改良線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的經(jīng)驗總結(jié).doc

改良線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的經(jīng)驗總結(jié)【中圖分類號】R722.t2 【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-6851（2017）01-0-01腦卒中是一種急性腦血管疾病，而缺血性腦卒中的發(fā)病率高于出血性腦卒中，占腦卒中的60%一70%。由于臨床研究限制，為弄清缺血性卒中的演變過程和干預措施療效觀察，探尋缺血性卒中的形成機制和防治策略，建立最接近人類腦梗死的理想動物模型尤其重要。大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery， occlusion，MCAO）模型被普遍認為是局灶性腦缺血的標準動物模型1。在腦缺血動物模型制作的研究中，用大鼠建立MCAO腦缺血的動物模型最為合適。制備MCAO模型的方法有很多種，包括光化學法、三氯化鐵法、線栓法、自體血栓法、電流損傷法、自發(fā)性MCAO法等2。由于線栓法具有不開顱、效果肯定、易操作等優(yōu)點，是常用的模型制備方法3-4。但該方法仍存在技術(shù)要求高、模型差異性大、動物死亡率高等缺陷。因此，如何建立穩(wěn)定、可靠、重復性高的MCAO動物模型成為目前函待解決的問題5。造模過程中筆者發(fā)現(xiàn)，一些微小的操作技巧也許就決定著實驗最終的結(jié)果，謹以自身經(jīng)驗告之，希望讓該科研課題的實驗工作者有所收獲。下面將主要從術(shù)前準備、術(shù)中操作及術(shù)后護理三方面進行詳細講述。1.術(shù)前準備1.1 實驗大鼠的選擇有學者認為大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的成功與合理選擇實驗動物有關(guān)6-8，首先是性別，實驗應選用雄性SD大鼠，有研究表明，雌激素水平的變化與缺血性腦血管病的發(fā)生和發(fā)展有一定的關(guān)系。雌激素可減輕腦缺血的損傷，具有神經(jīng)保護作用，包括增加腦血流量，阻滯興奮性神經(jīng)毒性損傷，舒張血管等作用9。其次是體重，大鼠體重的選擇十分重要，它決定著大鼠血管直徑的大小，在適應性喂養(yǎng)約1周時間后，根據(jù)制作的線栓頭端的直徑大小，來大致估算大鼠血管直徑的范圍，最后選擇相應體重的大鼠進行實驗。若體重過輕，線栓直徑相對較大，易損傷血管；反之，則會因堵不住血管而出現(xiàn)持續(xù)性出血，造模失敗。我們實驗選用的線栓頭端直徑約0.36mm，大鼠體重250-280g，通過試驗發(fā)現(xiàn)，在進食情況下，體重達280-290g的大鼠禁食不禁水12小時后，體重若維持在260-270g范圍內(nèi)，血管直徑狀況最適宜。1.2 實驗材料準備在實驗材料方面，除了藥物，動脈夾、顯微鑷及結(jié)扎線的選擇直接決定著造模的操作時間和成效。首先，動脈夾最好選用內(nèi)側(cè)有防滑齒的，防止脫落；動脈夾不宜過大，影響操作。其次最好配備顯微鑷，可用于分離血管及血管外膜；最后在結(jié)扎線的選擇上，最好購買兩種結(jié)扎線，粗線用來結(jié)扎大血管如頸總，不易損傷血管，在解線時更方便，細線用來結(jié)扎頸外斷端及線栓口，這樣線栓更好轉(zhuǎn)彎，扎線的松緊更好掌握。2.術(shù)中操作2.1 麻醉選擇適宜體重的大鼠，術(shù)前禁食不禁水12h，取出大鼠，用10%水合氯醛進行腹腔麻醉，計量按照3.5mL/kg，腹腔麻醉時注意角度及進針深度，避免注射到皮下。麻醉后5-10分鐘，以指掐大鼠尾巴沒有掙扎為準。2.2 分離血管將大鼠取仰臥位固定于鼠板上，頭端朝術(shù)者，持無齒鑷牽拉大鼠舌前部到一側(cè)口角處，剃除頸部毛發(fā)，碘伏、酒精多次消毒頸部。以正中線行縱向切口，切口不宜過于靠近下頜，長度約1.5cm，用彎鑷沿切口行鈍性剝離，剝離皮下筋膜、肌肉及甲狀腺，用拉鉤將皮膚及肌肉拉開，充分暴露。盡量將氣管兩側(cè)的組織分離干凈，暴露頸總，沿氣管右側(cè)（筆者實驗為右側(cè)）進行血管分離，并仔細將頸總動脈上附著的筋膜全部分離，用彎鑷從血管下面向兩側(cè)分離，直到看到頸內(nèi)動脈和頸外動脈的分叉，切記小心與頸總伴行的迷走神經(jīng)，由于個體差異，有些大鼠的迷走神經(jīng)會橫跨頸總后再向下行，要注意盡量少的刺激迷走神經(jīng)，利用筋膜將其分離開。2.3 結(jié)扎利用拉鉤充分暴露CCA、ICA、ECA，注意分清ICA和ECA，大鼠的頸外和頸內(nèi)的分布與人類有所差異，近似于上下分布，頸外在上偏內(nèi)，頸內(nèi)在下偏外。用手術(shù)線分別穿過CCA、ICA、ECA做備用，在CCA盡量靠近心臟的方向用粗線結(jié)扎，活結(jié)，充分剝離ECA，在ECA靠近頭端處打死結(jié)，靠近分叉處放置一細結(jié)扎線備用。用微動脈夾盡量遠離分叉口夾閉ICA，頸內(nèi)動脈的結(jié)扎是暫時的。2.4 插線栓在ECA距分叉處4mm處，用顯微剪頭朝下剪一弧行小口，此時注意是否有血持續(xù)滲出，若有，表示結(jié)扎不牢，可嘗試拉緊結(jié)扎線，切記此時不能松開動脈夾，否則會造成大出血。接著夾持線栓由ECA上的切口向分叉方向插入，左手可提拉起ECA頭端地結(jié)扎線固定血管，鑷子夾太緊會使線栓頭變形。待魚線進入CCA后放手，然后用備好的結(jié)扎線栓緊切口，注意不能越過OA，否則會持續(xù)出血，必要時可結(jié)扎OA，此時結(jié)扎的松緊度非常重要，過緊則線栓插入困難，過松則會出血、脫落，以松開動脈夾后不出血為度。剪掉多余線頭，剪斷ECA，然后用兩個彎鑷一面夾住己經(jīng)進入的魚線和血管，一面夾住外面的魚線，進行遞送，在分叉處傾斜巧度角轉(zhuǎn)向進入ICA，遇到動脈夾阻擋后，松開動脈夾，繼續(xù)向內(nèi)插入。插入約10mm左右，有時會感覺有阻力，是由線栓穿顱時遇到狹窄所致，此時硬行推入易損傷血管。應將線栓緩緩退至切口處，調(diào)整方向再緩慢插入，技巧是一手用顯微鑷向上抬起ICA靠顱段，另一手持鑷子稍下壓使線栓盡量保持水平插入，約當線栓標記點靠近切口時，即插入16-18mm左右，感覺到輕微阻力時停止插入，不宜超過20mm，切記操作者動作一定要輕柔，否則易導致蛛網(wǎng)膜下腔出血而死亡。應注意線栓在血管里多次進退可誘發(fā)血小板、白細胞勁附，損傷或刺激血管內(nèi)皮細胞引起某些活性物質(zhì)釋放誘發(fā)血栓，造成動物存活時間縮短10。2.5 缺血與再灌注線栓插入成功后，記錄缺血開始的時間，浸泡過生理鹽水的脫脂棉球覆蓋傷口。給大鼠保暖。缺血90 min后緩慢拔出魚線，拔線時速度過快或麻醉不好大鼠抽動，會引起蛛網(wǎng)膜下腔出血甚至拉斷血管，導致大鼠死亡。在缺血的90min時間里，中途需要補充麻醉，根據(jù)實驗經(jīng)驗，若造模耗時在30min以內(nèi)，在缺血1小時后可再次注射0.2-0.3ml水合氯醛，這里要注意不要注射過多，容易死亡。若大鼠有牙齒挫動或手腳抽動為蘇醒前指征，此時注射麻醉效果減弱，若大