陽東分離物存在1個核苷酸差異，但該核苷酸是由該文獻的作者通過PCR引物人為引入的，因此我們不認為其為真實差異。3 馬鈴薯卷葉病毒分子檢測通過對病毒基因序列的分析，我們確定引起陽東縣馬鈴薯病毒病的主要病原為PLRV，而種薯帶毒是其主要傳播方式之一，為此我們建立了PLRV分子檢測技術并對部分種薯進行了檢測。3. 1 檢測方法的建立311 RT-PCR引物的設計與合成根據(jù)所測定的PLRV陽東分離物CP基因及其上、下游核苷酸序列，設計并合成了4條寡聚核苷酸引物，分別組成4個引物對，用以對PLRV基因組相應片段進行擴增。引物所在位置、序列及其預期擴增片段大小如下：P1-1P2-1P2P1CP基因圖2 PLRV RT-PCR檢測引物設計其中：P1：5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3P1-1：5-GAGTTCAGCCAGTGGTTATG-3P2：5-AGTTCTGGTTCTCGTCCTC-3P2-1：5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-34條引物共組成4個引物對，其預期擴增片段大小為P1P2： 960bpP1P2-1： 584bpP1-1P2： 728bpP1-1P2-1： 362bp312 RT-PCR檢測最佳引物對篩選樣品處理、RT-PCR擴增及產物電泳均按2.1.2、2.1.3、2.1.4所述進行。用病葉組織總RNA抽提液為模板，采用不同的引物對進行RT-PCR擴增，結果見圖3。由圖3可知，所設計的4對引物都能擴增PLRV目的片段，但引物對P1-1P2及P1P2產物量太少(泳道2,4)，易受樣品質量影響 1 2 3 4 5 圖3. 不同引物對擴增PLRV基因組相應片段的效果泳道1,2,3,4:分別為引物對P1-1P2-1,P1-1P2,P1P2-1,P1P2擴增產物; 泳道5:DNA分子量標準（見圖1）；引物對P1-1P2-1有一些較弱的非目的片段擴增產物(泳道1)；引物對P1P2-1產物電泳帶最為單一、明亮(泳道3)，適合用做病毒檢測。313 引物對P1與P2-1檢測PLRV的靈敏度將病株葉片總RNA抽提樣品用無RNA酶污染的雙蒸水進行10倍系列稀釋，用不同稀釋度的RNA抽提液為模板，以P1、P2-1為引物進行RT-PCR擴增。結果（圖4）表明，引物對P1與P2-1檢測PLRV的靈敏度為10-5總RNA抽提液，相當于可檢出10-5mg（十萬分之一毫克）馬鈴薯病葉組織中所含的病毒。32 種薯樣品的處理及檢測321 種薯的處理馬鈴薯種薯由陽東縣農業(yè)局提供。取種薯塊莖用自來水洗凈，按芽眼切成適度大小的薯塊，每個種薯取一個薯塊，播種于磁盤里河沙中，置于光照培養(yǎng)箱中28每天12小時光照保濕培養(yǎng)，約2-3周后馬鈴薯幼苗長出4-6片葉，取幼嫩的平展葉片進行病毒檢測。322 樣品檢測結果按照前述方法抽提樣品組織總RNA，以引物P1、P2-1進行RT-PCR擴增，電泳結果表明，在所檢測的30個樣品中，有18個樣品發(fā)生了目的片段擴增（見圖5），也即在60%的種薯中檢測到了馬鈴薯卷葉病毒。 1 2 3 4 5 6 7 8圖4. 引物對P1、P2檢測馬鈴薯病毒葉中PLRV的靈敏度1. 7: 病葉總RNA抽提液稀釋10-6, 10-5,10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100擴增產物, 8: DNA分子量標準1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16圖5. 馬鈴薯種薯攜帶PLRV檢測結果1- 15泳道:樣品擴增產物, 16泳道:DNA分子量標準4 結論與討論4.1 田間調查顯示，廣東省陽東縣大田種植的馬鈴薯30%以上的植株表現(xiàn)出典型的卷葉病毒病癥狀，嚴重田塊病株率接近70%。病株在田間呈隨機分布。田塊之間的病株率存在差異，可能與管理水平的不同有關。 4.2利用基因克隆及序列分析的方法，確認該病的病原為馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）。 4.3為了建立PLRV的RT-PCR分子檢測技術，設計與合成了4對寡聚核苷酸引物，經一步法RT-PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明引物對P1: 5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3與P2-1: 5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-3的檢測效果最佳。該引物對檢測PLRV的靈敏度為10-5mg病葉組織中的病毒，RT-PCR產物呈明亮的單一電泳條帶。 4.4從病株癥狀、田間分布、發(fā)病時間及發(fā)病率等調查結果推斷該病的發(fā)生極可能是播種帶毒種薯所致。我們采用RT-PCR檢測技術，對陽東縣農業(yè)局提供的馬鈴薯塊莖（經培養(yǎng)長出幼葉）進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)60%的種薯帶有PLRV，證實了以上推斷。 4.5 基因序列分析揭示，陽東縣PLRV CP基因與分離自法國的Noir株系以及我國河北張家口分離物完全相同；而與我