（動(dòng)物學(xué)專業(yè)論文）大熊貓基因組bac文庫(kù)及Ⅱ類mhc基因組物理圖譜構(gòu)建.pdf

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的 研究成果 據(jù)我所知 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外 論文中不包含其 他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果 也不包含為獲得逝鎏盤堂或其他教育機(jī)構(gòu) 的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料 與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均 已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意 學(xué)位論文作者簽名 曾長(zhǎng)軍簽字日期 2 0 0 7 年8 月2 7 日 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及 類m h c 基岡組物理圖譜構(gòu)建 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 本學(xué)位論文作者完全了解逝望盤鱟 有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤 允許論文被查閱和 借閱 本人授權(quán)逝鎏盤堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù) 進(jìn)行檢索 可以采用影印 縮印或掃描等復(fù)制手段保存 匯編學(xué)位論文 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū) 學(xué)位論文作者簽名 導(dǎo)師簽名 簽字日期 年月日 簽字日期 年月日 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向 工作單位 通訊地址 電話 郵編 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 中文摘要 大熊貓 a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a 是我國(guó)特有的珍稀瀕危野生動(dòng)物 長(zhǎng)期以 來(lái) 棲息地片段化和種群數(shù)量下降 致使其野外僅分布于秦嶺 岷山 邛崍 大 相嶺 小相嶺和涼山等6 個(gè)相互隔離的山系 并分化為兩個(gè)獨(dú)立的亞種 秦嶺 亞種和指名亞種 為搶救性的保護(hù)大熊貓這一珍稀瀕危物種 我國(guó)政府于2 0 0 3 年啟動(dòng)了大熊 貓的離體保護(hù)工程 該工程的主要內(nèi)容之一 就是通過(guò)建立大熊貓的基因組d n a 文庫(kù) 達(dá)到保護(hù)其遺傳資源 并為相關(guān)的基礎(chǔ)科學(xué)研究提供基因材料平臺(tái)的目的 本論文以細(xì)菌人工染色體 b a c 為載體 建立了高容量的大熊貓基因組 d n a 文庫(kù) 進(jìn)一步地 通過(guò)對(duì)大熊貓i i 類主要組織相容性復(fù)合體 m h c 基因 組物理圖譜的構(gòu)建 既驗(yàn)證了該文庫(kù)的有效性 又對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了基礎(chǔ)研究的應(yīng)用 達(dá)到了立題目的 其主要研究結(jié)果如下 1 以新鮮外周血為材料 利用p c c l b a c 載體 成功構(gòu)建了大熊貓的基因 組細(xì)菌人工染色體 b a c 文庫(kù) 文庫(kù)包含的2 0 5 8 0 0 個(gè)b a c 克隆 保 存于2 1 0 0 塊9 6 孔培養(yǎng)板上 經(jīng)對(duì)隨機(jī)挑取的1 7 4 個(gè)b a c 克隆進(jìn)行脈沖 電泳檢測(cè) 計(jì)算出文庫(kù)的平均插入片段為9 7 k b 覆蓋大熊貓基因組約6 8 倍 除去5 7 4 的空載體 同時(shí) 從文庫(kù)中獲得任一單拷貝或多拷貝大 熊貓基因的概率為9 9 9 3 2 1 6 對(duì)p c r 引物平均每對(duì)能夠在文庫(kù)中成功擴(kuò)增到6 4 個(gè)陽(yáng)性克隆 表明 了所建文庫(kù)具有較高的覆蓋率 3 運(yùn)用4 d p c r 文庫(kù)篩選技術(shù) 建立了大熊貓基因組b a c 文庫(kù)的高效p c r 篩選文庫(kù) 該文庫(kù)包括4 3 個(gè)超級(jí)庫(kù)和1 4 6 2 4 3 x 3 4 個(gè)1 d 2 d 3 d 4 d 超級(jí)亞庫(kù) 任一引物或探針只需7 7 個(gè)p c r 反應(yīng) 即可從b a c 文庫(kù) 中篩選到所需的陽(yáng)性b a c 克隆 4 以大熊貓皮膚成纖維細(xì)胞為材料 運(yùn)用染色體熒光原位雜交 f i s h 技 術(shù) 成功地將大熊貓的m h ci i 類基因組定位于第9 號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及i i 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 5 通過(guò)g e n b a n k 數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列 設(shè)計(jì)了1 0 對(duì)大熊貓m h ci i 類基因 的特異性引物 并成功擴(kuò)增到了大熊貓l i 類m h c 的b t l 2 d r a d q a d r b l d o b l m p 2 d m a d m b c o l l l a 2 和d a x x 基因 基因序 列已提交g e n b a n k 數(shù)據(jù)庫(kù) 6 運(yùn)用b a c 克隆的末端測(cè)序方法 并利用上述1 0 對(duì)引物 構(gòu)建了大熊貓 m h ci i 類基因組的物理圖譜 進(jìn)一步地 利用限制性酶切指紋圖譜法 證明了所構(gòu)建的物理圖譜中的b a c 克隆是有效重疊的 其m h ci i 類基 因組的長(zhǎng)度約為6 5 0 k b 關(guān)鍵詞 大熊貓 基因組b a c 文庫(kù) 染色體熒光原位雜交 m h c 基因組染色體 定位 m h ci i 類基因組物理圖譜 限制性酶切指紋圖檢驗(yàn) 2 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及l(fā) l 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 a b s t r a c t t h eg i a n tp a n d a a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a p a n d ai sr a r ea n de n d a n g e r e ds p e c i e s e n d e m i ct oc h i n a u n f o r t u n a t e l y d u et oh a b i t a tf r a g m e n t a t i o n t h ep o p u l a t i o ns i z eo f g i a n tp a n d ad e c l i n er a p i d l y n o w t h ew i l dg i a n tp a n d a sd i s t r i b u t es i xc o m p l e t e l y i s o l a t e dm o u n t a i nr a n g e ss u c ha sq i n l i n gm o u n t a i n m i n s h a nm o u n t a i n q i o n g l a i m o u n t a i n x i a n g l i n gm o u n t a i na n dl i a n g s h a nm o u n t m n m o r e o v e r t h eg i a n tp a n d a p o p u l a t i o ns h o w ss i g n i f i c a n tg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o na n dy i e l dt w oe v o l u t i o n a r i l y s i g n i f i c a n tu n i t s e s u an e wq i n l i n gs u b s p e c i e sf r o mt h en o m i n a t es i c h u a n s u b s p e c i e s i no r d e rt op r o t e c tt h i sr a r ea n de n d a n g e r e ds p e c i e s t h ec h i n e s eg o v e r n m e n t i m p l e m e n t st h eg e n er e s o u r c e sc o n s e r v a t i o np r o j e c tf o l l o w e db yt h e n s i t ua n d e x s t uc o n s e r v a t i o np r o j e c t so fg i a n tp a n d ai n2 0 0 3 o n eg o a lo ft h ep r o j e c ti s c o n s e r v e st h eg e n e t i cr e s o u r c e sb yc o n s t r u c t i n gt h eg e n o m i cd n a l i b r a r ya n dp r o v i d e t h eg e n er e s o u r c e sp l a t f o r mf o rr e l a t e ds c i e n t i f i cr e s e a r c h a st h em a i np a r to fg i a n tp a n d ag e n er e s o u r c e sc o n s e r v a t i o np r o j e c t t h ep r e s e n t s t u d yi st oc o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fh i g hc o v e r a g eg e n o m i cd n al i b r a r y t h e nf u r t h e rr e s e a r c h ss h o wt h a t t h i sg e n o m i cb a cl i b r a r yi sh i g hq u a l i t ya n d e f f e c t i v eb yc o n s t r u c t i n gp h y s i c a lm a po fm h cc l a s si io fg i a n tp a n d a t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 t h eg i a n tp a n d ab a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e b a c l i b r a r yc o n s i s t i n go f 2 0 5 8 0 0c l o n e sh a sb e e nc o n s t r u c t e du s i n gt h ew h o l eb l o o da n dp c c l b a c v e c t o r t h ea v e r a g ei n s e r ts i z ew a sc a l c u l a t e dt ob e9 7k bb a s e do nt h e e x a m i n a t i o no f16 4r a n d o m l ys e l e c t e dc l o n e s i n d i c a t i n gt h a tt h eg i a n tp a n d a l i b r a r yc o n t a i n e d6 8 f o l dg e n o m ee q u i v a l e n t s a b o u t5 7 4 n o n i n s e r tc l o n e s w e r eo b s e r v e di nt h e1 7 4c l o n e st e s t e d 1 0o u to f1 7 4 t h ep r o b a b i l i t yo fa n y g i a n tp a n d ag e n eb e i n gf o u n di nt h i sl i b r a r ys h o u l db ea b o u t9 9 9 3 2 t w oo rm o r ep o s i t i v ec l o n e s 2 16 w e r ef o u n df o rt h e s e16l o c i w i t ha n a v e r a g eo f6 4p o s i t i v ec l o n e sp e rl o c u s t h ep c rs c r e e n i n gr e s u l t sw e r et h u s 3 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及i i 類m i i c 基因組物理圖譜構(gòu)建 i ng o o da g r e e m e n tw i t ha l le x p e c t e d6 8 一f o l dg e n o m i cc o v e r a g eo ft h el i b r a r y 3 c o n s t r u c t i o no fh i g h e f f e c t i v er a p i ds c r e e n i n gl i b r a r i e sb y4 d p c r t h e 2 0 5 8 0 0b a cc l o n e sw e r ed i v i d e di n t o4 3s u p e r p o o l sa n d1 4 6 2 4 3 x 3 4 s u b s u p e r p o o l so f1 d 2 d 3 d 4 d w ec a no b t a i nt h ed e s i r e dp o s i t i v eb a c c l o n e sb ya n yp r i m e r so rp r o b e st h r o u g h7 7p c rr e a c t i o n s 4 t h eg i a n tp a n d am e t a p h a s ec h r o m o s o m e sw e r ep r e p a r e df r o mf i b r o b l a s tc e l l s o fg i a n t p a n d a t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h em h ci sl o c a t e do nt h e c h r o m o m s e9 q b yf l u o r e s e c e n c e ns t uh y b r i d i z a t i o n 5 w eh a v ed e s i g n e d1 0g i a n tp a n d am h cc l a s si ig e n ep c rp r i m e r sb yt h e h o m o l o g sc o u n t e r p a r to ft h em h c c l a s si ii nt h eg e n b a n kd a t a b a s e a l lt h e p r i m e r sw e r ea m p l i f i e ds u c c e s s f u l l ya n dt h ep c rp r o d u c t so fb t l 2 d r 氣 d q a d r b l d o b l m p 2 d m a d m b c o l l l a 2a n dd a x xw e r e s u b m i t t e dt og e n b a n k 6 t h ep h y s i c a lm a po fm h cc l a s si io fg i a n tp a n d aw a sc o n s t r u c t e db y s c r e e n i n gt h eg e n o m i cb a cl i b r a r yu s i n g1 0m h c c l a s si ig e n ep r i m e r s t h e e n ds e q u e n c i n gp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt op o s i t i v eb a cc l o n e sa n d s c r e e nf u r t h e rt h eg i a n tp a n d ag e n o m i cb a c l i b r a r yt oc o v e rt h eg a p so f p h y s i c a lm a p a c c o r d i n gt ot h er e s t r i c t i o nf i n g e r p r i n ta n a l y s i sa n dt e s t t h e w h o l e p h y s i c a lm a p o fm h cc l a s si ir e g i o nw a s s p a n n i n ga b o u t6 5 0 k b k e y w o r d g i a n tp a n d a g e n o m i cb a cl i b r a r y f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n c h r o m o s o m em a p p i n go fm h c p h y s i c a lm a po fm h cc l a s si i r e s t r i c t i o n f i n g e r p r i n ta n a l y s i s 4 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 第一章文獻(xiàn)綜述弟一早義陬琢鹼 第一節(jié) 基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容和方法 基因組 g e n o m e 是w i n k l e r 予1 9 2 0 年首次提出的 w i n k l e r 1 9 2 0 它表 示的是一個(gè)物種全部的遺傳物質(zhì)的總和 包括了所有的基因和基因與基因之間的 間隔區(qū)域 基因組學(xué)的定義及其內(nèi)容 一個(gè)物種的基因組蘊(yùn)藏著它的生命和 或 繁殖所需的全部生物學(xué)信息 而 基因組學(xué) g e n o m i c s 則是現(xiàn)代分子生物學(xué)中解析基因組結(jié)構(gòu) 功能及其相關(guān)信 息分析的 f q 前沿分支學(xué)科 p a s s a r g e 2 0 0 1 h i e t e r b o g u s k i 1 9 9 7 1 9 8 7 年 g e n o m i c s 專業(yè)學(xué)術(shù)期刊的創(chuàng)刊 標(biāo)志著這一新興前沿學(xué)科的誕生 基因組學(xué)與遺傳學(xué) g e n e t i c s 的區(qū)別在于 前者包含了與分子和細(xì)胞生物 學(xué)有關(guān)的諸多方面 如基因組圖譜 核酸測(cè)序 組裝 儲(chǔ)存 數(shù)據(jù)管理 基因識(shí) 別 功能預(yù)測(cè) 基因組進(jìn)化和眾多生物基因組之間的比較等等 p a s s a r g e 2 0 0 1 而后者則主要研究遺傳 h e r e d i t y 及其相關(guān)的機(jī)制和結(jié)果等 因此 基因組研 究的主要內(nèi)容 就包括了以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué) s t r u c t u r a l g e n o m i c s 和以功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué) f u n c t i o n a lg e n o m i c s 兩大方面 其中 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)是基因組研究的早期階段 主要以建立物種高分辨率的遺傳 物理和轉(zhuǎn)錄圖譜 以及蛋白質(zhì)或生物大分子的三維結(jié)構(gòu)為主 t e i c h m a n ne t a 1 1 9 9 9 b l u n d e l l m i z u g u c h i 2 0 0 0 而功能基因組學(xué)則是利用結(jié)構(gòu)基因組 學(xué)提供的信息 系統(tǒng)地研究基因的功能 它以高通量 大規(guī)模實(shí)驗(yàn)以及計(jì)算機(jī)輔 助分析等為其主要特征 h i e t e r h i e t e r 1 9 9 7 趙劍華等 2 0 0 0 5 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及i l 類m h c 基岡組物理圖譜構(gòu)建 2 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容和方法 2 1 遺傳圖譜 遺傳圖譜 g e n e t i cm a p 又稱為連鎖圖譜或遺傳連鎖圖譜 是以具有遺傳多 態(tài)性的遺傳標(biāo)記為 路標(biāo) 以基因座之間的重組率 1 的重組率為l c m 為 圖 距 的基因組圖 方福德等 1 9 9 8 遺傳圖譜的繪制是基因組學(xué)研究的第一步 它以染色體上某一位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記 并輔以與之相對(duì)應(yīng)的遺傳性狀 經(jīng)過(guò)連鎖分 析 將編碼該性狀的基因定位于特定的染色體上 自b o t s t c i n 等人根據(jù)r f l p 限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性 的特點(diǎn)提出用r f l p 等d n a 標(biāo)記來(lái)構(gòu)建遺傳圖譜 b o t s t e i ne ta 1 1 9 8 0 以來(lái) 遺傳圖便逐漸成為了基 因克隆與定位等相關(guān)研究的重要工具 并在研究基因的功能 定位及分離克隆新 基因 舫i j d n a 片段和研究染色體上基因的順序等方面發(fā)揮著重要作用 l a n d e r b o t s t e i n 1 9 8 5 g e b h a r d te ta 1 1 9 9 5 如s a i t o 等利用r f l p 構(gòu)建了人6 號(hào)染色體 長(zhǎng)臂的遺傳連鎖圖 對(duì)于分離克隆潛在的腫瘤抑制基因以及其它遺傳疾病的研究 具有重要的意義 s a i t o n a k a m u r a 1 9 9 3 但是 由于r f l p 在染色體組中的 分布極不均勻 且提供的多態(tài)信息十分有限 因此 要繪制高密度的遺傳圖是非 常困難的 b o t s t e i ne ta 1 1 9 8 0 于是 在r f l p 的基礎(chǔ)上 結(jié)合女i i a f l p r a p d 生化標(biāo)記 性狀標(biāo)記位點(diǎn)及以簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài) 生 s s l p 標(biāo)記如微衛(wèi)星 小衛(wèi)星 等為基礎(chǔ)的第二代遺傳圖譜 d o b u v s k ye ta 1 1 9 9 5 y u a ne ta 1 1 9 9 7 繪制出 了更加精細(xì)的遺傳圖 m e n ze ta 1 2 0 0 2 o u e d r a o g oe ta 1 2 0 0 2 f e r r e i r ae ta 1 2 0 0 0 w h i s s o ne ta 1 1 9 9 5 k i s se ta 1 1 9 9 3 如o u 6 d r a o g o 等就利用a f l p r f l p r a p d 生化標(biāo)記以及一些生物性狀位點(diǎn)構(gòu)建了豇豆的遺傳連鎖圖 對(duì)于豇豆育種中的標(biāo) 記輔助選擇 圖位克隆等研究具有重要的指導(dǎo)價(jià)值 o u e d r a o g oe ta 1 2 0 0 2 由 此使遺傳圖譜顯示出了更高的應(yīng)用價(jià)值 隨著基因組研究的進(jìn)一步深入 該領(lǐng)域又相繼出現(xiàn)了以s n p s 單核苷酸多 態(tài)性 為標(biāo)記的第三代遺傳圖譜 g a r g e ta 1 1 9 9 9 s n p 是指在染色體基因組 水平上由于單個(gè)核苷酸的變異而引起的d n a 序列多態(tài)性 包括單堿基的轉(zhuǎn)換 顛換 插入以及缺失等 v i g n a lc ta 1 2 0 0 2 由于s n p s 可以在基因組的編碼區(qū) 和非編碼區(qū)廣泛存在 且其標(biāo)記數(shù)目多 覆蓋密度大 因而在基因定位等方面的 6 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及i l 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 研究中 第三代遺傳圖譜就有著其他標(biāo)記系統(tǒng)無(wú)可比擬的優(yōu)越性和發(fā)展?jié)摿?d a v i s h a m m a r l u n d 2 0 0 6 2 2 物理圖譜 物理圖譜 p h y s i c a lm a p 是以特定的d n a 序列為標(biāo)記所構(gòu)建的染色體圖 其中 最粗略的物理圖譜是染色體的組型圖 如t i a n 等通過(guò)對(duì)小熊貓 r e dp a n d a 核型分析 表明小熊貓具有2 n 3 6 條染色體 t i 鋤e ta 1 2 0 0 2 而最精確的物理 圖譜便是核苷酸的序列圖 人類基因組全序列等 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 促進(jìn)了 第一個(gè)物理圖譜s v 4 0 的完成 d a n n a n a t h a n s 1 9 7 1 繼后 隨著y a c b a c 肌 c 等新克隆技術(shù)的建立 以及克隆片段長(zhǎng)度s t s 序列標(biāo)簽位點(diǎn) 成為有 力的物理圖標(biāo) 使得相關(guān)物理圖譜的制作水平得到了很大的提高 從而保證了物 理圖譜的連貫性 o l s o ne ta 1 1 9 8 9 于軍 1 9 9 8 目前 常見(jiàn)的物理圖譜有s t s 圖譜 y a c 酵母人工染色體 圖譜 p a c 噬菌體人工染色體 圖譜 以及 b a c 細(xì)菌人工染色體 圖譜等 迄今 構(gòu)建物理圖譜的方法主要有以下幾種 a 限制性內(nèi)切酶作圖 該方法是最經(jīng)典的物理圖譜制作法之一 當(dāng)一個(gè)克 隆或d n a 片段被限制性內(nèi)切酶酶切成不同長(zhǎng)度的片段時(shí) 便形成了通常所稱的 d n a 指紋 d n a f i n g e r p r i n t 但這種指紋圖譜是沒(méi)有順序的 這類比較有代表 性的圖譜題c o l i c e l e g a n s 和酵母的物理圖譜 k o h a r ae ta 1 1 9 8 7 c o u l s o ne ta 1 1 9 8 6 o l s o ne ta 1 1 9 8 6 繼后 在單酶切法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的多酶完全酶切 法 m u l t i p l e c o m p l e t e d i g e s t m c d 則比上述的d n a 指紋圖更具有準(zhǔn)確 可 自動(dòng)化和規(guī)?；奶攸c(diǎn) 已被廣泛地應(yīng)用于酵母 人等的大規(guī)模測(cè)序和精細(xì)物理 圖譜的研究工作中 g i l l e t te ta 1 1 9 9 6 y u w o n g 1 9 9 7 w o n ge ta 1 1 9 9 7 b 序列標(biāo)簽位點(diǎn) s t s 作圖 o l s o n 等人根據(jù)物理圖譜的制作需要 提 出并建立了序列標(biāo)簽位點(diǎn) s t s 的作圖技術(shù) o l s o ne ta 1 1 9 8 9 s t s 的來(lái)源 包括e s t 已知遺傳標(biāo)記 隨機(jī)測(cè)序序列和末端測(cè)序等 從而使得低分辨率物理 圖譜的制作水平發(fā)生了新的飛躍 1 9 9 7 年人類第7 號(hào)染色體和x 染色體物理圖譜 的制作 就是基于該技術(shù)完成的 其分辨率達(dá)到了1 0 0 k b b o u f f a r de ta 1 1 9 9 7 n a g a r a j ae ta 1 1 9 9 7 其后 愈來(lái)愈多的基于s t s 的高密度和高分辨率的物理圖 譜得以順利完成 b a y s a le ta 1 1 9 9 7 m u m me ta 1 1 9 9 8 b l a n c oe ta 1 1 9 9 8 7 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及i l 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 s r i v a s t a v ae ta 1 1 9 9 9 從而使s t s 作圖技術(shù)成為了物種遺傳物理圖譜制作研究 的首選技術(shù) c 其它物理圖譜作圖法 除了以上2 種作圖法以外 以原位雜交 k 1 0 c k a r se t a 1 1 9 9 6 為標(biāo)記的光學(xué)作圖或染色體顯微切割及輻射雜交作醫(yī) r a d i a t i o n h y b r i d m a p p i n g r h 也是制作物理圖的常用方法 r o b i c e ta 1 2 0 0 1 m a r t i n s w e s se ta 1 2 0 0 3 其中 r h 作圖法由于可以產(chǎn)生高分辨率的物理圖 因而可以用于多個(gè) 物種之間共線性區(qū)域保守 s y n t e n yc o n s e r v a t i o n 程度的研究 g o l d a m m e re ta 1 2 0 0 2 2 3 基因組測(cè)序 隨著遺傳圖譜和物理圖譜的完成 以及熒光自動(dòng)分析儀的發(fā)明 h u n k a p i l l e r e ta 1 1 9 9 1 使得物種大規(guī)?；蚪M測(cè)序的工作成為了可能 1 9 7 7 年在英國(guó) s a n g e r 實(shí)驗(yàn)室首先完成了第一個(gè)生命基因組 p h ix 1 7 4 序列的測(cè)定 s a n g e re ta 1 1 9 7 7 基因組測(cè)序的最終目標(biāo) 是獲得目的生物體基因組的全部d 晰列 對(duì)于較小的基因組如噬菌體 b a c c o s m i d f o s m i d 細(xì)菌和質(zhì)粒 通常采用 的方法是隨機(jī)鳥(niǎo)槍法測(cè)序 它通過(guò)序列的拼接和組裝 完成基因組的完整序列 a n d e r s o ne ta 1 1 9 8 1 b a e re ta 1 1 9 8 4 a k a n u m a 2 0 0 2 對(duì)于較大的基因組而 言 則可以采用全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序 w h o l eg e n o m es e q u e n c i n g w g s f l e i s c h m a n ne ta 1 1 9 9 5 m o x o n 1 9 9 5 w e b b e r m y e r s 1 9 9 7 克隆重疊群 c l o n eb yd o n e 基礎(chǔ)上的鳥(niǎo)槍法測(cè)序 c a ie ta 1 2 0 0 1 c h e ne ta 1 2 0 0 4 k h o r a s a n ie ta 1 2 0 0 4 以及隨機(jī)定向測(cè)序 d i r e c t e ds e q u e n c i n g 戰(zhàn)略 定向測(cè)序 技術(shù)是充分利用鳥(niǎo)槍法快速測(cè)序和物理圖譜的有序排列優(yōu)點(diǎn) 并在克服了上述兩 種測(cè)序方法的不足后發(fā)展起來(lái)的 目前 改方法已得到了廣泛的應(yīng)用 m a l y k he t a 1 2 0 0 4 3 功能基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容和方法 近年來(lái) 隨著人類和一些動(dòng)物 植物及微生物基因組計(jì)劃的完成 基因組學(xué) 的研究便步入了后基因組時(shí)代 功能基因組學(xué) f u n c t i o n a lg e n o m i c s 8 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及i i 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 w o y c h i ke ta 1 1 9 9 8 功能基因組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容 就是在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)豐富 信息資源的基礎(chǔ)上 利用大通量的試驗(yàn)方法并結(jié)合統(tǒng)計(jì)與計(jì)算機(jī)分析 研究生物 在其生長(zhǎng) 發(fā)育和繁殖等生命過(guò)程中相關(guān)基因的功能 表達(dá)調(diào)控 基因與蛋白質(zhì) 之間的相互作用等 h i e t e r b o g u s k i 1 9 9 7 3 1 基因的功能 表達(dá)及調(diào)控研究 在不同的組織和發(fā)育階段 基因的表達(dá)模式是不同的 由于常規(guī)的r t p c r 技術(shù) r n a 印跡雜交技術(shù)等方法一次只能研究一個(gè)或幾個(gè)基因的功能和表達(dá)情 況 因此 高通量的基因表達(dá)分析技術(shù) 微陣列 d n am i c r o a r r a y 及基因表 達(dá)系列分析 s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n s a g e 便應(yīng)運(yùn)而生 d n 礎(chǔ)敖陣列技 術(shù)始 t 1 9 9 5 年s c h e n a 等用于擬南芥4 5 個(gè)基因表達(dá)模式的定量分析研究 s c h e n ae t a 1 1 9 9 5 并多用于基因表達(dá)研究及點(diǎn)突變 s n p 分析 h e l l e r 2 0 0 2 盡管所有 的d n a 微陣列都是基于核酸序列間的雜交互補(bǔ) 但是 其技術(shù)選擇在不同的微 陣列平臺(tái)間卻存在著廣泛的差異 h a r d i m a n 2 0 0 4 這些平臺(tái)之間最主要的差別 在于探針的長(zhǎng)度 d r a g h i c ie ta 1 2 0 0 6 微陣列可分為兩種 其一是c d n a 微陣列 它的探針通常來(lái)自于p c r 擴(kuò)增的產(chǎn)物 長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)千個(gè)b p 其二是寡核苷酸微陣 列 分為短寡核苷酸微陣y u 2 5 3 0 m e r 署1 長(zhǎng)寡核苷酸微陣歹u 6 0 7 0 m e r 或更長(zhǎng)序 列 此外 d n a 微陣列技術(shù)除了在分子生物學(xué)和基因組學(xué)中的應(yīng)用外 還在 藥物基因組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué) 傳染病 遺傳疾病和癌癥的診斷 法醫(yī)學(xué)和遺傳識(shí) 別等方面具有重要的作用 為了大規(guī)模測(cè)定基因的表達(dá) 1 9 9 2 年o k u b o 等人提出了基因表達(dá)的物理圖譜 的概念 o k u b oe ta 1 1 9 9 2 其主要的策略就是測(cè)定c d n a3 端的部分序列 比較 不同組織類型的細(xì)胞中c d n a 的種類和數(shù)量 1 9 9 5 年v e l c u l e s c u 等人提出了s a g e 能夠定量和同時(shí)分析大量的基因表達(dá) 轉(zhuǎn)錄本 的方法 v e l c u l e s c ue ta 1 1 9 9 5 它提供了廣泛的定量分類和比較不同發(fā)育階段基因表達(dá)情況的分析手段 s a g e 技術(shù)區(qū)別于差異顯示 消減雜交等方法的主要特點(diǎn)在于 它可尋找低豐度 低表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄本 最大限度地收集基因組的表達(dá)信息 c a r o n 等人運(yùn)用s a g e 技術(shù)構(gòu)建了人類全基因組水平上的m r n a 表達(dá)譜 該表達(dá)譜包含了人類1 2 種類型 的組織的2 4 5 萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄標(biāo)簽 發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)豐度的基因成簇分布于染色體的特定 9 浙江大學(xué)博十學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及i l 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 區(qū)域 e a t o ne ta 1 2 0 0 1 同時(shí)也為在癌癥研究中那些過(guò)量表達(dá)或沉默表達(dá)基因的 研究提供了有效的分析工具 此外 通過(guò)這些基因表達(dá)譜的研究 也為尋找新基 因提供了有效的手段 例如x u 等人便是利用s a g e 技術(shù)分析了雄性激素調(diào)控基因 的不同組織的表達(dá)譜后 發(fā)現(xiàn)了p e m a e l 新基因 x ue ta 1 2 0 0 0 此外 通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立模式生物的方法 是研究基因功能的 主要手段之一 而r n a i r n ai n t e r f e r e n c e 技術(shù)則是通過(guò)在r n a 水平上的表達(dá)抑 制來(lái)直接研究基因的具體功能 f i r ee ta 1 1 9 9 8 進(jìn)一步的研究表明 在多種動(dòng)物 體內(nèi)均存在d s r n a 介導(dǎo)的r n a i 現(xiàn)象 這表明r n a i 是生物界普遍存在的r n a 水平 上的基因調(diào)節(jié)方式 因此r n a i 已成為大規(guī)模遺傳篩選和基因功能鑒定等相關(guān)研 究的最有效手段 3 2 蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)的相互作用研究 由于大部分細(xì)胞的生命活動(dòng)發(fā)生在蛋白質(zhì)水平而z e r n a 水平 因此 即使 清楚了基因的表達(dá)情況 也難以闡明基因的實(shí)際功能 因?yàn)榛蛟谏矬w上的功 能最終由其編碼的蛋白質(zhì)來(lái)體現(xiàn) 趙劍華等 2 0 0 0 為此 以闡明生物體內(nèi)的 蛋白質(zhì)表達(dá)模式和功能模式為目標(biāo)的蛋白質(zhì)組學(xué) p r o t e o m i c s 便是功能基因 組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一 蛋白質(zhì)組 p r o t e o m e 最初是哇t w a s i n g e r 等人于1 9 9 5 年 提出來(lái)的 它表示基因編碼的全部蛋白質(zhì) w a s i n g e re ta 1 1 9 9 5 蛋白質(zhì)組是動(dòng) 態(tài)的 具有時(shí)空性和動(dòng)態(tài)性 能夠反映基因的表達(dá)時(shí)問(wèn) 表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)翻 譯后的加工修飾和亞細(xì)胞分布等 蛋白質(zhì)組的分析主要包括蛋白質(zhì)的分離與鑒定 雙向凝膠電泳技術(shù) o f a r r e l l 1 9 7 5 g o r ge ta 1 2 0 0 0 和質(zhì)譜技術(shù) m a s ss p e c t r o m e t r y m s 是公認(rèn)的蛋白質(zhì)研究 的標(biāo)準(zhǔn)方法 g o r ge ta 1 2 0 0 4 總的說(shuō)來(lái) 隨著基因組計(jì)劃的進(jìn)一步深入 基因 組學(xué)研究的內(nèi)容也在不斷的拓展并衍生出新的交叉學(xué)科和新的技術(shù) 如生物信息 學(xué) b i o i n f o r m a t i c s 貝j j 是以生物大分子為研究對(duì)象 以計(jì)算機(jī)為工具 運(yùn)用數(shù)學(xué)和 信息學(xué)的相關(guān)理論和方法來(lái)研究生命現(xiàn)象及海量的序列數(shù)據(jù) 其主要研究?jī)?nèi)容包 括序列分析和比對(duì) 基因識(shí)別 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 分子進(jìn)化和數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)等 而 比較基因組學(xué) c o m p a r a t i v eg e n o m i c s 貝j j 是通過(guò)物種之間基因 基因家族及基因組 區(qū)域的比較分析 來(lái)揭示基因 基因家族的起源 功能及其在進(jìn)化過(guò)程中的復(fù)雜 1 0 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及u 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 機(jī)s t f r a z e re ta 1 2 0 0 3 n o b r e g a p e n n a c c h i o 2 0 0 4 等等 第二節(jié) 基因組細(xì)菌人工染色體 b a c 文庫(kù)研究概述 構(gòu)建高質(zhì)量和大插入片段的基因組d n a 文庫(kù) 是開(kāi)展復(fù)雜真核生物大規(guī)模 物理圖譜 重要功能基因的定位 分離和大規(guī)?；蚪M測(cè)序等研究工作的基礎(chǔ) 也是瀕危物種基因資源離體保護(hù)的主要研究?jī)?nèi)容 b a c 文庫(kù)是在早期的粘粒 c o s m i d 文庫(kù) 噬菌體 f o s m i d 文庫(kù)和y a c 文庫(kù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的 在 早期基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中 研究者大多使用k 噬菌體 c o l l i n s h o h n 1 9 7 8 和柯斯質(zhì)粒 c o s m i d 作為克隆載體 d ej o n ge ta 1 1 9 8 9 由于這兩種克隆載 體的插入片段較小 1 5 4 5 k b 所以 盡管其克隆效率很高 但插入片段過(guò)小和 不穩(wěn)定等特點(diǎn) y o k o b a t ae ta 1 1 9 9 1 k i me t a l 1 9 9 2 卻致使其在大規(guī)模物理圖 譜構(gòu)建 染色體步移和基因組測(cè)序等的研究中的應(yīng)用受到限制 繼后發(fā)明的酵母 人工染色體 y a c 載體 b u r k ee ta 1 1 9 8 7 能夠克隆達(dá)1 m b 的d n a 片段 對(duì) 于構(gòu)建復(fù)雜基因組重疊群及物理圖譜非常有用 然而 由于y a c 系統(tǒng)存在著克 隆效率低 嵌合體比率高 插入片段不穩(wěn)定和提取純化y a cd n a 極為困難等諸 多缺點(diǎn) g r e e ne ta 1 1 9 9 1 k o u p r i n ae ta 1 1 9 9 4 l a f i n o ve ta 1 1 9 9 4 c a ie ta 1 1 9 9 8 w o oe ta 1 1 9 9 4 而使之不太適合于后續(xù)的染色體步移 物理圖譜構(gòu)建和基因組 的測(cè)序研究 繼后 s h i z u y a 等人在質(zhì)粒f 因子的基礎(chǔ)上 構(gòu)建了第一個(gè)細(xì)菌人 工染色體 b a c 載體 s h i z u y a e ta 1 1 9 9 2 以b a c 為載體進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建時(shí)雖然其克隆插入片段 1 0 0 3 5 0k b 較 y a c 要小得多 但其能夠在宿主菌中穩(wěn)定遺傳 且無(wú)缺失 重組和嵌合等現(xiàn)象 同時(shí)其b a cd n a 的提取純化操作簡(jiǎn)單 所以 自該載體被發(fā)明以來(lái)就一直得到 了廣泛的應(yīng)用 c a ie ta 1 1 9 9 5 s u z u k ie ta 1 2 0 0 0 t h o r s e ne la 1 2 0 0 5 1 b a c 文庫(kù)及其載體的發(fā)展 b a c 文庫(kù)構(gòu)建的基礎(chǔ)是e c o l i 中的f 因子 o c o n n o re ta 1 1 9 8 9 研究發(fā) 現(xiàn)f 因子在e c o l i 中的復(fù)制是受到嚴(yán)格控制的 通常只有1 2 個(gè)拷貝 此外 f 因子具有攜帶大插入片段的潛能 插入片段可達(dá)1 0 0 k b h o s o d a e la 1 1 9 9 0 這使 得構(gòu)建大插入片段的基因組b a c 文庫(kù)成為可能 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及l(fā) i 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 0 c o n n o r 等人首次利用f 因子構(gòu)建載體p m b 0 1 3 1 來(lái)克隆大片段的d n a 分子 o c o n n o re ta 1 1 9 8 9 而s h i z u y a 等人則在此基礎(chǔ)上將s p 6 和1 7 啟動(dòng)子序列 九 和p 1 噬菌體的c o s n 和l o x p 位點(diǎn)弓1 k p m b 0 1 3 1 載體 構(gòu)建了第一個(gè)b a c 載體 p b a c l 0 8 l 該載體的插入片段達(dá)3 0 0 k b 以上 且傳代1 0 0 代后仍可穩(wěn)定遺傳 無(wú) 重組和嵌合現(xiàn)象 s h i z u y ae ta 1 1 9 9 2 但是 該載體沒(méi)有重組子選擇標(biāo)記 必 須進(jìn)行雜交驗(yàn)證 于是 s h i z u y a 又將p g e m 3 z 載體上的l a c z 基因插 k p b a c l 0 8 l 載體的多克隆位點(diǎn)上 構(gòu)建了第二代b a c 載體 p b e l o b a c l l 該載體可通過(guò) l a c z 的a 互補(bǔ)所形成的藍(lán)白菌落來(lái)篩選重組子 使得重組子的篩選更趨于直觀 簡(jiǎn)便 k i me ta 1 1 9 9 6 由于p b e l o b a c l l 載體所形成的非重組子的藍(lán)色菌斑沒(méi)有多拷貝載體那么明 顯 新的改進(jìn)型載體p i n d i g o b a c 在p b e l o b a c l l 載體基礎(chǔ)上使得非重組子的藍(lán)白 斑更加明顯 b i l l r e ne ta 1 1 9 9 7 同時(shí) 在多克隆位點(diǎn)引入 極i 酶切位點(diǎn) 還能 夠插入經(jīng) 積i 酶切的d n a 片段 f r i j t e r 等人通過(guò)定點(diǎn)突變方式將p b e l o b a c l l 其 中的一個(gè) o 尺i 酶切位點(diǎn)去掉 構(gòu)建了具一個(gè)e c o r l 克隆位點(diǎn)的p e c b a c l 和 p e c s b a c 4 這既豐富了多克隆位點(diǎn) 又方便了a f l p 和r a c e 片段的克隆 f r i j t e r e ta 1 1 9 9 7 此外 在基因組的部分酶切中 由于e c o r i 署1 e c o r i 甲基化酶的配合 使用能夠得到穩(wěn)定和可重復(fù)的結(jié)果 這就大大提高了b a c 文庫(kù)的構(gòu)建效率和質(zhì) 量 總之 這些d n a 克隆載體在構(gòu)建和發(fā)展的過(guò)程中 其結(jié)構(gòu) 功能和克隆效 率都逐漸得到了完善 并廣泛應(yīng)用于基因組文庫(kù)和物理圖譜構(gòu)建 基因組大規(guī)模 測(cè)序 定位克隆以及重要功能基因等的研究中 2 基因組b a c 文庫(kù)構(gòu)建中的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題 盡管基因組b a c 文庫(kù)的構(gòu)建工作看起來(lái)比較簡(jiǎn)單 但要成功構(gòu)建出高質(zhì)量 大插入片段的基因組文庫(kù)也并非易事 它需要特別就以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟予以高度 重視 2 1 高分子量d n a h m wd n a 的制備 高分子量d n a 的制備是構(gòu)建大插入片段b a c 文庫(kù)并進(jìn)而開(kāi)展復(fù)雜基因組 1 2 浙江人學(xué)博 學(xué)位論文 大熊貓基因組b a c 文庫(kù)及l(fā) l 類m h c 基因組物理圖譜構(gòu)建 研究的關(guān)鍵之一 與傳統(tǒng)的d n a 提取方法不同 要防止高分子量d n a 在制備 過(guò)程中免受剪切等物理?yè)p傷 通常需要將動(dòng)物的組織或細(xì)胞等材料用低熔點(diǎn)瓊脂 糖凝膠 l m p 包埋 形成凝膠塊 p l u g s b l o c k s 或凝膠球 m i c r o b c a d s 以 利于后續(xù)的細(xì)胞裂解和酶切等操作 通常情況下 構(gòu)建真核動(dòng)物的基因組文庫(kù)的材料 應(yīng)來(lái)自單一的動(dòng)物個(gè)體 這樣就避免了由于序列的多態(tài)性而造成在b a cc o n f i g 構(gòu)建和序列的組裝過(guò)程中 出現(xiàn)較大的麻煩 o s o c g a w a d c