陽(yáng)性菌管理.doc

一） 實(shí)驗(yàn)室要求： 1實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)清潔、衛(wèi)生、安靜，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙和飲食。 2實(shí)驗(yàn)人員必須穿戴工作衣帽，工作服經(jīng)常洗滌、消毒、保持清潔。 3操作前后或離開實(shí)驗(yàn)室必須用肥皂或消毒液洗手。 4發(fā)生菌液污染臺(tái)面或地面，應(yīng)立即用3甲醛或5碳酸等消毒液由外向內(nèi)傾覆其上，1小時(shí)后再擦拭，如為破傷風(fēng)梭菌，則應(yīng)隔夜后再擦洗。5工作衣、帽、口罩受到菌液污染時(shí)，應(yīng)立即脫下使污染部位包裹在內(nèi)部，高壓滅菌后再清洗。 6如有傳染性培養(yǎng)物污染手部，應(yīng)先用75乙醇棉球擦拭，再浸入01新潔爾滅消毒液內(nèi)泡手，然后再用肥皂及清水徹底洗干凈。 7接種環(huán)（針），每次使用前后，必須通過火焰滅菌，冷卻后方可接種培養(yǎng)物，接種帶有蠟質(zhì)、油質(zhì)的培養(yǎng)物或菌苔殘留多時(shí)，不應(yīng)立即在火焰上灼燒，應(yīng)先在內(nèi)焰里將油質(zhì)培養(yǎng)物烘干后再移至火焰上滅菌，以免活菌外濺污染環(huán)境及感染操作者。 8帶菌的吸管應(yīng)浸泡在5甲酚消毒液內(nèi)24h后取出清洗，帶菌的試管或培養(yǎng)物應(yīng)在121高壓滅菌后再取出清洗。 9在接種霉菌、放線菌時(shí)應(yīng)在鋪有浸過消毒液的紗布上操作，防止孢子散落傳播。10凡帶活菌的物品，必須消毒后才能清洗，嚴(yán)禁污染下水道。 （二） 無(wú)菌操作要求： 無(wú)菌操作是指在無(wú)菌的環(huán)境條件下，使用無(wú)菌器材，防止微生物污染的操作技術(shù)。即保持待檢樣品在操作時(shí)不被污染，又要防止被檢的微生物及陽(yáng)性對(duì)照菌在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。從事無(wú)菌及微生物操作的工作人員必須經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)及基礎(chǔ)微生物學(xué)專業(yè)知識(shí)的學(xué)習(xí)及培訓(xùn)才具備上崗操作的資格，微生物專業(yè)檢驗(yàn)人員也不應(yīng)該頻繁地變換工作崗位。 1無(wú)菌室應(yīng)每次使用前后用01新潔爾滅消毒液或2甲醛液擦拭工作臺(tái)面及可能污染的死角，濕拖地面，打開無(wú)菌空氣過濾器及超凈工作臺(tái)的開關(guān)30分鐘，紫外線殺菌燈照射1小時(shí)。2操作人員用肥皂洗手后進(jìn)入緩沖間換拖鞋，用75乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。將所需物品剝?nèi)ヅＦぜ埣巴獍b，從傳遞窗移入操作間，再用01新潔爾滅泡手后進(jìn)入操作間，在乙醇（或煤氣燈）火焰區(qū)（火焰高度35cm）操作。3供試品表面消毒，如為安瓿先用砂輪劃痕后用2碘酒棉球擦拭，再用75乙醇棉球擦拭、待干，也可以用消毒液浸泡消毒。 4操作者勿用嘴直接吸吹吸管，防止致病菌感染操作人員及口中的雜菌污染供試品。5在無(wú)菌操作中切勿大幅度或快速動(dòng)作、拖行，以免攪動(dòng)空氣中塵埃微粒。 6注射器如需回抽時(shí)，應(yīng)對(duì)著火焰吸入無(wú)菌空氣。 7所用的器材如培養(yǎng)基、稀釋劑配制后經(jīng)濕熱滅菌12120分鐘，吸管培養(yǎng)皿等均應(yīng)洗滌，干燥，包扎后經(jīng)干熱滅菌1602小時(shí)才能使用。 （三）儀器設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室所用的各種儀器，如培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴瓶、電熱恒溫干燥箱等，均應(yīng)嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書操作，均應(yīng)按計(jì)量要求定期檢測(cè)，并做好檢測(cè)與維修記錄，以保證其正常使用。無(wú)菌操作凈化工作臺(tái)要定期檢測(cè)潔凈度，應(yīng)達(dá)到百級(jí)。凈化工作臺(tái)的高效過濾器應(yīng)根據(jù)使用情況（四）培養(yǎng)基的管理 培養(yǎng)基是人工配制的適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基的管理在無(wú)菌及微生物限度檢查工作中起著重要的作用。 1培養(yǎng)基購(gòu)入后應(yīng)記錄名稱、產(chǎn)地、批號(hào)，培養(yǎng)基配制記錄應(yīng)包括：名稱、配制量、配制者、配制日期。 2干燥培養(yǎng)基的配制應(yīng)先量入蒸餾水至容器中，再稱取培養(yǎng)基干粉放入水中，搖勻，靜置15分鐘使其溶解，一般不要加熱，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。 3培養(yǎng)基配制后應(yīng)立即滅菌，以防長(zhǎng)菌使?fàn)I養(yǎng)成分損耗，高壓滅菌時(shí)應(yīng)防止溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)，使?fàn)I養(yǎng)成分破壞致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。滅菌時(shí)間：稀釋劑121滅菌20分鐘，含糖培養(yǎng)基115滅菌20分鐘。 4配制好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在涼暗處（210）或置4冰箱內(nèi)保存，一月左右使用。保存時(shí)間需視培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)程度及有無(wú)污染而定，用硅膠塞，封入塑料袋，內(nèi)可延長(zhǎng)保存時(shí)間。培養(yǎng)基切勿反復(fù)加熱使用。 5培養(yǎng)基的質(zhì)量控制，應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)的蛋白胨，牛肉膏等營(yíng)養(yǎng)成分，化學(xué)純以上的化學(xué)試劑，調(diào)配成最適的pH值。配制后應(yīng)按規(guī)定做無(wú)菌試驗(yàn)，如無(wú)菌檢查用的培養(yǎng)基，需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基置3035培養(yǎng)48小時(shí)，真菌培養(yǎng)基置2025培養(yǎng)72小時(shí)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。除此以外，還需做培養(yǎng)基性能的質(zhì)量控制，性能試驗(yàn)：即不同的培養(yǎng)基接種不同的已知標(biāo)準(zhǔn)菌株，培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，如無(wú)菌檢查培養(yǎng)基需做培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)，細(xì)菌生長(zhǎng)良好，說(shuō)明培養(yǎng)基性能可靠。 （四）實(shí)驗(yàn)菌種的保藏與管理 國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種菌號(hào)是CMCCB、CMCCF，B（Bacteria）代表細(xì)菌，F(xiàn)Fungi代表真菌。由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。 1菌種保藏基本要求 菌種的保藏是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，用人工方法低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)等方法控制微生物的代謝，使細(xì)胞基本上處于休眠狀態(tài)，繁殖受到抑制仍保持菌種原有的各種生物學(xué)特性，以達(dá)到保種的目的。菌種保藏的關(guān)鍵是不變異、不污染、不死亡。 菌種保藏分四個(gè)階段： 挑選特征典型的純菌菌落，其方法是用接種環(huán)挑取少許菌苔，接種至2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯或09氯化鈉溶液中制成菌液，再取一環(huán)菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后可見單個(gè)菌落生長(zhǎng)。 凡能產(chǎn)生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進(jìn)行保種 VUnEI oKM 孢子和芽胞的代謝作用較弱，但對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗.在傳代前，將菌液管放入80水浴中作用30分鐘，殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。 定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退，檢查項(xiàng)目：菌落形態(tài)、染色、鏡檢、生化特性及血清學(xué)檢查。 選擇適宜的培養(yǎng)基及方法 2常用菌種的保藏方法 普通瓊脂斜面：用于常用細(xì)菌的傳代。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)按05加入瓊脂粉配制而成。接種培養(yǎng)后，將菌種管用硅膠塞塞緊，置4冰箱保存，每隔23個(gè)月傳種一次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，菌種可放25培養(yǎng)箱內(nèi)保存。 半固體瓊脂：用于常用細(xì)菌的傳代。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)按05加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養(yǎng)后，置4冰箱保存，6個(gè)月傳種一次。如在培養(yǎng)管內(nèi)加少量無(wú)菌液體石蠟隔絕空氣，減少水分蒸發(fā)，可延長(zhǎng)菌種保藏期。 真菌瓊脂斜面：用于真菌的傳代。在真菌培養(yǎng)基內(nèi)按13加入瓊脂粉配制而成。劃線接種后，2025培養(yǎng)24小時(shí)，置4冰箱保存，36個(gè)月傳種一次。 沙氏瓊脂斜面：用于真菌的傳代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，瓊脂粉13g，水1000ml，待上述成分溶化后，搖勻分裝，115滅菌20分鐘，趁熱擺成斜面。培養(yǎng)、保存及傳代同 40甘油水：用于細(xì)菌的傳代。配制方法：甘油40ml加水至100ml即成。分裝至試管內(nèi)，每支2ml左右，121滅菌20分鐘備用。接種細(xì)菌后直接放4冰箱保存，612個(gè)月傳代一次。 需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基：用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液01ml至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基15ml內(nèi)，3035培養(yǎng)1824h，置4冰箱內(nèi)保存36個(gè)月傳種一次。 皰肉培養(yǎng)基：用于破傷風(fēng)梭菌的傳代。取破傷風(fēng)梭菌CMCCB64067菌液01ml接種于皰肉培養(yǎng)基內(nèi)，361厭氧培養(yǎng)34天，置4冰箱保存，612個(gè)月傳代一次。 液氮超低溫保藏法：適用于各類微生物的保藏。液氮溫度可達(dá)196，此時(shí)菌種的新陳代謝活動(dòng)已停止，但不會(huì)死亡。在配制好的菌液內(nèi)加10甘油作為保護(hù)劑，分裝于安瓿中，置液氮罐內(nèi)可保存10年之久。 冷凍真空干燥保藏法：本法廣泛適用于各類微生物的保藏，包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護(hù)作用的介質(zhì)內(nèi)，分裝于滅菌菌種管內(nèi)，速凍后抽真空，使菌液很快變?yōu)槭杷傻母稍锞?，最后在真空狀態(tài)下密封管口，菌種保存期最長(zhǎng)可達(dá)20年以上。 3菌種檢查與復(fù)壯：菌種在傳代保藏過程中，易發(fā)生衰退、變異、污染、死亡，因此必須定期檢查。將菌種接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)使之復(fù)活，重新分離，純化開成單個(gè)菌落，再作菌種檢定，包括菌落形態(tài)、顏色，染色性、鏡下觀察菌體形態(tài)等，必要時(shí)可做生化試驗(yàn)及血清學(xué)反應(yīng)。 菌種經(jīng)人工傳代保藏過程中，由于自發(fā)突變而引起特性變?nèi)趸蛳鶠榫N衰退。使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性，稱為菌種復(fù)壯。常用方法有： 分離純化：將菌種接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，取菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后挑取典型單個(gè)菌落。 宿主復(fù)壯：將退化菌種接種到相應(yīng)昆蟲或動(dòng)植物宿主體內(nèi)，傳種數(shù)代可恢復(fù)其原有的特性與毒力。 通過極端的逆境處理使那些退化的細(xì)菌死亡，選育健壯的傳代保種。 aE BP9RXz 4實(shí)驗(yàn)菌種的管理用菌（毒）種應(yīng)放入專用冰箱（帶鎖），專人保管，菌種應(yīng)有購(gòu)入記錄，傳代記錄，使用銷毀記錄。菌種應(yīng)定期檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退。 為了保持菌種原有的各種生物學(xué)特性保證實(shí)驗(yàn)菌種的質(zhì)量，近年來(lái)國(guó)外提出了使用菌種不超過五代的要求。雖然目前我國(guó)藥典對(duì)于菌種的傳代次數(shù)未做要求，我們實(shí)驗(yàn)中所用的陽(yáng)性對(duì)照菌可能已經(jīng)傳了無(wú)數(shù)代，存在著菌種衰退、老化變異、不敏感等隱患，對(duì)于使用菌種不超過五代給我們提出了更高的要求。我們可以用以下方式傳代： 凍干菌種營(yíng)養(yǎng)肉湯半固體瓊脂或甘油水100支冰箱保存 （原代）（一代）（二代） 菌種的保藏條件及傳種時(shí)間 菌種名稱培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間保存溫度傳種時(shí)間 金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基353718-24h4-623個(gè)月 藤黃微球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基273024h4-623個(gè)月 生孢梭菌需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基303518-24h4-66個(gè)月 白色念珠菌真菌瓊脂斜面培養(yǎng)基202524h4-62-3個(gè)月 大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培