蛋白質(zhì)的定量測定方法.doc

六、蛋白質(zhì)含量定量法一、Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1.學(xué)習(xí)Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理。 2.掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的方法和操作。 【實(shí)驗(yàn)原理】 蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測定波長：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25-100g）在500nm波長處進(jìn)行測定，含量低時(shí)(5-25g)在755nm波長處進(jìn)行測定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。 Folin-酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5g即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。 【實(shí)驗(yàn)材料】 1.實(shí)驗(yàn)器材 100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度計(jì)。 2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)Fo1in-酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50ml0.lmolL氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅(CuSO45H2O)溶于100m11酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，然后將前者50ml與后者lml混合?；旌虾?日內(nèi)使用有效。(2)Folin-酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO42H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO42H2O)、700ml蒸餾水、50ml85磷酸及100ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h?；亓魍戤叄偌?50g硫酸鋰、50ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后定容到1000ml。過濾，如顯綠色，可加溴水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標(biāo)定該試劑的酸度，一般為2molL左右(由于濾液為淺黃色，滴定時(shí)濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點(diǎn)的觀察)。使用時(shí)適當(dāng)稀釋(約1倍)，使最后濃度為lmolL酸。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用分析天平精密稱取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸餾水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準(zhǔn)確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/ml。(4)樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。 【實(shí)驗(yàn)操作】 1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取7支試管，按下表分別加入各試劑試劑 管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)0.00.10.20.30.40.50.6蒸餾水(ml)1.00.90.80.70.60.50.4Fo1in-酚試劑甲(ml)5555555搖勻，室溫下放置10分鐘Fo1in-酚試劑乙(ml)111 1111各管加入Fo1in-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在500nm處記下各管光密度，以0號(hào)管為對照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 測定未知樣品：取2支試管，分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in-酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in-酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測定光密度值。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。二、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。 【實(shí)驗(yàn)原理】 凱氏定氮法用于測定有機(jī)物的含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。 消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度為止。根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測物中的總氮量。 蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。 【實(shí)驗(yàn)材料】 1.實(shí)驗(yàn)器材 微量凱氏定氮儀1套；50ml凱氏燒瓶4個(gè)；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠 2.試驗(yàn)試劑 (1)濃硫酸；30氫氧化鈉溶液；2硼酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(0.01molL)。 (2)粉末硫酸鉀硫酸銅混合物：K2SO4與CuSO45H2O以3：1配比研磨混合。 (3)混合指示劑(田氏指示劑)：由50ml0.1甲烯藍(lán)乙醇溶液與200ml0.1甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。 (4)樣品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。 【實(shí)驗(yàn)操作】 1.安裝凱氏定氮儀。 2.消化：取4個(gè)50ml凱氏燒瓶并標(biāo)號(hào),各加1顆玻璃珠，在1號(hào)及2號(hào)瓶中各加樣品1ml，催化劑(K2SO4-CuSO45H2O)200mg，濃硫酸5ml。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號(hào)及4號(hào)瓶中各加1ml蒸餾水和與1、2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對照。在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行消化。 在消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫。 3.蒸餾： (1)蒸餾器的洗滌：用水洗滌干凈微量凱氏定氮儀，在蒸汽發(fā)生器中加入用幾滴硫酸酸化的蒸餾水和幾滴甲基紅指示劑，用這樣的水蒸氣洗滌凱氏定氮儀。約15分鐘后，在冷凝器下端傾斜放好裝有硼酸-指示劑的錐形瓶，繼續(xù)蒸汽洗滌2分鐘，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色，如不變色則證明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。移走錐形瓶，停止加熱，打開夾子。 (2)蒸餾：取下棒狀玻塞，用吸管吸取消化液，細(xì)心地插到反應(yīng)室小玻璃杯的下方，塞緊棒狀玻塞。將一個(gè)含有硼酸和指示劑的錐形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸沒在液體內(nèi)。取30的氫氧化鈉溶液10ml放入小玻璃杯中，輕提棒狀玻璃塞使之流入反應(yīng)室(為了防止冷凝管倒吸，液體流入反應(yīng)室必須緩慢)。尚未完全流入時(shí)，將玻璃塞蓋緊，向玻璃杯中加入蒸餾水約5ml。再輕提玻璃塞，使一半蒸餾水慢慢流入反應(yīng)室，一半留在玻璃杯中作水封。加熱水蒸汽發(fā)生器，沸騰后夾緊夾子，開始蒸餾。氨氣進(jìn)入錐形瓶，瓶中的酸溶液由紫色變成綠色。變色時(shí)起記時(shí)，再蒸餾5分鐘。移動(dòng)錐形瓶，使硼酸液面離開冷凝管約1厘米，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外面，繼續(xù)蒸餾1分鐘，移開錐形瓶，用表面皿覆蓋錐形瓶。蒸餾完畢后，須將反應(yīng)室洗滌干凈，再繼續(xù)下一個(gè)蒸餾操作。待樣品和對照均蒸餾完畢后，同時(shí)進(jìn)行滴定。 4.滴定：用0.01molL的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠色變淡紫色為滴定終點(diǎn)。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】其中：A為滴定樣品用去的鹽酸溶液平均ml數(shù)； B為滴定對照液用去的鹽酸溶液平均ml數(shù)；C為所取樣品溶液的ml數(shù)。三、紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1.學(xué)習(xí)紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的原理。 2.掌握紫外分光光度計(jì)的操作方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】 大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測定蛋白質(zhì)的含量。 紫外吸收法可測定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡便，測定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用。 【實(shí)驗(yàn)材料】 1.實(shí)驗(yàn)器材 ：試管及試管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度計(jì)。 2.實(shí)驗(yàn)試劑 ：(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確配制2mgml的酪蛋白溶液。 (2)樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。 【實(shí)驗(yàn)操作】 1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取7支試管按下列各表加入各試劑： 管號(hào)試劑 0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)0.00.51.01.52.02.53.0蒸餾水(ml)8.07.57.06.56.05.55.0蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)0.0000.1250.2500.3750.5000.6250.750試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計(jì)上，于280nm處以0號(hào)管為對照，分別測定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 測定未知樣品取樣品溶液4毫升,加蒸餾水4ml混勻，在280nm下測定其光密度值。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量。四、BCA方法測定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握用BCA方法測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法 【實(shí)驗(yàn)原理】 BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測可達(dá)到0.5g/ml），應(yīng)用更加靈活。 蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。 【實(shí)驗(yàn)材料】 1.實(shí)驗(yàn)器材 721分光光度計(jì)；恒溫水浴槽；移液管；微量進(jìn)樣器；試管架和試管。 2.實(shí)驗(yàn)試劑 (1)BCA試劑的配制 試劑A，1L：分別稱取10gBCA(1%)，20gNa2CO3H2O(2%)，1.6gNa2C4H4O62H2O(0.16%)，4gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO3(0.95)，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。 試劑B，50ml：取2gCuSO45H2O(4%)，加蒸餾水至50ml。 BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。 (2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400g/ml的溶液。 (3)樣品溶液：配制約50g/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。 【實(shí)驗(yàn)操作】 1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取6支干燥潔凈的大試管，編號(hào)，按下表加入試劑。管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（l）蒸餾水（l）BCA試劑（ml）蛋白質(zhì)含量（g）025050502005201001505401501005602005058025005100上述試劑加完后，混勻，于37保溫30min，冷卻至室溫后，以第1管為對照，在562nm處比色，讀取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品測定準(zhǔn)確吸取250l樣品溶液于一干燥潔凈的試管中，加入BCA試劑5ml，搖勻，于37保溫30min，冷卻至室溫后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)管為對照，在595nm處比色，記錄吸光值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量五、考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法測定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沼每捡R斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】考馬斯亮藍(lán)G-250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變成深藍(lán)色，最大吸收峰變?yōu)?95nm。蛋白質(zhì)含量在1-1000g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法測定。 蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度，最低檢出量為1g蛋白。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合迅速，大約為2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。所以本法操作簡便，快速，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種測定蛋白質(zhì)含量的常用方法。 【實(shí)驗(yàn)材料】 1.實(shí)驗(yàn)器材 721型分光光度計(jì)；試管；移液管；容量瓶。 2.實(shí)驗(yàn)試劑 (1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成100g/ml的溶液。 (2)考馬斯亮藍(lán)G-250試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml95乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容到1000ml。此溶液可在常溫下放置一個(gè)月。 (3)樣品溶液：配制約50g/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。 【實(shí)驗(yàn)方法】 1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取6支干燥潔凈的大試管，編號(hào)，按下表加入試劑。管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）蒸餾水（ml）考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（ml）蛋白質(zhì)含量（g）0.01.0500.20.85200.40.65400.60.45600.80.25801.00.05100上述試劑加完后，混勻，室溫靜置2min，以第1管為對照，在595nm