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第六屆“挑戰(zhàn)杯”廣東省大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽獲獎(jiǎng)作品陽(yáng)東縣馬鈴薯病毒病田間調(diào)查及病毒基因克隆、序列分析、RT-PCR檢測(cè)許東林 蔡艷清摘 要：廣東省陽(yáng)東縣大田馬鈴薯植株發(fā)生典型的卷葉病毒病癥狀，其株發(fā)病率為31.5%69.0%。采用RT-PCR反應(yīng)對(duì)從病葉組織中提取的總RNA進(jìn)行擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA進(jìn)行克隆及序列測(cè)定，并根據(jù)所測(cè)DNA序列中一個(gè)長(zhǎng)為627bp的開(kāi)讀框（編碼208個(gè)氨基酸）確認(rèn)其為馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）的外殼蛋白（CP）基因。比較表明，PLRV陽(yáng)東分離物CP基因與已報(bào)道的法國(guó)Noir株系、中國(guó)河北分離物、中國(guó)福建分離物、南非分離物等的CP基因高度同源，其核苷酸序列的同源率分別為100%、100%、99%、96%。同源率比較的結(jié)果可用于推測(cè)PLRV的可能傳播渠道。本研究設(shè)計(jì)并合成了4對(duì)寡聚核苷酸引物，從中篩選出了一個(gè)最佳引物對(duì)（P1: 5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3及P2-1: 5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-3）， 經(jīng)一步法RT-PCR能夠準(zhǔn)確、 高靈敏度地對(duì)病葉組織中PLRV進(jìn)行快速檢測(cè)。對(duì)陽(yáng)東縣的種薯進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有60%的種薯帶有PLRV，由此證實(shí)了種薯帶毒。關(guān)鍵詞：馬鈴薯卷葉病毒；外殼蛋白基因；分子檢測(cè)；RT-PCR馬鈴薯在種植生長(zhǎng)過(guò)程中可受到多種病毒侵染，各種病毒在種薯中不斷積累，經(jīng)無(wú)性繁殖數(shù)代后，種薯幾乎會(huì)100帶病毒，由此造成馬鈴薯產(chǎn)量逐年下降，品質(zhì)變劣，“種性退化”，損失巨大1，3。目前馬鈴薯病毒病的主要防治措施是種植無(wú)毒種薯。而在種薯的脫毒生產(chǎn)中，對(duì)其進(jìn)行病毒檢測(cè)以確定所生產(chǎn)的種薯是否帶病毒，是一道重要的工序。研究馬鈴薯病毒的檢測(cè)和鑒定技術(shù)，對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)有著重要的意義。本研究對(duì)廣東省陽(yáng)東縣的馬鈴薯病毒病進(jìn)行了田間調(diào)查，并對(duì)其主要病原馬鈴薯卷葉病毒(PLRV) 外殼蛋白基因進(jìn)行了克隆、序列分析，建立了PLRV 的RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)該縣種薯帶病毒情況進(jìn)行了檢測(cè)。1 田間調(diào)查2002年秋末，廣東省陽(yáng)東縣大溝鎮(zhèn)、雅韶鎮(zhèn)等地利用水稻冬閑田種植馬鈴薯，在其生長(zhǎng)早期即發(fā)現(xiàn)部分植株生長(zhǎng)異常，至生長(zhǎng)中期表現(xiàn)出明顯的病毒病癥狀。因此我們于2003年1月27日對(duì)上述兩鎮(zhèn)種植的馬鈴薯進(jìn)行了田間病情調(diào)查。1.1 病株癥狀表現(xiàn)發(fā)病植株大多黃化、矮化、僵直，生長(zhǎng)不良。大部分病株下部葉片向上卷曲，直至呈筒狀，而上部葉片形狀基本正常。嚴(yán)重者整株葉片卷曲成筒狀。卷曲的病葉變得僵硬，手握可發(fā)出如紙片磨擦般的響聲。部分病葉沿葉脈變褐，呈褐色網(wǎng)紋狀；少數(shù)病葉有褐色斑點(diǎn)。部分病株葉柄及莖桿有褐色條斑。各類型癥狀見(jiàn)附錄I。1.2 病株田間分布病株在田間呈隨機(jī)分布，沒(méi)有明顯的發(fā)病中心，田塊邊緣和田塊中央沒(méi)有發(fā)病率的差異。1.3 不同田塊株發(fā)病率對(duì)陽(yáng)東縣2個(gè)鎮(zhèn)連片種植的馬鈴薯田塊進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果見(jiàn)表1。在所調(diào)查的6塊田中，所有田塊均有病毒病發(fā)生，株發(fā)病率為31.569.0%，田塊間發(fā)病率差異主要是由肥水管理差異所造成的。表1. 陽(yáng)東縣馬鈴薯病毒病田間株發(fā)病率調(diào)查（2003年1月27日，生長(zhǎng)中期）調(diào)查地點(diǎn)連片種植面積（畝）調(diào)查類型田病株率（病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)）大溝鎮(zhèn)新梨洞村500長(zhǎng)勢(shì)較差402%（172/410）長(zhǎng)勢(shì)較好396%（120/303）長(zhǎng)勢(shì)良好318%（96/302）長(zhǎng)勢(shì)中等690%（181/263）雅韶鎮(zhèn)200長(zhǎng)勢(shì)良好315%（252/801）長(zhǎng)勢(shì)差417%（263/631）1.4 初步診斷與已有資料2對(duì)比，被調(diào)查的馬鈴薯病株大多呈現(xiàn)典型的卷葉病毒病癥狀。由于田間發(fā)病早，病株率較高，病株田間分布為分散型，沒(méi)有明顯的發(fā)病中心；種植田周邊也不具備大面積的馬鈴薯卷葉病毒轉(zhuǎn)主寄主（番茄、煙草等）作物。據(jù)此初步判斷廣東省陽(yáng)東縣馬鈴薯可能是受到種薯傳帶的馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus, PLRV）為害。為了進(jìn)一步確證病毒病原及種薯帶毒情況，我們進(jìn)行了病毒基因分析及種薯帶毒分子檢測(cè)試驗(yàn)。2 病毒基因克隆及序列分析根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，可以推測(cè)廣東省陽(yáng)東縣馬鈴薯病毒病可能是由馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）引起的。由于PLRV不能經(jīng)機(jī)械摩擦傳播，寄主范圍較窄（除馬鈴薯外，只能侵染番茄、煙草等少數(shù)幾種植物），通過(guò)寄主范圍測(cè)定法很難對(duì)其進(jìn)行鑒定；PLRV僅存在于寄主植物的韌皮部，感病植物體內(nèi)的病毒含量非常低，血清學(xué)方法也很難對(duì)其進(jìn)行診斷鑒定1，3。為了確定該病的病原，并獲得有關(guān)此病原更詳細(xì)的資料，我們對(duì)發(fā)病植株體內(nèi)病毒基因進(jìn)行了克隆和序列分析。 2.1材料與方法211 引物設(shè)計(jì)與合成因?yàn)镻LRV外殼蛋白（coat protein, CP）基因最為保守，我們根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）已報(bào)道的PLRV基因組序列，在病毒CP基因兩側(cè)設(shè)計(jì)和合成（交由大連寶生物工程公司合成）了DNA引物，上游引物P1：5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3，下游引物P2：5-AGTTCTGGTTCTCGTCCTC-3，以擴(kuò)增PLRV CP基因，預(yù)期擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度為960bp。212 樣品制備采集表現(xiàn)典型卷葉癥狀的病株上部初卷葉片，采用UNOQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）抽提葉組織總RNA，以健康無(wú)癥植株葉片為對(duì)照。具體步驟為：剪取50mg病葉組織，置于研缽中，加入適量液氮研磨成粉狀，加入0.5ml Trizol溶液，稍作研磨，研磨液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加300l氯仿異戊醇（241），充分振蕩，12,000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌無(wú)RNA酶污染的1.5ml離心管中，加1/3體積無(wú)水乙醇，混勻，將全部溶液轉(zhuǎn)入套放于收集管內(nèi)的UNOQ-10柱中，室溫放置2分鐘，8,000rpm離心1分鐘，小心取出UNOQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將UNOQ-10柱放回收集管中，加入450l RPE溶液，10,000rpm離心30秒，小心取出UNOQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將UNOQ-10柱放回收集管中，10,000rpm離心15秒，小心取出UNOQ-10柱，將其放入到無(wú)菌無(wú)RNA酶污染的1.5ml離心管中，在柱內(nèi)膜的中央小心加入50l 無(wú)RNA酶污染的水，室溫放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘，離心管內(nèi)的溶液即為RNA樣品液。立即使用或置-70貯存?zhèn)溆谩?13 RT-PCR反應(yīng)RT-PCR反應(yīng)采用TaKaRa one step RNA PCR kit(AMV)進(jìn)行，25l反應(yīng)體積內(nèi)含RNA樣品液1l，10buffer 2.5l，25mmol/L MgCl2 5l，10mmol/L dNTPs 2.5l，Rnase inhibitor(40U/l )0.5l，AMV-Optimized Taq 0.5l，AMV RtaseXL(5 U/l )0.5l，引物P1、P2各1l，補(bǔ)無(wú)RNA酶污染的雙蒸水至25l，反應(yīng)液上覆蓋石蠟油15l，置于Biometra公司UNO熱循環(huán)儀上按下述程序進(jìn)行反應(yīng)：47反轉(zhuǎn)錄30min；942min滅活反轉(zhuǎn)錄酶；940.5min，55 0.5min，72 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72延伸10 min。214 RT-PCR產(chǎn)物電泳及回收取RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物10l，加2l 6上樣緩沖液（0.25%溴酚蘭，40蔗糖水溶液），混勻，點(diǎn)入1.2瓊脂糖凝膠（含0.5g/ml EB）上樣孔中,以2，000bp ladder DNA ( Biolabs 公司產(chǎn)品)為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用0.5TBE緩沖液（0.045 mmol/L Tris-硼酸，1.0 mmol/L EDTA，pH8.0）在5V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下電泳約1hr，于UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相。根據(jù)分子量大小判斷目的片段，并切膠回收其中的DNA分子。采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 提供的試劑盒回收DNA。215 RT-PCR產(chǎn)物克隆及測(cè)序電泳回收的DNA分子克隆于pMD 18-T載體，采用雙脫氧鏈末端終止法用M13-47（5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3）和RV-M（5-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3）引物分別從兩端在ABI PRISMTM377XL DNA測(cè)序儀上對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，克隆和測(cè)序交由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行。22 結(jié)果與分析221 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果病葉總RNA抽提液經(jīng)RT-PCR反應(yīng)均能獲得預(yù)期大小的DNA電泳帶，不同樣品電泳帶強(qiáng)弱存在差異，可能與樣品抽提質(zhì)量有關(guān)。健康植株對(duì)照樣品無(wú)任何擴(kuò)增電泳帶（見(jiàn)圖1）。 1 2 3 4 5 6 7 8圖1. 引物P1、P2對(duì)馬鈴薯卷葉病株葉組織總RNA RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果1:健葉對(duì)照, 2,3,4,5,6,7:病葉總RNA擴(kuò)增產(chǎn)物, 8:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)222 RT-PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的RT-PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)960bp，所克隆片段的正義鏈核苷酸序列如下：C,CTCGTTACAT,CAACCGGACA,AAATAGATTA,TAAATTCTTA,GCGGGATTTG,CTTTAGGATT,TTCATCCGCA,ATCCCATTTT,CAGTAGCCGG,TTTATATTTT,GTTTACCTAA,AGATTTCCTC,CCACGTGCGA,TCAATTGTTA,ATGAGTACGG,TCGTGGTTAA,AGGAAATGTC,AATGGTGGTG,TACAACAACC,AAGAAGGCGA,AGAAGGCAAT,CCCTTCGCAG,CGCGCTAAC,AGAGTTCAGC,CAGTGGTTAT,GGTCACGGCC,CCTGGGCAAC,CCAGGCGCCG,AAGACGTAGA,AGAGGAGGCA,ATCGCCGCTC,AAGAAGAACT,GGAGTTCCCC,GAGGACGAGG,CTCAAGCGAG,ACATTCGTGT,TTACAAAGGA,CAACCTCATG,GGCAACTCCC,AGGAAGTTT,CACCTTCGGG,CCGAGTCTAT,CAGACTGTCC,GGCATTCAAG,GATGGAATAC,TCAAGGCCTA,CCATGAGTAT,AAGATCACAA,GCATCTTACT,TCAGTTCGTC,GCGAGGCCT,CTTCCACCTC,CTCCGGCTCC,ATCGCTTATG,AGTTGGACCC,CCATTGCAAA,GTATCATCCC,TCCAGTCCTA,CGTCAACAAG,TTCCAAATTA,CGAAGGGCGG,CGCCAAAACT,TATCAAGCGC,GGATGATAAA,CGGGGTAGAA,TGGCACGATT,CTTCTGAGGA,TCAGTGCCGG,ATACTGTGGA,AGGGAAATGG,AAAATCTTCA,GATACCGCAG,GATCCTTCAG,AGTCACCATC,AGGGTGGCTT,TGCAAAACCC,CAAATAGGTA,GACTCCGGAT,CAGAGCCTGG,TCCAAGCCCA,CAACCAACAC,CCACTCCAAC,TCCCCAGAAA,CACGAGCGAT,TTATTGCTTA,CGTTGGCATA,CCTATGCTAA,CCATTCAGGC,CAGGGAGAAC,GATGACCAAA,TCATATTGGG,TTCCTTAGGG,AACCAAAGGA,TGAAATATAT,AGAGGACGAG,ACCAGAACT 可見(jiàn)第142位有一個(gè)翻譯起始密碼ATG，第767位有一個(gè)翻譯終止密碼TAG，構(gòu)成了一個(gè)627bp的開(kāi)讀框，該開(kāi)讀框推導(dǎo)產(chǎn)生208個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。該開(kāi)讀框即為馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白（coat protein, 簡(jiǎn)稱CP）基因。223 馬鈴薯卷葉病毒陽(yáng)東分離物CP基因序列分析由測(cè)序結(jié)果可知，我們從陽(yáng)東縣馬鈴薯病株組織中克隆到了馬鈴薯卷葉病毒 CP基因，因而將發(fā)生于陽(yáng)東縣的馬鈴薯病毒命名為PLRV陽(yáng)東分離物。將所測(cè)定的PLRV陽(yáng)東分離物CP基因序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）中已報(bào)道的基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，PLRV陽(yáng)東分離物CP基因與世界各地已報(bào)道的PLRV各株系或分離物CP基因高度同源：與分離自法國(guó)的Noir株系及中國(guó)河北張家口分離物完全相同；與中國(guó)福建分離物部分序列同源率為99%（611/617）；與南非分離物同源率最低，為96%(608/627)。表2列出了幾個(gè)具代表性株系或分離物的比較結(jié)果。表2. PLRV陽(yáng)東分離物與部分已報(bào)道的PLRV株系或分離物CP基因序列同源性比較PLRV株系或分離物NoirZhamgjiakouFujian CanadianCU87Zim13V4AustalianSouth Africa地理來(lái)源法國(guó)中國(guó)中國(guó)加拿大古巴津巴布韋蘇格蘭澳大利亞南非與陽(yáng)東分離物同源率100100*99999999989796*文獻(xiàn)報(bào)道的張家口分離物與陽(yáng)東分離物存在1個(gè)核苷酸差異，但該核苷酸是由該文獻(xiàn)的作者通過(guò)PCR引物人為引入的，因此我們不認(rèn)為其為真實(shí)差異。3 馬鈴薯卷葉病毒分子檢測(cè)通過(guò)對(duì)病毒基因序列的分析，我們確定引起陽(yáng)東縣馬鈴薯病毒病的主要病原為PLRV，而種薯帶毒是其主要傳播方式之一，為此我們建立了PLRV分子檢測(cè)技術(shù)并對(duì)部分種薯進(jìn)行了檢測(cè)。3. 1 檢測(cè)方法的建立311 RT-PCR引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)所測(cè)定的PLRV陽(yáng)東分離物CP基因及其上、下游核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了4條寡聚核苷酸引物，分別組成4個(gè)引物對(duì)，用以對(duì)PLRV基因組相應(yīng)片段進(jìn)行擴(kuò)增。引物所在位置、序列及其預(yù)期擴(kuò)增片段大小如下：P1-1P2-1P2P1CP基因圖2 PLRV RT-PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)其中：P1：5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3P1-1：5-GAGTTCAGCCAGTGGTTATG-3P2：5-AGTTCTGGTTCTCGTCCTC-3P2-1：5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-34條引物共組成4個(gè)引物對(duì)，其預(yù)期擴(kuò)增片段大小為P1P2： 960bpP1P2-1： 584bpP1-1P2： 728bpP1-1P2-1： 362bp312 RT-PCR檢測(cè)最佳引物對(duì)篩選樣品處理、RT-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳均按2.1.2、2.1.3、2.1.4所述進(jìn)行。用病葉組織總RNA抽提液為模板，采用不同的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，所設(shè)計(jì)的4對(duì)引物都能擴(kuò)增PLRV目的片段，但引物對(duì)P1-1P2及P1P2產(chǎn)物量太少(泳道2,4)，易受樣品質(zhì)量影響 1 2 3 4 5 圖3. 不同引物對(duì)擴(kuò)增PLRV基因組相應(yīng)片段的效果泳道1,2,3,4:分別為引物對(duì)P1-1P2-1,P1-1P2,P1P2-1,P1P2擴(kuò)增產(chǎn)物; 泳道5:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)圖1）；引物對(duì)P1-1P2-1有一些較弱的非目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道1)；引物對(duì)P1P2-1產(chǎn)物電泳帶最為單一、明亮(泳道3)，適合用做病毒檢測(cè)。313 引物對(duì)P1與P2-1檢測(cè)PLRV的靈敏度將病株葉片總RNA抽提樣品用無(wú)RNA酶污染的雙蒸水進(jìn)行10倍系列稀釋，用不同稀釋度的RNA抽提液為模板，以P1、P2-1為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖4）表明，引物對(duì)P1與P2-1檢測(cè)PLRV的靈敏度為10-5總RNA抽提液，相當(dāng)于可檢出10-5mg（十萬(wàn)分之一毫克）馬鈴薯病葉組織中所含的病毒。32 種薯樣品的處理及檢測(cè)321 種薯的處理馬鈴薯種薯由陽(yáng)東縣農(nóng)業(yè)局提供。取種薯塊莖用自來(lái)水洗凈，按芽眼切成適度大小的薯塊，每個(gè)種薯取一個(gè)薯塊，播種于磁盤里河沙中，置于光照培養(yǎng)箱中28每天12小時(shí)光照保濕培養(yǎng)，約2-3周后馬鈴薯幼苗長(zhǎng)出4-6片葉，取幼嫩的平展葉片進(jìn)行病毒檢測(cè)。322 樣品檢測(cè)結(jié)果按照前述方法抽提樣品組織總RNA，以引物P1、P2-1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，在所檢測(cè)的30個(gè)樣品中，有18個(gè)樣品發(fā)生了目的片段擴(kuò)增（見(jiàn)圖5），也即在60%的種薯中檢測(cè)到了馬鈴薯卷葉病毒。 1 2 3 4 5 6 7 8圖4. 引物對(duì)P1、P2檢測(cè)馬鈴薯病毒葉中PLRV的靈敏度1. 7: 病葉總RNA抽提液稀釋10-6, 10-5,10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100擴(kuò)增產(chǎn)物, 8: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16圖5. 馬鈴薯種薯攜帶PLRV檢測(cè)結(jié)果1- 15泳道:樣品擴(kuò)增產(chǎn)物, 16泳道:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)4 結(jié)論與討論4.1 田間調(diào)查顯示，廣東省陽(yáng)東縣大田種植的馬鈴薯30%以上的植株表現(xiàn)出典型的卷葉病毒病癥狀，嚴(yán)重田塊病株率接近70%。病株在田間呈隨機(jī)分布。田塊之間的病株率存在差異，可能與管理水平的不同有關(guān)。 4.2利用基因克隆及序列分析的方法，確認(rèn)該病的病原為馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）。 4.3為了建立PLRV的RT-PCR分子檢測(cè)技術(shù)，設(shè)計(jì)與合成了4對(duì)寡聚核苷酸引物，經(jīng)一步法RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明引物對(duì)P1: 5-CCTCGTTACATCAACCGGA-3與P2-1: 5-GGAACTTGTTGACGTAGGAC-3的檢測(cè)效果最佳。該引物對(duì)檢測(cè)PLRV的靈敏度為10-5mg病葉組織中的病毒，RT-PCR產(chǎn)物呈明亮的單一電泳條帶。 4.4從病株癥狀、田間分布、發(fā)病時(shí)間及發(fā)病率等調(diào)查結(jié)果推斷該病的發(fā)生極可能是播種帶毒種薯所致。我們采用RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)陽(yáng)東縣農(nóng)業(yè)局提供的馬鈴薯塊莖（經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出幼葉）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60%的種薯帶有PLRV，證實(shí)了以上推斷。 4.5 基因序列分析揭示，陽(yáng)東縣PLRV CP基因與分離自法國(guó)的Noir株系以及我國(guó)河北張家口分離物完全相同；而與我