（微生物學(xué)專業(yè)論文）微生物酶法生產(chǎn)l半胱氨酸和l色氨酸的研究.pdf

摘要 摘要 l 一半胱氨酸與l 色氨酸在醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域均具有非常廣泛的用途。 近年來，各行業(yè)對l 半胱氨酸與l 色氨酸的需求量日益增加，而現(xiàn)有產(chǎn)量遠不能 滿足國內(nèi)外市場的需求。因此，開發(fā)微生物酶法生產(chǎn)l - 半胱氨酸與l 色氨酸的工 藝路線具有廣闊的應(yīng)用前景。 本實驗室從富含d l a t c 的環(huán)境中篩選獲得一株惡臭假單胞菌t s l l 3 8 菌株， 前期研究表明，該菌株能以d l a t c 為底物經(jīng)由s 代途徑酶法合成l _ 半胱氨酸。 本研究首先克隆鑒定了t s l l 3 8 菌株酶法轉(zhuǎn)化d l a t c 合成l 半胱氨酸的代 謝途徑中的另一個重要基因l - 半胱氨酸脫巰基酶，并將其在大腸桿菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中進行了重組表達以及分離純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了考察，發(fā)現(xiàn)了羥胺可 以作為其有效的抑制劑。 為了證明在t s l l 3 8 菌株酶法轉(zhuǎn)化d l a t c 合成l 半胱氨酸的過程中，l 半胱 氨酸脫巰基酶對l 半胱氨酸的分解起關(guān)鍵作用，本研究建立了一種從蛋白水平分 離l 半胱氨酸脫巰基酶的技術(shù)。以純化的l 半胱氨酸脫巰基酶重組蛋白免疫小 鼠，制備得到l 半胱氨酸脫巰基酶抗體。通過p r o t e i na 的生物橋聯(lián)作用，將該抗 體固定于纖維素磁性微球上，制備得到纖維素免疫磁性微球，該微球能夠特異 性分離t s l l 3 8 菌體裂解液中的l 半胱氨酸脫巰基酶，并且具有良好的重復(fù)利用 性能。利用經(jīng)過該免疫磁性微球處理后的t s l1 3 8 菌體裂解液轉(zhuǎn)化d l a t c 合成l 半胱氨酸，轉(zhuǎn)化率達到了9 6 4 ，比原始水平提高了3 3 7 ，并且保持穩(wěn)定，從 而證明了l - 半胱氨酸脫巰基酶是導(dǎo)致l 廣半胱氨酸產(chǎn)率降低的關(guān)鍵因素。 為了研究該代謝途徑，本研究還利用蛋白質(zhì)組學(xué)實驗分析了d l a t c 對 t s l1 3 8 菌體總蛋白表達的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)在不同誘導(dǎo)條件下，至少有十二種蛋 白在表達量上出現(xiàn)了三倍以上的差異。而實時熒光定量p c r 實驗則表明了l - a t c 水解酶、l - s c c 酰胺水解酶和l 半胱氨酸脫毓基酶酶基因在d l a t c 誘導(dǎo)條件下 的表達量分別為無誘導(dǎo)條件下的1 4 3 、1 6 2 和1 5 9 倍。另外，本研究還利用人工m u 轉(zhuǎn)座技術(shù)，構(gòu)建了t s l l 3 8 菌株的m u 轉(zhuǎn)座隨機突變文庫，獲得4 ，0 0 0 余株突變子。 以合成l 廣半胱氨酸能力為篩選指標，對1 ，0 0 0 余株突變子進行了篩選，發(fā)現(xiàn)有二 十余株突變子合成l 半胱氨酸的能力表現(xiàn)為缺失或大為降低。 摘要 為了提高l - 半胱氨酸產(chǎn)率，必須消除或抑n l 半胱氨酸脫巰基酶的作用，然 而l - 半胱氨酸脫巰基酶為t s l l 3 8 菌株的必需基因，無法從基因水平敲除。因此， 本研究建立了以t s l l 3 8 菌體全細胞為酶源，以羥胺為l 半胱氨酸脫巰基酶抑制 劑，重復(fù)利用酶源細胞連續(xù)多次轉(zhuǎn)化d l a t c 合成l - 半胱氨酸的生產(chǎn)工藝。首先 對酶促反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，在最適反應(yīng)條件下，底物轉(zhuǎn)化率可達到9 5 6 ，在 酶源細胞的6 次重復(fù)利用過程中，底物的轉(zhuǎn)化率均可保持在9 0 以上。隨后建立 了產(chǎn)物l 半胱氨酸的分離純化工藝。先將酶促反應(yīng)液中的l 半胱氨酸氧化成l 胱氨酸；之后經(jīng)樹脂吸附、等電點沉淀等方法純化獲得l - 胱氨酸，純度達到 9 9 1 ，收率為7 8 6 ；最終再通過電解還原的方法將l 胱氨酸還原為l 半胱氨 酸。 此外，在酶法轉(zhuǎn)化d l a t c 合成l 廣半胱氨酸的生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，本研究還建 立了利用色氨酸酶轉(zhuǎn)化l 半胱氨酸和吲哚合成l 色氨酸的生產(chǎn)工藝。 克隆了大腸桿菌j m l 0 9 菌株的色氨酸酶基因，并將其在大腸桿菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中進行誘導(dǎo)表達。通過對誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化，重組表達的色氨酸酶活力達到 宿主菌的約1 1 0 倍。此外，還利用p c r 介導(dǎo)定點突變技術(shù)對色氨酸酶氨基酸序列 上的四個位點進行了突變( f 2 3 1 r ，a 2 3 2 d ，a 2 6 5 r 與v 2 7 4 r ) ，結(jié)果分別導(dǎo)致了 色氨酸酶活力降低或完全失活，表明上述四個氨基酸位點均對維持色氨酸酶的 活力具有重要作用。 最后利用高效表達色氨酸酶的大腸桿菌酶源細胞，以l 一半胱氨酸和吲哚為 底物，進行了酶促反應(yīng)合成l 一色氨酸的研究。對酶促反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，在 最適反應(yīng)條件下，l 半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率約為8 1 5 ，吲哚的轉(zhuǎn)化率約為7 9 1 。 此外，本研究還建立了l 色氨酸的分離純化工藝，通過串聯(lián)使用兩種樹脂排除 反應(yīng)液中其它物質(zhì)的干擾，再經(jīng)洗脫、減壓濃縮干燥，獲得l 色氨酸，純度達 到9 8 3 ，收率為6 6 7 。 綜上所述，本研究對t s l1 3 8 菌株酶法轉(zhuǎn)化d l a t c 合成l 半胱氨酸的代謝 途徑進行了拓展研究，并且建立了l 半胱氨酸和l 色氨酸的酶法生產(chǎn)工藝，為 最終全面闡明l 半胱氨酸的代謝途徑以及實現(xiàn)以d l a t c 為底物酶法合成l 半 胱氨酸和l - 色氨酸的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：l 半胱氨酸；l 胱氨酸；l 色氨酸；酶法合成；生產(chǎn)工藝；惡臭假單胞 菌：代謝途徑；色氨酸酶 a b s t r a c t a b s t r a c t l 。c y s t e i n ea n dl - - t r y p t o p h a nb o t hh a v es i g n i f i c a n ta p p l i c a t i o n s i nt h e p h a r m a c e u t i c a l ，f o o da n df o d d e ri n d u s t r i e s i nr e c e n ty e a r s ，g l o b a ld e m a n df o r l - c y s t e i n ea n dl t r y p t o p h a nh a si n c r e a s e dr a p i d l y ，a n dt h e i rc u r r e n tp r o d u c t i o nl e v e l s a r ef a rf r o ms u f f i c i e n tt om e e tt h eg r o w i n gm a r k e tr e q u i r e m e n t s t h e r e f o r e ，i th a s w i d ea p p l i c a t i o np r o s p e c t st oe x p l o r et h ep r o d u c t i o nt e c h n o l o g i e so fl - c y s t e i n ea n d l - t r y p t o p h a nb ym i c r o b i a la n de n z y m a t i cc o n v e r s i o n as t r a i nn a m e dp s e u d o m o n a sp u t i d at si13 8w a si s o l a t e df r o me n v i r o n m e n t a l s a m p l e sc o n t a i n i n gr i c hd l a t cb yo u rt e a m p r e v i o u ss t u d yi n d i c a t e dt h a ti tc o u l d c o n v e r td l - a t ct ol c y s t e i n ev i as - p a t h w a y i nt h i ss t u d y , t h el - c y s t e i n ed e s u l f l a y d r a s e ( c d ) g e n e ，w h i c hp l a y sa l li m p o r t a n t r o l ei nt h ep r o c e s so ft h ee n z y m a t i cc o n v e r s i o no fd l - a t ct ol - c y s t e i n eb yt s113 8 s t r a i n ，w a sc l o n e da n di d e n t i f i e d ，a n dt h e nw a so v e r - e x p r e s s e di nec o i lb l 21 ( d e 3 ) a f t e rp u r i f i c a t i o n , t h ee n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c so ft h er e c o m b i n a n tc dw e r e a n a l y z e d ，a n dh y d r o x y l a m i n ew a sf o u n dt ob ea ne f f e c t i v ei n h i b i t o rt oc d a c t i v i t y t op r o v et h a tc di st h ek e yf a c t o rr e s p o n s i b l ef o rl - c y s t e i n ed e c o m p o s i t i o nd u r i n g t h ec o n v e r s i o no fd l - a t ct ol - c y s t e i n eb yt s113 8s t r a i n ，am e t h o df o ro n e s t e p e l i m i n a t i o no fc df r o mt h ec r u d ee n z y m ee x t r a c t so ft si13 8s t r a i nw a se s t a b l i s h e d t h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tc dw a su s e dt oi m m u n i z em i c et o p r o d u c ep o l y c l o n a l a n t i b o d y u s i n gs t a p h y l o c o c c a lp r o t e i naa sal i n k a g e ，t h ea n t i c di g gw a s i m m o b i l i z e dt om a g n e t i cc e l l u l o s em i c r o s p h e r e st og e n e r a t ea ni m m u n o m a g n e t i c a f f i n i t ym a t r i x ，w h i c hc o u l ds p e c i f i c a l l yi s o l a t ec df r o mt h ec r u d ee n z y m ee x t r a c t s o ft s113 8s t r a i na n de x h i b i tg o o dd u r a b i l i t y t h el - c y s t e i n ep r o d u c e db yt h ec r u d e e n z y m ee x t r a c t s ，i nw h i c hc dw a se l i m i n a t e db yt h ec o n s t r u c t e di m m u n o m a g n e t i c a f f i n i t ym a t i x ，a c c u m u l a t e dt oap e a ky i e l do f9 6 4 a n dr e m a i n e dc o n s t a n t ，w h i c h h a da ni m p r o v e m e n to f3 3 7 c o m p a r i n gt ot h eo r i g i n a ll e v e l t h e r e f o r e i tc o u l db e c o n f i r m e dt h a tc dw a st h ek e yf a c t o rt h a tr e s u l t e di nal o wl c y s t e i n ep r o d u c t i o n l e v e l i l l a b s t r a c t t of b r t h e ri n v e s t i g a t et h el - c y s t e i n eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yi nt s113 8s t r a i n ，a p r o t e o m i c se x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u tt oa n a l y z et h ed l - a t ci n d u c e dc h a n g e si n t h ee x p r e s s i o no ft o t a lp r o t e i n so ft s113 8s t r a i n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r ea t l e a s tt w e l v ep r o t e i n sd i f f e r e di nt h e i re x p r e s s i o nl e v e l sb ym o r et h a nt h r e et i m e s u n d e rd i f f e r e n ti n d u c t i o nc o n d i t i o n s m e a n w h i l e ，t h er e s u l t so fr e a l - t i m ep c r i n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fl a t ch y d r o l a s eg e n e ，l - s c ca m i d o h y d r o l a s e g e n ea n dc dg e n eu n d e rd l a t ci n d u c t i o nc o n d i t i o n ，w e r e14 3 ，1 6 2a n d15 9t i m e s r e s p e c t i v e l y , h i g h e r t h a nt h o s eu n d e rn oi n d u c t i o nc o n d i t i o n f u r t h e r m o r e ，t h e a r t i f i c i a lm ut r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e sw e r et r a n s f o r m e di n t ot sl13 8s t r a i nt o c o n s t r u c tam ut r a n s p o s o nm u t a t i o nl i b r a r yw h i c hc o n t a i n e dm o r et h a n4 ，0 0 0 m u t a n t s b ys c r e e n i n gi nap o o lo fa b o u t1 , 0 0 0m u t a n t s ，m o r et h a nt w e n t ym u t a n t s t h a td e c r e a s e do re v e nl o s tt h e i rl - c y s t e i n eb i o s y n t h e t i ca b i l i t i e sw e r ei s o l a t e d t oi m p r o v el c y s t e i n ep r o d u c t i o nl e v e l ，c da c t i v i t ys h o u l db ee l i m i n a t e do r i n h i b i t e d h o w e v e r , c dg e n et u _ r n so u tt ob ee s s e n t i a lf o rt s113 8s t r a i n ，s ot h a t c o n s t r u c t i o no fac dg e n e - d i s r u p t e dm u t a n ts t r a i nh a sn o tb e e ns u c c e s s f u l l ya c h i e v e d t h e r e f o r e ，a na l t e r n a t i v em e t h o df o ri m p r o v i n gl - c y s t e i n ep r o d u c t i o nw a sd e v e l o p e d ， i nw h i c hh y d r o x y l a m i n ew a si n t r o d u c e dt oi n h i b i tc da c t i v i t y , a n dt h ew h o l ec e l l so f t s113 8s t r a i nw a sr e p e t i t i v e l yu s e da st h ee n z y m es o u r c et oc o n v e r td l a t ct o l c y s t e i n e t h ec o n d i t i o n sf o re n z y m a t i cc o n v e r s i o no fd l a t ct ol c y s t e i n ew e r e o p t i m i z e d ，a n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo fs u b s t r a t er e a c h e d9 5 6 u n d e rt h eb e s tr e a c t i o n c o n d i t i o n s d u r i n gs i xt i m e so fr e p e t i t i v eu s o 。o ft h e e n z y m es o b r c ec e l l s ，t h e c o n v e r s i o nr a t eo fs u b s t r a t em a i n t a i n e dh i g h e rt h a n9 0 s u b s e q u e n t l y , t h et e c h n i q u e f o rt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fl - c y s t e i n ew a ss e tu p f i r s t ，t h el - c y s t e i n ei nt h e r e a c t i o nm i x t u r ew a so x i d i z e dt ol - c y s t i n e t h e nl - c y s t i n ew a sp u r i f i e da f t e rt h e r e s i na b s o r p t i o na n di s o e l e c t r i cp o i n tp r e c i p i t a t i o np r o c e d u r e s a n dap u r i t yo f9 9 1 a n day i e l do f7 8 6 w e r ea c h i e v e d a f t e rt h a t ，l - c y s t e i n ew a so b t a i n e ds u c c e s s f u l l y b ye l e c t r o l y t i cr e d u c t i o no fl c y s t i n e b a s e do nt h el - c y s t e i n ep r o d u c t i o nt e c h n o l o g y , t h el - t r y p t o p h a n p r o d u c t i o n t e c h n o l o g yw a s a l s oe s t a b l i s h e db ye n z y m a t i cc o n v e r s i o no fl - c y s t e i n ea n di n d o l et o l - t r y p t o p h a n ，w h i c hw a sc a t a l y z e db yt r y p t o p h a n a s e t h e t r y p t o p h a n a s eg e n eo fe c o l ij m 10 9w a sc l o n e da n do v e r - e x p r e s s e di ne c o l i i v a b s t r a c t b l 2 1 ( d e 3 ) u n d e rt h eo p t i m i z e de x p r e s s i o nc o n d i t i o n s ，t h e r e c o m b i n a n t t r y p t o p h a n a s ea c t i v i t yw a sa b o u t110t i m e sh i g h e rt h a nt h a to ft h eh o s ts t r a i n i n a d d i t i o n ，p c r b a s e ds i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i se x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e dt om u t a t e f o u rd i f f e r e n tr e s i d u e si nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo ft r y p t o p h a n a s e ( f 2 31r ，a 2 3 2 d ， a 2 6 5 ra n dv 2 7 4 r ) ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hr e s u l t e di nt h ed r a m a t i cd e c r e a s eo r i n a c t i v a t i o no ft r y p t o p h a n a s ea c t i v i t y t h e r e f o r e ，i ts u g g e s t e dt h a tt h ea b o v ef o u r a m i n oa c i dr e s i d u e sp l a y e dc r i t i c a lr o l e si nd e t e r m i n i n go ra f f e c t i n gt r y p t o p h a n a s e a c t i v i t y u s i n gt h ec o n s t r u c t e de c o l ic e l l st h a tp o s s e s s i n gh i g ht r y p t o p h a n a s ea c t i v i t ya s t h ee n z y m es o u r c e ，l - c y s t e i n ea n di n d o l ew e r ec o n v e r t e dt op r o d u c el - t r y p t o p h a n t h ee n z y m a t i cr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ，a n du n d e rt h eb e s tc o n d i t i o n s ，t h e c o n v e r s i o nr a t e so fl c y s t e i n ea n di n d o l ew e r e81 5 a n d7 9 1 r e s p e c t i v e l y b e s i d e s ，t h et e c h n i q u ef o rt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fl t r y p t o p h a nw a sa l s o p r e s e n t e d t h eo t h e rs u b s t a n c e si nt h er e a c t i o nm i x t u r ew e r ee x c l u d e db yu s i n gt w o d i f f e r e n tr e s i n si ns e r i e s ，a n dt h e n l t r y p t o p h a nw a s o b t a i n e da f t e re l u t i o n , d e c o m p r e s s i o nc o n c e n t r a t i o na n dd e s i c c a t i o np r o c e d u r e s t h ep u r i t ya n dy i e l do f l - t r y p t o p h a nw e r e9 8 3 a n d6 6 7 r e s p e c t i v e l y i ns u m m a r y , t h i st h e s i sd e s c r i b e dt h ee x t e n d e dr e s e a r c ho nt h em e t a b o l i cp a t h w a y o ft h ee n z y m a t i cc o n v e r s i o no fd l a t ct ol - c y s t e i n eb yt s1 13 8s t r a i n ，a n d e s t a b l i s h e dt h ep r o d u c t i o nt e c h n o l o g i e so fl - - c y s t e i n ea n dl - t r y p t o p h a nb ym i c r o b i a l a n de n z y m a t i cc o n v e r s i o n w h a tc a l n eo u to ft h er e s e a r c hh a sl a i df o t m d a t i o n sf o r b o t ht h ee v e n t u a le l u c i d a t i o no ft h em e t a b o l i cp a t h w a yo ft h ee n z y m a t i cc o n v e r s i o n o fd l - a t ct ol - c y s t e i n eb yt s1 13 8s t r a i na n dt h em a n u f a c t u r i n go fl c y s t e i n ea n d l t r y p t o p h a nu s i n gd l a t ca st h es u b s t r a t e k e yw o r d s ：l - c y s t e i n e ，l - c y s t i n e ，l t r y p t o p h a n ，e n z y m a t i cs y n t h e s i s ，p r o d u c t i o n t e c h n o l o g y , p s e u d o m o n a sp u t i d a ，m e t a b o l i cp a t h w a y , t r y p t o p h a n a s e v 符號說明 e c o i l 尸p u t i d a d l a t c l s c c l 二n c c h p l c c d p l p i p t g d a b l b p b s s d s p a g e e d t a p c r b p ，k b k d a m m s i m s m c m s i g g o p d b s a p r o a d m p e l i s a h r p t b s d t t g s h e s c h e r i c h i ac o i l p s e u d o m o n a sp u t i d a d l 2 a m i n o - 4 2 - t h i a z o l i n e - 4 - e a r b o x y l i ea c i d s - c a r b a m y l l - c y s t e i n e n - c a r b a m y l l - c y s t e i n e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y l - e y s t e i n ed e s u l f l a y d r a s e p y r i d o x a l 一5 - p h o s p h a t e i s o p r o p y l t h i o - b - g a l a c t o s i d e 3 ，3 - d i a m i n o b e n z i d i n e l u r i ab e r t a n i p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n s o d i u md o d c c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l c c t r o p h o r e s i s e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n b a s ep a i r ( s ) ，k i l o b a s e ( s ) k i l o d a l t o n ( s ) m a g n e t i cm i c r o s p h e r e s i m m u n o m a g n e t i cs e p a r a t i o n m a g n e t i cc e l l u l o s em i e r o s p h e r e s i m m u n o g l o b u l i ng o - p h e n y l e n e d i a m i n e b o v i n es e r u ma l b u m i n s t a p h y l o c o c c a lp r o t e i na d i m e t h y lp i m e l i m i d a t e e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e t r i sb u f f e rs o l u t i o n 1 ，4 - d i t h i o t h r e i t o l g l u t a t h i o n e ( r e d u c e df o r m ) 人腸桿菌 惡臭假單胞菌 d l 2 氨基彳2 噻唑啉4 羧酸 s 氨甲酰l 半胱氨酸 n 氨甲酰一l 半胱氨酸 高效液相色譜 l 半胱氨酸脫巰基酶 磷酸吡哆醛 異丙基p d 硫代半乳糖苷 3 ，3 二氨基聯(lián)苯胺 l b 培養(yǎng)基 磷酸緩沖鹽溶液 十二烷基苯磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 乙二胺四乙酸 聚合酶鏈式反應(yīng) 堿基對，千堿基 千道爾頓 磁性微球 免疫磁性分離 纖維素磁性微球 免疫球蛋白g 鄰苯二胺 牛血清白蛋白 金黃色葡萄球菌蛋白a 二甲基庚二酸酯 酶聯(lián)免疫吸附分析 辣根過氧化物酶 t r i s 緩沖鹽溶液 1 4 二硫蘇糖醇 還原型谷胱甘肽 p d a b p ( d i m e t h y l a m i n o ) b e n z a l d e h y d e 對二甲氨基苯甲醛 x i i i 南開大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本人完全了解南開大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定， 同意如下各項內(nèi)容：按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版 本；學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本和電子版，并采用影印、縮印、 掃描、數(shù)字化或其它手段保存論文；學(xué)校有權(quán)提供目錄檢索以及提供 本學(xué)位論文全文或者部分的閱覽服務(wù)；學(xué)校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國家有 關(guān)部門或者機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版；在不以贏利為目的的前 提下，學(xué)?？梢赃m當復(fù)制論文的部分或全部內(nèi)容用于學(xué)術(shù)活動。 學(xué)位論文作者簽名：屎和盜 訓(xùn)年廠月夕日 經(jīng)指導(dǎo)教師同意，本學(xué)位論文屬于保密，在年解密后適用 本授權(quán)書。 指導(dǎo)教師簽名：學(xué)位論文作者簽名： 解密時間：年月日 各密級的最長保密年限及書寫格式規(guī)定如下： r 一一、 i 內(nèi)部5 年( 最長5 年，可少于5 年) l 秘密1 0 年( 最長1 0 年，可少于1 0 年) 機密2 0 年( 最長2 0 年，可少于2 0 年) 南開大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，進行研究工作 所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本學(xué)位論文的研究成果不包含 任何他人創(chuàng)作的、已公開發(fā)表或者沒有公開發(fā)表的作品的內(nèi)容。對本論文所涉 及的研究工作做出貢獻的其他個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本學(xué) 位論文原創(chuàng)性聲明的法律責任由本人承擔。 學(xué)位論文作者簽名： 余脊螫 移遺年s 其) 日 第一章引言 第一章引言 l 半胱氨酸與l 一色氨酸在醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域均具有非常廣泛的用途。 近年來，各行業(yè)對l 半胱氨酸與l 色氨酸的需求量日益增加，而現(xiàn)有產(chǎn)量遠不 能滿足國內(nèi)外市場的需求。因此，開發(fā)微生物酶法生產(chǎn)l 半胱氨酸與l 色氨酸 的工藝路線具有廣闊的應(yīng)用前景。 本章將分別對l 廣半胱氨酸與l 色氨酸的性質(zhì)、用途以及生產(chǎn)方法展開介紹。 第一節(jié)l 一半胱氨酸概述 1 1 1l 一半胱氨酸的理化性質(zhì)【1 卅 l 半胱氨酸( l c y s t e i n e ) 是組成蛋白質(zhì)的2 0 種氨基酸之一，最早于1 8 1 0 年從膀胱結(jié)石中以胱氨酸的形式發(fā)現(xiàn)，是唯一具有活性巰基( s h ) 的氨基酸。在 蛋白質(zhì)中l(wèi) 廣半胱氨酸常以其氧化型l 廣胱氨酸的形式存在，由兩個l 半胱氨酸側(cè) 鏈上s h 基氧化成共價的二硫橋( d i s u l f i d eb r i d g e ) 連接而成。 l 半胱氨酸化學(xué)名為l 僅氨基p 巰基丙酸，分子式c 3 h 7 n 0 2 s ，相對分子質(zhì) 量1 2 1 1 2 。l - 半胱氨酸屬于脂肪族氨基酸，呈白色結(jié)晶性粉末，異臭，味酸，易 溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、苯、丙酮、乙酸乙酯、二硫化碳和四氯化 碳。其水溶液或微堿性水溶液能被空氣氧化成胱氨酸，微量鐵及重金屬可促使 其氧化，酸性溶液較為穩(wěn)定，因此通常制備成比較穩(wěn)定的l 半胱氨酸鹽酸水合 物( c 3 h 7 n 0 2 h c l h 2 0 ) 形式保存。熔點1 7 6 - - 1 7 8 ，比旋光度 】2 0 d 一1 6 5 ( h 2 0 ， c = i ) ， a 】2 u 曠+ 6 5 ( 5m o l lh c l ，c = i ) ，等電點p i - - 5 0 2 。其結(jié)構(gòu)式與立體結(jié) 構(gòu)式分別見圖1 1 和圖1 2 。 第一章引言 。s ，p 。 n h 2 l c y s l a i n e 幽lll - 、r 胱氪酸的結(jié)構(gòu)式 f i g1 1t h es t n k m m o f l 。c y s t e i n e 圈12l 半胱氮酸的立體結(jié)構(gòu) f i g1 2 t h e t h t e c m i m e n s i o n a ls n u 咖mo f l - e y s t e i n e 由于l 半胱氨酸側(cè)鏈上的巰基( s h ) 極性很強，除具有所有氨基酸能夠發(fā) 生的化學(xué)反應(yīng)外，還有些特殊的化學(xué)反應(yīng)：( 1 ) 可與鹵化烷如碘乙酸、碘乙 酰胺、甲基碘等迅速反應(yīng)生成相應(yīng)的穩(wěn)定烷基衍生物：( 2 ) 巰基可以與各種金 屬離子形成穩(wěn)定程度小等韻絡(luò)合物；( 3 ) 可與二硫硝基苯甲酸( d i t h i o n i t r o b e n z o i c a c i d ，d t n b ) 或稱e l l m a n 氏試劑，發(fā)生硫醇二硫化物交換反應(yīng)；( 4 ) 兩分子 l 半胱氨酸自身氧化成一分子l 胱氨酸。 2l - 半胱氨酸的應(yīng)用 根據(jù)構(gòu)型的不同，半胱氨酸有l(wèi) 型、d 型和d l 型之分，而在體內(nèi)具有生理 活性的為l 型的半胱氨酸。l 半胱氧酸是組成蛋白質(zhì)的成分之一，是一種n 氨 基酸它的存在可以保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，同一條或不同多肽鏈兩個l 半胱氨 酸殘基間以_ _ 硫鍵( 一s s 一) 連接，使蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的空唧立體結(jié)構(gòu)【2 ，”。l - 半胱氨酸在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)具有廣泛的用途，日益受到重視。 1 12 1 在醫(yī)藥中的應(yīng)用 l 半胱氨酸及其復(fù)合體在人和動、植物體內(nèi)是普遍存在的，是生命體內(nèi)一種 重要的生理括性物質(zhì)，它作為還原型谷胱甘肽的底物可以增加谷胱甘肽的生成 量，從而保護細胞膜的穩(wěn)定性減輕心肌細胞在缺血再灌流中的損傷。此外， 它可以增加細胞和組織的活力h 】，刺激前t 淋巴細胞分化為成熟的淋巴細胞，增 加人體對某些毒素的抵御能力。 l 一半胱氨酸在生物體內(nèi)可直接攻擊一些有害物質(zhì)，并將其排出體外，對生物 體起到了保護作j _ 】。有實驗證明將甲醛和乙醛注入小鼠的皮f ，l 刊時注入l - 半 胱氨酸和抗壞血酸形成的復(fù)合體，者均不在小鼠的肝中積蓄，m 是與l 一半胱 第一章引言 氨酸形成復(fù)合物通過新陳代謝迅速排出體外。反之如果不用l 半胱氨酸和抗壞 血酸復(fù)合物處理，甲醛和乙醛則在肝臟中大量的蓄積，造成中毒。 l 半胱氨酸及其復(fù)合體在醫(yī)療方面的功效，已日漸引起關(guān)注，近年來的研究 認為l 半胱氨酸主要具有以下幾種生理功能： 1 在生物體內(nèi)l 半胱氨酸對許多有害物質(zhì)和毒素如甲醛、乙醛、乙醇、氯 仿、四氯化碳、鉛、鎘、氯化汞、過氧化酯和河豚毒素等具有有效的解毒作用。 2 用l 半胱氨酸可以有效地預(yù)防和改善放射性物質(zhì)對機體的傷害。 3 當發(fā)生炎癥或過敏時，機體內(nèi)膽堿酯酶等巰基酶的活性降低，補給l - 半胱氨酸可維持巰基酶的活性，改善炎癥和過敏的皮膚癥狀。 4 由于l 半胱氨酸具有軟化和溶解角質(zhì)的作用，所以對角質(zhì)肥厚的皮膚病 也有效。 5 l 廣半胱氨酸在皮膚蛋白的角蛋白生成中具有維持巰基酶的活性，并且可 以補充巰基，維持皮膚的正常代謝。 6 l - 半胱氨酸還具有防止生物體衰老的功能。 根據(jù)文獻報道【6 】，l 半胱氨酸的衍生物在醫(yī)藥上也有著廣泛的用途。特別是 對n 一乙酰l 半胱氨酸的研究報道較多。近年來，在醫(yī)藥上應(yīng)用比較多的l 半胱 氨酸衍生物有以下幾種： 1 n 乙酰l 半胱氨酸【7 8 l ：n 乙酰l 半胱氨酸是一種有效的祛痰劑，是一 種呼吸道粘液的溶解劑，通過其分子中的s h 能使粘液中粘蛋白的s s 鍵斷裂， 使痰液易于咳出或吸出，改善呼吸狀況，適用于治療肺合并癥以及急慢性支氣 管炎、支氣管哮喘、支氣管擴張、肺結(jié)核、肺炎和肺氣腫等引起的痰液稠厚、 咳痰困難與氣管阻塞等。l 半胱氨酸乙酯鹽酸鹽可用于治療肝炎和肝硬化病人， 增強肝功能，并可用于治療白血球減少癥以及放射線所造成的損害。常與異丙 腎上腺素等支氣管擴張藥合用，可以減少副作用、增強其療效且生成物無毒。 此外3 n 乙酰l 半胱氨酸的水溶液可作為眼藥水治療點狀角膜炎、單純皰疹 性角膜炎、細胞性角膜潰瘍和堿性化學(xué)燒傷等。還可在氨基酸大輸液中作為穩(wěn) 定劑【4 1 。n 乙酰l 半胱氨酸也是一種有效的膠原酶抑制劑和抗氧化劑。當在體 內(nèi)的濃度超過5 5 時，能降低豬的蛋白水解酶、白細胞彈性酶和胰彈性酶的活 性。另外，它可以用作抑制劑抑制身體內(nèi)由于癌病變引起的組織、細胞壞死【9 】。 n 乙酰l 半胱氨酸能直接清除自由基，參與還原型谷胱苷肽的合成，對氰 化鈉的中毒也有解